Химия высоких энергий, 2019, T. 53, № 4, стр. 294-302

ВВЕДЕНИЕ

Являясь аналогом глюкозы – важнейшего энергетического метаболита человека, 2-[¹⁸F]фтор-2-дезокси-D-глюкоза ([¹⁸F]ФДГ) интенсивно применяется для диагностики онкологических, кардиологических и неврологических заболеваний методом позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) [1, 2]. В настоящее время с ее использованием выполняется порядка 70% ПЭТ-исследований, объемы производства [¹⁸F]ФДГ продолжают расти, причем наиболее активно – в развивающихся странах [3].

Отличительной особенностью радиофармацевтических препаратов (РФП) от нерадиоактивных лекарственных средств является авторадиолиз – радиационно-индуцированное разложение меченого соединения при хранении под действием собственного излучения радионуклида, входящего в состав. В результате авторадиолитических превращений происходит снижение радиохимической чистоты РФП – доли активности диагностического агента от общей активности препарата. Накопление примесей, которые отличаются по фармакокинетике от действующего вещества, приводит к ухудшению коэффициентов распределения радиоактивной метки между очагами патофизиологических процессов и здоровыми тканями. Как следствие, снижаются соотношения сигнал/шум на ПЭТ-томограмме, а дозовая нагрузка на пациентов при выполнении диагностических исследований, напротив, увеличивается [4].

Ранее было показано [5, 6], что при хранении [¹⁸F]ФДГ в радиофармацевтическом лекарственном средстве происходит интенсивное накопление остеотропного [¹⁸F]фторида, что приводит к интенсивному облучению красного костного мозга – наиболее критичного с точки зрения радиобиологии органа-мишени. Авторадиолиз [¹⁸F]ФДГ сокращает срок годности препарата до нескольких часов, затрудняет диагностическое применение РФП и его доставку из мест централизованного производства в отдаленные клиники [5]. Это указывает на необходимость изучения закономерностей авторадиолитических превращений [¹⁸F]ФДГ и поиска ингибиторов данного нежелательного процесса.

В настоящей работе исследована динамика изменения радиохимической чистоты и доли активности [¹⁸F]фторида в РФП “2-[¹⁸F]фтордезоксиглюкоза” с начальными объемными активностями 1–2 ГБк/мл в насыщенном воздухом физиологическом растворе.

МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

В работе без предварительной очистки использовали следующие коммерчески доступные реагенты – этанол, ацетонитрил, натрия [¹⁹F]фторид, 50% NaOH в воде (Sigma-Aldrich, США); 2‑[¹⁹F]фтор-2-дезокси-D-глюкозу ([¹⁹F]ФДГ), 2‑[¹⁹F]фтор-2-дезокси-D-маннозу ([¹⁹F]ФДМ), 1,2,3,5-тетра-О-ацетил-D-глюкозу (ABX, Германия). Ультрачистую воду с удельным сопротивлением не менее 15 МОм получали с использованием Milli-Q (Millipore, США).

Для исследования авторадиолитического разложения использовали инъекционное лекарственное средство “2-[¹⁸F]фтордезоксиглюкоза” для ПЭТ-диагностики, полученное по стандартной технологии [7] на кассетных модулях Synthera (IBA, Бельгия) с использованием наборов реагентов для производства [¹⁸F]ФДГ фирмы ABX (Германия). Контроль качества готового лекарственного средства осуществляли в соответствии с требованиями соответствующей статьи государственной фармакопеи Республики Беларусь, гармонизированной с европейской фармакопеей [8]. Для снижения дозовых нагрузок персонала и улучшения коэффициента разделения компонентов растворы РФП непосредственно перед измерениями разбавляли в 5 раз.

