Высокомолекулярные соединения (серия Б), 2023, T. 65, № 2, стр. 122-133

ВВЕДЕНИЕ

Разработка и получение новых полимерных защитных покрытий в настоящее время является одной из актуальных научно-практических задач [1–3]. К востребованным материалам такого рода относятся эпоксидные композиции [4, 5]. Они образуют покрытия за счет химических процессов, приводящих к формированию трехмерных полимерных сеток, исключительно устойчивых к негативному воздействию окружающей среды. Для повышения защитных свойств покрытий эпоксидные композиции модифицируют различными соединениями (см., например, работы [6–8]), причем выраженные преимущества имеет модификация реакционноспособными веществами, которые могут химически участвовать в формировании трехмерного полимера. Такой подход позволяет ковалентно зафиксировать модификатор в полимерной сетке и обеспечить его пролонгированное действие.

Серьезной проблемой покрытий, в том числе эпоксидных, эксплуатируемых в контакте с микроорганизмами (в частности, с патогенной микрофлорой), оказывается их ограниченная стойкость к биоповреждению [9–12]. Для улучшения этого показателя применяют различные неорганические и органические добавки, среди которых выделяют реакционноспособные гуанидинсодержащие модификаторы. Гуанидины и их производные характеризуются доказанной антимикробной (антивирусной, спороцидной, фунгицидной), инсектицидной, пестицидной, альгицидной, цитотоксической и противовоспалительной активностью, одновременно воздействуя на аэробную и анаэробную микрофлору [13–18]. Водорастворимые полимерные производные гуанидинов находят широкое применение в качестве действующего вещества в составе многих дезинфицирующих средств, используемых в сельскохозяйственном производстве и медицине [19, 20]. Однако гуанидинсодержащие полимеры, как правило, плохо растворимы в органических средах – эпоксидных составах, что не позволяет вводить их в концентрации, достаточной для обеспечения выраженной биологической активности. Проведенные исследования [21–23], посвященные направленной модификации гуанидинсодержащих олигомеров за счет синтеза солей с различными органическими кислотами, позволили повысить их растворимость в эпокси-аминных системах и получить в результате однородные гомогенные покрытия. Однако полностью отказаться от использования органического растворителя для таких систем не удалось. Иным способом повышения растворимости модификатора в эпокси-аминной системе может быть снижение его молекулярной массы, вплоть до мономера гуанидина. Мономерный гуанидин, имеющий аминогруппы, сам способен химически реагировать с эпоксидными олигомерами, а его производные – органические соли – могут обеспечивать дополнительный биологический эффект за счет наличия остатка органический кислоты. Влияние природы такого остатка на дыхательную активность модельных микроорганизмов было представлено в работе [22].

Среди органических солей олигомерных гуанидинсодержащих модификаторов, синтезированных и исследованных ранее [21–25], наилучший биологический эффект продемонстрировали соли с салициловой кислотой и ее производными. Таким образом, получение новых солей гуанидина, салициловой кислоты и ее производных для направленной ковалентной модификации эпокси-аминных покрытий является важным шагом в разработке эффективных полимерных покрытий с биоцидными свойствами, что и стало целью настоящей работы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве базовых объектов исследования использовали диановый эпоксидный олигомер Epikote 828 (“Hexion”, США) (I), олигооксипропилендиамин Jeffamine D-230 (“Hunstman”, США) (II), а также коммерческие образцы гидрохлорида CAS 113-00-8 (III) и гидрокарбоната CAS 593-85-1 (IV) гуанидина фирмы “Merck”. Для получения других солей гуанидина применяли ароматические кислоты: салициловую (ГОСТ 247783), 4-аминосалициловую CAS 65-49-6 (“Aldrich”) и 5-сульфосалициловую CAS 97-05-2 (“Merck”). Перед проведением экспериментов диановый эпоксидный олигомер выдерживали в течение 3 ч при температуре 60°С для удаления кристаллитов. Некоторые характеристики эпоксидного олигомера и отвердителя представлены в табл. 1:

Синтез производных гуанидина осуществляли из водно-спиртового раствора гидрокарбоната гуанидина IV и эквивалентного количества соответствующей органической кислоты с удалением выделяющегося углекислого газа, а затем, и растворителя из реакционной смеси на вакуумном роторном испарителе. Полное удаление растворителей обеспечивали растиранием твердого остатка и дополнительной сушкой в вакуумном шкафу при остаточном давлении не более 10 торр и температуре до 60°С до постоянной массы. Данные загрузки компонентов для синтеза представлены в табл. 2.

