Высокомолекулярные соединения (серия Б), 2023, T. 65, № 2, стр. 117-121

Респираторные вирусные инфекции остаются важной проблемой здравоохранения, несмотря на значительные достижения вакцинотерапии. Появление устойчивых к вакцинам штаммов происходит очень быстро. Кроме того, транспортировка и хранение вакцин требует соблюдения жесткого температурного режима. В условиях сезонных респираторных вирусных инфекций особенно актуальна потребность в новых эффективных средствах противовирусной химиотерапии. Решение этой задачи заключается в поиске и разработке новых низкотоксичных противовирусных средств широкого спектра действия. Среди перспективного класса противовирусных веществ особый интерес представляют высокомолекулярные соединения. Еще в середине ХХ века было найдено, что некоторые водорастворимые синтетические полимеры обладают противовирусной активностью: анионные полиэлектролиты, полиакриловая и полиметакриловая кислоты, сополимеры малеинового ангидрида, полимерные производные п-аминосалициловой кислоты, полимеры, содержащие сульфо- и фосфатные группы [1–7]. Высокую противовирусную активность демонстрируют и природные полимеры – сульфаты и фосфаты полисахаридов [8, 9]. Их активность обусловлена способностью блокировать взаимодействие вирусов с клеткой “хозяина”, индуцировать выработку организмом интерферона, активировать макрофаги и стимулировать выработку неспецифической резистентности организма к внешним инфекциям. Среди большого числа различных полианионов наиболее подробно изучен полистиролсульфонат [9, 10], действующий на респираторные вирусы. Он особенно активен как анти-ВИЧ агент, обладает широким спектром действия против заболеваний, передающихся половым путем. Модификация полистиролсульфоната путем введения в его структуру звеньев иного строения представляет интерес с целью установления влияния химического строения сополимера на противовирусную активность и поиска новых полимеров с улучшенным спектром действия и более высокой активностью.

Цель настоящей работы заключалась в модификации полистиролсульфоната путем сополимеризации стиролсульфоната натрия (М₁) с нейтральным гидрофильным мономером 2-деокси-2-метакриламидо-D-глюкозой (М₂), синтезе новых сополимеров различного состава и варьируемой молекулярной массой, а также исследовании их противовирусной активности и цитотоксичности.

В работе использовали стиролсульфонат натрия (CC-Na) – фирмы “Aldrich” (Германия). Инициатор 2.2-азо-бис-метилпропионамидиндигидрохлорид (МПХ) фирмы “Aldrich” (Германия).

Мономер 2-деокси-2-метакриламидо-D-глюкоза (МАГ) получали по известному методу Кляйна [11] ацилированием глюкозамина солянокислого метакрилоилхлоридом в присутствии триэтиламина. После его перекристаллизации Т_пл = 197–198°С, что соответствует литературным данным.

Сополимеры CC-Na–МАГ с разным мольным соотношением и молекулярной массой синтезировали свободнорадикальной полимеризацией в воде, применяя водорастворимый инициатор МПХ, в атмосфере аргона и запаянных ампулах при температуре 60°С в течение 1 суток. Сополимеры очищали от низкомолекулярных компонентов диализом против воды с использованием полупроницаемой мембраны фирмы “Биолот” (предел пропускания 1 кДа) и выделяли путем лиофильной сушки. Условия сополимеризации и характеристики полученных сополимеров CC-Na–МАГ представлены в табл. 1.

Характеристическую вязкость определяли при 25°С в 0.2 М NaCl на вискозиметре Уббелоде. Диапазон молекулярной массы сополимеров находили по уравнению Марка–Куна–Хаувинка для полистиролсульфоната натрия (ПСС-Na) в 0.2 М NaCl при 25°С: [η] = 1.17 × 10^–2 × М^{0.69 ± 0.06} см³/г [12].

Для оценки относительной активности СС-Na и МАГ сополиметизацию проводили до степени превращения 10 мас. % при исходном мольном соотношении сомономеров от 90 : 10 до 10 : 90. При вычислении относительной активности сомономеров использовали математическую обработку экспериментальных данных с помощью метода Файнемана–Росса [13]. На рис. 1 представлена зависимость состава сополимеров СС-Na и МАГ от состава исходной смеси сомономеров. Для СС-Na значение r₁ составило 1.58 ± 0.05, для МАГ величина r₂ = 0.18 ± 0.01. Значения r₁ и r₂  указывают на более высокую реакционную способность СС-Na. Полученые сополимеры обогащены звеньями СС-Na.