Для определения активности [¹⁸F]фторида и радиохимической чистоты препарата использовали две независимые фармакопейные методики: радио-ТСХ и радио-ВЭЖХ. Первая позволяет разделить с использованием силикагелевых пластин (Merck) [¹⁸F]фторид (R_f = 0), сумму [¹⁸F]ФДГ + + [¹⁸F]ФДМ (R_f = 0.4–0.5) и частично ацилированные аналоги [¹⁸F]ФДГ (R_f ~ 0.8). В качестве подвижной фазы использовали систему вода/ацетонитрил 5/95 (об./об.). Раствор РФП объемом 0.1 мкл наносили на линию старта. Пластинку высушивали на воздухе в течение 1 мин и помещали в резервуар с подвижной фазой. По достижению фронтом элюента линии финиша высушивали пластину промышленным феном при температуре 50°С в течение минуты для исключения размывания пиков и фиксации радиоактивных веществ. Счет импульсов от линии старта до финиша (соответственно 0.1 и 0.9 от высоты пластины) осуществляли с использованием автоматического сцинтилляционного сканера miniGita (Raytest, Германия).

Подлинность и радиохимическую чистоту РФП определяли методом ионообменной радио-ВЭЖХ на Agilent 1260 с колонкой Dionex CarboPac PA10 Analyticlal (длинна 0.25 м, диаметр 4 мм, зерно 10 мкм) и предколонкой Dionex CarboPac PA10 Guard. Для приготовления подвижной фазы: 4 г/л NaOH в воде – использовали 50% раствор щелочи без карбоната и дегазированную ультразвуком при нагревании воду. Время выхода радиоактивных веществ определяли с использованием их стабильных копий и рефрактометрического детектора Agilent G1362A, последовательно соединенного капилляром с откалиброванным объемом с проточным детектором по радиоактивности Gabi (Raytest, Германия). Скорость потока – 1 мл/мин, температура колонки составляла 30°С, объем вводимой пробы – 20 мкл. Раствор РФП объемом 30 мкл с помощью хроматографического шприца на 50 мкл вводили в дозирующую петлю инжектора. Время выхода [¹⁸F]ФДГ + + [¹⁸F]ФДМ составляло 9.50–10.15 мин в зависимости от ионообменной емкости колонки.

Содержание остаточных растворителей: этанола, ацетонитрила – определяли методом газовой хроматографии на Agilent 6850 с пламенно-ионизационным детектором аналогично [9]. Температура инжектора и детектора – 250°С, поток газа-носителя – 3 мл/мин. Ввод пробы РФП объемом 1 мкл осуществляли с помощью автоинъектора.

Для изучения динамики изменения радиохимической чистоты препарата и накопления свободного [¹⁸F]фторида при хранении фасовали по 1.5 мл РФП во флаконы объемом 15 мл, после чего их укупоривали бутилкаучуковой пробкой и обжимали алюминиевой крышкой. Полный контроль качества проводили на протяжении 8 ч (назначенный срок хранения) с двухчасовыми интервалами.

При проведении исследований в лаборатории поддерживали постоянный температурный режим – 25 ± 2°С. Для изучения стабильности РФП в условиях “ускоренного старения” защитные свинцовые контейнеры CF18 Pb (Comecer, Италия) термостатировали 1 ч при 40 ± 1°С до загрузки флакона с РФП и потом на протяжении всего срока хранения. За 5 мин до проведения испытаний пробу охлаждали путем перемещения в идентичный свинцовый контейнер, термостатированный при 25°С, после чего флакон вскрывали.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Интенсивность авторадиолитического разложения радиофармпрепарата [¹⁸F]ФДГ во время хранения будет в значительной мере определяться величиной поглощенной раствором дозы. Эту величину можно оценить расчетным путем, поскольку использование стандартных методов химической дозиметрии для радиофармпрепаратов затруднительно. Согласно данным работы [6], раствор [¹⁸F]ФДГ с объемной активностью 1 ГБк/мл при полном распаде радионуклида получит поглощенную дозу в 405 Гр, из которых 368 Гр формируется при термализации позитрона, а 37 Гр – за счет анигиляционного фотонного излучения.