Степень замещения гидрокарбоната на остаток органической кислоты рассчитывали из данных элементного анализа, проведенного на приборе “EA 1112” (“Thermo Finnigan Italia S.P.A.”, Италия) по формуле

где n_теор и n_практ – теоретические и экспериментальные значения мольного содержания элемента.

ИК-спектры синтезированных солей измеряли в режиме НПВО с использованием кристалла ZnSe на спектрометре “Nicolet 6700” (“Thermo Fisher Scientific”, США) в диапазоне волновых чисел 550–4000 см^–1 с разрешением 4 см^–1 и усреднением 64 сканирований. Для приготовления образца порошок соли гуанидина помещали на поверхность кристалла ZnSe так, чтобы полностью ее покрыть, и прижимали штатным прессом.

Изучение теплофизических свойств солей гуанидина, особенностей их взаимодействия с эпоксидным олигомером, а также характеристик отвержденных систем проводили методами дифференциальной сканирующей калориметрии и термического гравиметрического анализа, используя приборы “DSC Q-100” и “TGA Q-500” (“TA Instruments”, США), в динамическом режиме при постоянной скорости нагревания 10 град/мин. Обработку экспериментальных данных выполняли с помощью пакета программ “TA Universal Analysis 2000” (V4.5A). Отверждение композиций вели по оптимальному режиму, разработанному на основании ТТТ-диаграмм для данной эпокси-аминной системы [26, 27].

Биологическую активность отвержденных эпокси-аминных пленок исследовали путем формирования биопленок на поверхности полимера. Для этого применяли диски, вырубленные из исходных и модифицированных пленок. Диски помещали в чашки Петри и вносили инокулят S. еpidermidis 21555 (MRSA) в титре 106 КОЕ/мл, после чего инкубировали в стационарных условиях трое суток при температуре 36°С. Каждые 24 ч удаляли планктон, осторожно промывали физиологическим раствором не менее 3 раз, переносили в новые чашки Петри со свежей средой.

Анализ плотности (биомассы) биопленок (CV-тест) осуществляли окраской генцианвиолетом (0.1%-ный раствор). Диски промывали в физиологическом растворе для удаления не прикрепленных клеток, затем переносили в пробирки. Высушивали при температуре 50°С и вносили краситель до полного погружения дисков. Далее выдерживали 15 мин при комнатной температуре (25°С), удаляли краситель, промывали до получения неокрашенного промывного раствора. Диски сушили, элюировали краситель 70%-ным спиртом в течение 15–20 мин. Окрашенный спиртовой раствор переносили по 100 мкл в лунки планшета для иммунологического исследования. Измерение оптической плотности спиртового раствора выполняли при длине волны 580 нм на планшетном ридере “Bioscreen” с автоматизированной системой (“Labsystems”, Финляндия) с оригинальным программным обеспечением. Влияние концентрации органической соли гуанидина оценивали в процентах ингибирования пленкообразования ${{\gamma }}$ относительно контроля:

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Из коммерчески доступного гидрокарбоната гуанидина синтезированы четыре соли, однако для оценки степени замещения гидрокарбоната на органическую кислоту метод спектроскопии ЯМР, как это было для олигогексаметиленгуанидина [22, 23], не подходит, так как по спектрам ЯМР ¹Н корректно оценить соотношение гуанидин : остаток кислоты не удается из-за обменных процессов протонов гуанидина с остаточными протонами в растворителях (ДМСО-d₆ или D₂O). В случае же спектров ЯМР ¹³С даже в режиме Inverse Gate не удалось задать условия эксперимента, которые давали бы адекватные соотношения интегральных интенсивностей. Поэтому был использован метод элементного анализа. В результате, определены соотношения основных элементов: углерода, водорода и азота, а для сульфосалицилатов – серы (табл. 3). Эти данные сравнивались со значениями, рассчитанными по теоретическим химическим формулам солей, и они оказались очень близки: отклонение не превышало 6%. Таким образом, можно полагать, что получены соли гуанидина и органических кислот с высокой степенью замещения.