Рис. 1.

Диаграмма составов сополимеризации СС-Na–МАГ. m₂ – мольная доля МАГ в сополимере, М₂ – мольная доля МАГ в смеси мономеров.

Состав сополимеров определяли с помощью УФ-спектроскопии при длине волны 260 нм на приборе “SHIMADZU UV-1280”. ИК-спектры регистрировали на спектрометре фирмы “SHIMADZU” “IRAFFINITY-1S” в таблетках KBr (рис. 2). В спектрах сополимеров ССNa–МАГ имеются полосы, характерные для обоих типов звеньев. О наличии звеньев СС-Na судили по поглощению при ~1450–1580 см^–1, соответствующему бензольному кольцу. В спектрах сополимеров присутствуют полосы поглощения, относящиеся к звеньям S=О (1050–1200 см^–1). Звеньям МАГ соответствуют полосы колебаний групп CH₃- и CH₂- при 2900 и 1550 см^–1. Имеются также полосы Амид I (1650 см^–1) и Амид II (1524 см^–1); колебаниям пиранозного кольца отвечает полоса 1000 см^–1.

Рис. 2.

ИК-спектр сополимера СС-Na–МАГ состава 49 : 51 мол. %.

Строение сополимеров подтверждали дополнительно методом спектроскопии ЯМР ¹Н (400 МГц, D₂O). В спектрах сополимеров наблюдаются сигналы протонов гликозильного кольца звеньев МАГ (δ_Н = 0.9–2.0, 3.3–3.8, 4.6–5.2 м.д.), а также сигнал протонов бензольного кольца δ_Н = = 7.4 м.д.

Для определения цитотоксичности и противовирусной активности брали клеточную культуру НЕр-2, эпидермоидную карциному гортани человека, коллекции клеточных культур ФГБУ “НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева”. В работе использовали респираторно-синцитиальный вирус человека штамм А2, полученный из лаборатории биотехнологии диагностических препаратов, далее накопленный на культуре клеток HEp-2, его хранили при температуре –80°С. Показатель цитотоксичности (ЦТД₅₀) полимеров оценивали по жизнеспособности клеток при помощи микротетразолиевого теста [14]. Противовирусную активность определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Готовили серию трехкратных разведений полимеров [15]. Критерием оценки противовирусной активности является статистически значимое снижение титра вируса в клетках при применениии полимера по сравнению с контролем. На основании этих данных производили расчет ЭД₅₀. Чтобы оценить перспективность применения сополимеров, в качестве противовирусного средства использовали такой показатель, как химиотерапевтический индекс, равный отношению значений ЦТД₅₀ к ЭД₅₀. Вещества, имеющие химиотерапевтический индекс более 8, считались перспективными.

Из представленной табл. 2 следует, что гомополимер CC-Na и все синтезированные сополимеры проявляют высокую противовирусную активность, их цитотоксичность и активность зависят от состава сополимера и понижаются при повышении содержания звеньев винилсахарида. Сополимеры с составом CC-Na–МАГ, равным 71–29 и 66–34 мол. %, имеющие наиболее высокий химиотерапевтический индекс по сравнению с гомополимером, представляют интерес для дальнейшего углубленного изучения.

Таким образом, в работе исследована радикальная сополимеризация стиролсульфоната натрия с метакриламидоглюкозой в воде, определены константы относительной активности сомономеров, синтезированы сополимеры разного состава с варьируемой молекулярной массой. Установлена их высокая противовирусная активность в отношении респираторного-синцитиального вируса человека.

Авторы выражают благодарность В.В. Глебенковой, принимавшей участие в экспериментальной части работы.

Работа выполнена по госзаданию, химическая часть – регистрационный номер проекта 122012100171-8, биологические эксперименты – регистрационный номер проекта НИОКТР в ЕГИСУ НИОКТР 121051900142-0 “Генетическая и антигенная вариабельность современных штаммов респираторно-синцитиальных вирусов (РСВ), циркулирующих на территории Российской Федерации”.