При рассмотрении возможных радиационно-химических процессов под действием невысоких (по меркам радиационной химии органических соединений) поглощенных доз необходимо принимать во внимание то, что раствор с рассматриваемой объемной активностью будет содержать всего 2.87 × 10^–9 г/мл или 15.8 × 10^–9 моль/л [¹⁸F]ФДГ. Несложные расчеты показывают, что при распаде одного атома ¹⁸F в водном растворе образуется примерно 7200 •ОН и столько же ${\text{e}}_{{{\text{aq}}}}^{ - }.$

Для фармакопейного анализа радиофармпрепарата [¹⁸F]ФДГ традиционно используются методы радио-ВЭЖХ и радио-ТСХ. В соответствии со статьей 01/2014:1325 европейской фармакопеи [8] и, созданному на ее основе разделу государственной фармакопеи Республики Беларусь, радио-ТСХ используется для определения доли активности (%) [¹⁸F]фторида от общей активности радионуклида ¹⁸F в препарате. Оба хроматографических метода используются для определения подлинности лекарственного средства и определения его радиохимической чистоты – доли активности ¹⁸F, которая приходится на основное вещество ([¹⁸F]ФДГ) от общей активности ¹⁸F в радиофармпрепарате.

Типичная хроматограмма радио-ТСХ представлена на рис. 1. В условиях анализа [¹⁸F]ФДГ и [¹⁸F]ФДМ не разделяются и имеют одинаковый коэффициент удерживания R_f – примерно 0.45. [¹⁸F]Фторид в условиях анализа не движется по ТСХ-пластине и остается на линии старта. В процессе синтеза из-за неполного гидролиза иногда могут оставаться незначительные количества частично ацилированной [¹⁸F]ФДГ с R_f в диапазоне от 0.8 до 0.95. Другие радиоактивные вещества на радио-ТСХ хроматограмме не проявлялись ни по окончании синтеза, ни в процессе хранения радиофармацевтического препарата.

Рис. 1.

Радио-ТСХ хроматограмма радиофармпрепарата [¹⁸F]ФДГ с относительной активностью [¹⁸F]фторида 1.4%.

При анализе радиофармацевтического препарата [¹⁸F]ФДГ методом радио-ВЭЖХ перечень идентифицируемых веществ значительно шире. На рефрактометрическом детекторе (рис. 2а), используемом для определения времени выхода стандартов “холодных” (нерадиоактивных) фторированных сахаров [¹⁹F]ФДГ и [¹⁹F]ФДМ, а также [¹⁹F]фторида, присутствует только пик глюкозы. Это продукт щелочного гидролиза 1,3,4,6-тетра-О-ацетил-2-О-трифлата маннозы – предшественника, используемого для синтеза [¹⁸F]ФДГ.

Рис. 2.

Радио-ВЭЖХ хроматограмма радиофармпрепарата [¹⁸F]ФДГ с радиохимической чистотой 98.87% и относительной активностью [¹⁸F]фторида 0.87%; а – рефрактометр, б – сцинтилляционный детектор.

С использованием детектора по радиоактивности (рис. 2б) регистрируются 3 примеси и основной пик со временем выхода 9.50–10.15 мин (в зависимости от анионообменной емкости колонки), который принадлежит [¹⁸F]ФДГ. На левом фронте пика основного вещества выходит [¹⁸F]ФДМ, как правило, на нее приходится 2–7% от общей активности препарата. [¹⁸F]ФДМ образуется в ходе синтеза и учитывается вместе с [¹⁸F]ФДГ при расчете радиохимической чистоты.