Полученные соли изучены методом ИК-спектроскопии. ИК-фурье-спектры солей приведены на рис. 1. Отнесение полос поглощения в спектрах осуществлялось на основании литературных данных [28–31], результаты представлены в табл. 4. Установлено, что измеренные ИК-спектры содержат полосы поглощения, характерные для всех функциональных групп синтезированных солей: гидроксильных, аминных, карбоксильных, в том числе сульфо- и ароматических. Важно, что в спектрах всех синтезированных соединений наблюдаются интенсивные полосы поглощения ν_as и ν_s –СОО^‒. Полосы ν_as и ν_s, соответствующие колебаниям групп –SO₃^‒, зарегистрированы в спектрах гидро-5-сульфосалицилата и дигидро-5-сульфосалицилата. Вместе с тем, в спектрах отсутствуют характерные полосы колебаний неионизированной карбоксильной группы. Присутствие в спектрах всех синтезированных соединений полос гуанидиния I и II также подтверждает их солеобразный характер. Таким образом, результаты спектральных исследований позволяют заключить, что все синтезированные продукты являются солями гуанидина и салициловой кислоты или ее производных.

Методами термоанализа были исследованы соли гуанидинов. На рис. 2 представлены термограммы ТГА, по которым оценены значения температуры деструкции образцов, и термограммы ДСК, показывающие, что синтезированные соли характеризуются не только переходами плавления, но и переходами кристаллизации и стеклования, т.е. являются частично кристаллическими, а не частично аморфными, в отличие от полностью кристаллического гуанидина гидрохлорида. Другими словами, наличие объемного остатка органической кислоты затрудняет кристаллизацию солей гуанидина.

Значения температуры соответствующих переходов приведены в табл. 5. Из таблицы видно, что температура плавления кристаллической части органических солей заметно ниже, чем для гуанидина гидрохлорида и гидрокарбоната, и, так же как температура стеклования, сильно меняется при изменении природы соли. Очевидно, что при наличии полярных сульфо- и аминогрупп межмолекулярные взаимодействия сильнее, обусловливая тем самым более высокие значения температуры переходов. Температура начала деструкции от 140 до 250°С ограничивает последующий температурный режим ковалентного включения синтезированных солей в эпокси-аминные системы. Кроме того, из данных табл. 5 можно заключить, что для дальнейших исследований наиболее интересен гидросалицилат гуанидина, который переходит в жидкое состояние при более низких значениях температуры, при которых будет протекать химическое взаимодействие, и имеет достаточно высокую термостабильность.

Синтезированные и охарактеризованные соли гуанидина были введены в эпокси-аминные смеси. Предварительное изучение растворимости этих солей в эпокси-аминных системах показало, что при введении до 10 мас. % соли гуанидина она не выпадает в осадок, как в среде эпоксидного олигомера, так и среде отвердителя. Наиболее целесообразным способом введения соли в данной работе было ее растворение в амине с последующим добавлением стехиометрического количества эпоксидного олигомера. Необходимо отметить, что при расчете стехиометрии системы следует учитывать реакцию с эпоксидной группой не только протонов гуанидина, но и функциональных групп остатка органической кислоты в соли. Возможность второго процесса была оценена методом ДСК (рис. 3).

Оказалось, что в отсутствии катализаторов заметные химические процессы можно зафиксировать только для сульфосалициловой и, менее выраженно, для салициловой кислоты. Однако такие процессы начинают происходить при температуре 120–150°С (как это и должно быть для ароматических нуклеофилов), и они не могут повлиять на стехиометрию отверждения при более низких значениях температуры (отверждение по ТТТ-диаграммам всегда велось до 100°С).

Далее в работе оценивался экзотермический эффект от химического взаимодействия одной из солей гуанидина – гидросалицилата с эпоксидным олигомером. Для этого были зарегистрированы ДСК-термограммы при разных мольных соотношениях эпоксидной группы и реакционноспособных групп модификатора (рис. 4). Известно, что при прочих равных условиях стехиометрия системы влияет на тепловой эффект реакции, который максимален в случае эквивалентного соотношения компонентов [32]. Концентрационная зависимость теплового эффекта, рассчитанного из термограмм рис. 4, свидетельствует, что максимальное тепловыделение достигается при средней функциональности гидросалицилата равной шести (рис. 5), по-видимому, вступают пять протонов гуанидина и карбоксил салициловой кислоты, причем последний процесс, вероятно, катализируется амином гуанидина. В случае гидросульфосалицилатов и аминосалицилата, очевидно, такие эксперименты проводить нет необходимости – следует учитывать дополнительную функциональность от сульфогруппы и, безусловно, два протона от ароматического амина.

Реальные стехиометрические соотношения для разных солей c эпоксидным олигомером и эпокси-аминной системой представлены в табл. 6. Эти значения позволили получить полностью отвержденные гомогенные прозрачные пленки для последующих испытаний.

Важно, что синтезированные и охарактеризованные в настоящей работе модельные соли дают возможность не только установить участие различных реакционноспособных фрагментов гуанидиновых модификаторов разной молекулярной массы в отверждении эпоксидного олигомера, но и могут быть использованы в качестве самостоятельного модификатора, ковалентно встраивающегося в эпокси-аминную сетку.

Для полученных эпокси-аминных пленок, модифицированных разным количеством салицилатом гуанидина, была оценена биологическая активность по отношению к биопленкам тестовых микроорганизмов. В первичных испытаниях пленки показали выраженную бактериостатическую активность по отношению к эпидермальному стафилококку S. еpidermidis 21555 (MRSE).

Staphylococcus еpidermidis – основной комменсал кожи человека, однако он становится причиной инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. Считается, что S. еpidermidis является одной из наиболее распространенных причин внутрибольничной инфекции, при этом частота инфицирования столь же высока, как и у S. аureus. Из-за склонности к образованию биопленок S. еpidermidis, особенно метициллин-резистентные штаммы, имеет высокий эпидемический потенциал, вызывая тяжелые и сложные для лечения инфекции [33]. Эксперименты показали (рис. 6), что уже при содержании 1 мас. % гидросалицилата гуанидина в пленке значение показателя ингибирования пленкообразования ${{\gamma }}$ составляет 19.2%, а при содержании модификатора 5 мас. % – 43.2% относительно контрольного образца (без модификатора).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе эпокси-аминные системы на основе дианового эпоксидного олигомера и олигомерного аминного отвердителя были модифицированы реакционноспособными производными мономерами на основе гуанидина. Продемонстрирована возможность ковалентного связывания модификатора с формирующейся сеткой, которое обеспечит пролонгированное бактериостатическое действие покрытия. Синтезированы соли гуанидина и органических кислот. Проведена оценка растворимости этих солей в диановом эпоксидном олигомере. Установлено, что замена гидрохлорида на органический остаток заметно снижает температуру начала реакции с эпоксидным олигомером. Также определена средняя функциональность солей гуанидина в реакции с эпоксидным олигомером и показано, что в реакцию вступает большинство групп N‒Н модификаторов. Так, в ряде случаев в химическом взаимодействии участвуют остатки органических солей. Определена стехиометрия бинарных систем гуанидин : эпоксидный олигомер, а также стехиометрия полученных аддуктов с олигомерным аминным отвердителем. Отмечено, что предложенным способом возможно вводить до 10 мас. % соли, причем наиболее целесообразным способом является растворение соли гуанидина в амине с последующим добавлением стехиометрического количества эпоксидного олигомера. Полученные пленки в первичных испытаниях продемонстрировали выраженную бактериостатическую активность по отношению к метициллин-резистентному S.еpidermidis.

Таким образом, направленная модификация гуанидинсодержащих соединений и оптимизация способов их введения в эпокси-аминные составы, а также формирования готовых покрытий позволяет получать новые материалы с выраженным антимикробным действием, не опасные для человека и животных. Такие материалы будут востребованы в учреждениях медицинского, фармацевтического и пищевого профиля.

Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП Института физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН и ЦКП РТУ МИРЭА, получившего поддержку Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения от 01.09.2021 №075-15-2021-689.