Детектируемые методом радио-ВЭЖХ радиохимические примеси, как правило, имеют долю в 0.1–1.0% от общей активности препарата на момент выпуска партии лекарственного средства. При этом относительная активность второй из них увеличивается по мере хранения радиофармпрепарата. С использованием метода “подсадки” (введения в пробу предполагаемого вещества) было показано, что пик со временем выхода 5.55–6.05 мин (на детекторе по радиоактивности) соответствует [¹⁸F]фториду. На рефрактометре нерадиоактивный фторид [¹⁹F]F^– имеет идентичное время выхода с учетом длины капилляра между детекторами и скорости потока элюента. С учетом того, что пики других радиоактивных примесей не накладываются на [¹⁸F]F^-, используемый для определения подлинности лекарственного средства и его радиохимической чистоты метод радио-ВЭЖХ можно применять в качестве вспомогательного способа определения содержания [¹⁸F]фторида в радиофармпрепарате [¹⁸F]ФДГ.

Примеси со временами выхода 4.15–4.25 (соединение 1) и 6.40–6.55 (соединение 3) присутствуют в лекарственном средстве сразу по окончании синтеза и практически не изменяют величину своей относительной активности в процессе хранения. В частности, например, на соединение 3 обычно приходится около 0.20% от активности радиофармпрепарата (рис. 3). Тот факт, что данные примеси регистрируются и спустя 6–8 ч, поле синтеза, однозначно, указывает на присутствие в их составе ¹⁸F (T_1/2 = 110 мин). Другие примесные радионуклиды, которые могут нарабатываться на циклотроне при облучении воды [¹⁸O]H₂O, имеют периоды полураспада всего 10 и 20 мин (соответственно для ¹³N и ¹¹C).

Рис. 3.

Динамика изменения относительной активности радиохимических примесей в радиофармпрепарате [¹⁸F]ФДГ при хранении по данным радио-ВЭЖХ. Начальная активность 1915 МБк/мл.

Представленный на рис. 3 характер изменения относительной активности радиохимических примесей в радиофармпрепарате [¹⁸F]ФДГ может свидетельствовать о том, что соединения 1 и 3 образовались в процессе синтеза активной фармацевтической субстанции. Таким образом, единственным регистрируемым радиоактивным продуктом авторадиолитических превращений радиофармпрепарата [¹⁸F]ФДГ является [¹⁸F]фторид.

Закономерности изменения доли [¹⁸F]F^- при хранении от общей активности радионуклида ¹⁸F в радиофармпрепарате [¹⁸F]ФДГ с начальными объемными активностями 780–1200 МБк/мл представлены на рис. 4, с начальными объемными активностями 1715–2080 МБк/мл – на рис. 5. Доля активности фторида в препарате на момент окончания синтеза (EOS) колебалась в диапазоне от 0.15 до 0.42%. Что может быть связано, как с неполной очисткой [¹⁸F]ФДГ от сырьевого радионуклида на картридже твердофазной экстракции Alumina B (Waters, США) после синтеза, так и активным протеканием авторадиолиза фармацевтической субстанции после синтеза и до ее разведения изотоническим раствором NaCl, когда объемная активность может достигать 17 000 МБк/мл. Незначительное количество [¹⁸F]фторида может также образовываться за время, которое проходит после укупорки радиофармпрепарата во флаконе (время фасовки) и до вскрытия пробы в лаборатории контроля качества.

Рис. 4.

Изменение относительной активности [¹⁸F]фторида при хранении растворов радиофармпрепарата [¹⁸F]ФДГ с начальной объемной активностью порядка 1 ГБк/мл; а – данные радио-ТСХ, б – данные радио-ВЭЖХ

Рис. 5.

Изменение относительной активности [¹⁸F]фторида при хранении растворов радиофармпрепарата [¹⁸F]ФДГ с начальной объемной активностью порядка 2 ГБк/мл; а – данные радио-ТСХ, б – данные радио-ВЭЖХ.

При сопоставлении рис. 4 и 5 становится очевидно, что значения относительной активности [¹⁸F]фторида в радиофармпрепарате, измеренные методом радио-ВЭЖХ, примерно на 30–50% выше, чем соответствующие величины, определенные посредством радио-ТСХ. Но при этом характер наблюдаемых закономерностей не изменяется при переходе от одного хроматографического метода к другому. По нашему мнению, такие различия в измеренных значениях могут быть связаны с условиями регистрации излучения радиоактивного изотопа.

Необходимо также отметить значительно более низкое соотношение сигнал–шум в случае радио-ТСХ, что зачастую осложняет обсчет низких или вовсе следовых количеств [¹⁸F]фторида. Тем не менее, именно этот метод является арбитражным и используется для определения относительной активности [¹⁸F]фторида в радиофармацевтическом препарате [¹⁸F]ФДГ в соответствии с требованиями фармакопеи [8].

Сопоставление профилей изменения относительной активности [¹⁸F]фторида при хранении радиофармацевтического препарата [¹⁸F]ФДГ (рис. 4, 5) позволяет выявить следующие закономерности. Увеличение начальной объемной активности раствора [¹⁸F]ФДГ c 1 до 2 ГБк/мл приводит к возрастанию регистрируемых значений относительной активности [¹⁸F]фторида, что свидетельствует об интенсификации авторадиолитического разложения радиофармацевтического препарата. Наблюдаемый эффект может быть одновременно связан с увеличением как концентрации радиолизуемого вещества, так и поглощенной раствором дозы.

Однако изменение относительной активности [¹⁸F]фторида не происходит пропорционально возрастанию начальной объемной активности раствора [¹⁸F]ФДГ. К тому же в пределах рассматриваемых диапазонов 780–1200 и 1715–2080 МБк/мл видно, что концентрация радиоактивного вещества не является единственным фактором, определяющим скорость авторадиолитического разложения [¹⁸F]ФДГ. Анализ химического состава радиофармацевтического препарата позволяет проследить зависимость интенсивности прироста относительной активности [¹⁸F]фторида при хранении от концентрации остаточных растворителей, в первую очередь этанола (табл. 1). С увеличением его концентрации происходит снижение интенсивности авторадиолитического разложения [¹⁸F]ФДГ.

Этанол широко используется в процессе радиофармацевтического производства [¹⁸F]ФДГ. В частности, перед синтезом картридж твердофазной экстракции C₁₈ (Waters, США) кондиционируется 96% раствором этанола. Этот растворитель входит в состав щелочного реагента для гидролиза (1 M NaOH), а также применяется для обеспечения асептики производства при ежедневной обработке модуля синтеза, линий трансфера активности и камеры фасовки.

При хранении радиофармпрепарата [¹⁸F]ФДГ наблюдается снижение концентрации этанола, например, для раствора с начальной объемной активностью 1150 МБк/мл за 8 ч хранения содержание этанола падает с 350 × 10^–6 до 274 × 10^–6 моль/литр. Необходимо отметить, что концентрация спирта в данном случае на 4 порядка больше, чем меченого соединения. Поэтому ингибирование авторадиолитического разложения [¹⁸F]ФДГ вероятно происходит за счет того, что этанол (или продукты его радиолиза) выигрывает конкуренцию у [¹⁸F]ФДГ за радикальные продукты радиолиза воды.

Одним из стандартных тестов для изучения свойств лекарственных препаратов является исследование стабильности “в условиях ускоренного старения” при повышенной температуре хранения. Приведенные в табл. 2 результаты свидетельствуют о том, что увеличение температуры хранения радиофармацевтического препарата с 25 до 40°С не приводит к интенсификации авторадиолитического разложения [¹⁸F]ФДГ.

Необходимо отметить, что вне зависимости от концентрации этанола и температуры хранения для всех исследованных в работе образцов радиофармацевтического препарата [¹⁸F]ФДГ относительная активность [¹⁸F]фторида по истечении 8 ч с момента выпуска партии с запасом не превышала предельного значения в 5%, установленного фармакопеей [8]. Таким образом, при выполнении настоящего исследования было получено экспериментальное подтверждение соответствия параметров качества лекарственного средства [¹⁸F]ФДГ с начальными объемными активностями порядка 1–2 ГБк/мл требованиям соответствующей фармакопейной статьи по радиохимической чистоте на протяжении заявленного восьмичасового срока хранения.

Для того, чтобы выразить интенсивность разложения радиофармацевтического препарата [¹⁸F]ФДГ под действием собственного излучения в более привычных для радиационной химии величинах, можно оценить радиационно-химический выход образования [¹⁸F]фторида. Мы использовали методологию расчета поглощенной раствором [¹⁸F]ФДГ дозы, приведенную в работе [6]. Концентрацию ионов [¹⁸F]фторида, образовавшихся в растворе, определяли как произведение начальной концентрации [¹⁸F]ФДГ на относительную активность [¹⁸F]фторида на момент окончания восьмичасового срока хранения, что позволило не учитывать фактор радиоактивного распада [¹⁸F]фторида при расчете. Полученные таким образом значения радиационно-химического выхода образования [¹⁸F]фторида составляли 2.8–3.2 × 10^–6 ионов/100 эВ для растворов с начальными объемными активностями в диапазоне 780–1200 МБк/мл и 3.0–5.4 × 10^–6 ионов/100 эВ – соответственно для 1715–2080 МБк/мл.

По нашему мнению, крайне низкие по меркам классической радиационной химии величины G([¹⁸F]F^–) обусловлены наномолярными концентрациями [¹⁸F]ФДГ в растворе. В этих условиях образующиеся при распаде нуклида ¹⁸F радикальные продукты радиолиза воды будут преимущественно рекомбинировать межу собой и вступать в радикал-молекулярные реакции с остаточными растворителями, глюкозой и другими соединениями, присутствующими в микро- и милимолярных концентрациях в фармацевтической субстанции.

В заключение рассмотрим возможные механизмы радиационно-индуцированного элиминирования [¹⁸F]фторида. Несмотря на колоссальные объемы мирового производства радиофармацевтического препарата [¹⁸F]ФДГ, механизм ее радиационно-индуцированного дегалогенирования до настоящего момента не установлен. Отдельные молекулярные продукты авторадиолитических превращений радиофармацевтического препарата [¹⁸F]ФДГ были идентифицированы с использованием хромато-масс-спектрометрии [10]. Однако, по мнению авторов исследования, обнаруженные соединения могли образоваться как из глюкозы, так и из ее фторированного производного.

Общеизвестно, что галогеналифатические соединения (в том числе фторорганические) в водных растворах имеют высокие константы скорости реакции с сольватированным электроном [11]. Образующиеся в реакции (2) анион-радикалы хлор-, бром- и особенно йодорганических соединений быстро элиминируют соответствующие анионы. При анализе литературных данных нам не удалось найти подтверждений реализации реакции, аналогичной (3), для анион-радикалов фторалифатических соединений.

(1)

(2)

(3)

В монографии [12] было показано, что взаимодействие •ОН и •Н радикалов с 1-хлор-2-гидроксиэтаном, 1-хлор-2,3-дигидроксипропаном и 2-бром-3-гидроксибутаном приводит к образованию α-гидроксилсодержащих углеродцентрированных радикалов, элиминирующих галогеноводород по следующим реакциям:

(4)

(5)

Способность [¹⁸F]ФДГ элиминировать [¹⁸F]HF по реакции, аналогичной (5), также является открытым вопросом. Исследование механизма авторадиолитического дегалогенирования [¹⁸F]ФДГ в водных растворах будет предметом наших последующих публикаций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе изучена кинетика авторадиолитического разложения радиофармацевтического препарата [¹⁸F]ФДГ в насыщенных воздухом водных растворах с начальными объемными активностями в диапазоне от 780 до 2080 МБк/мл. Показано, что используемый для определения подлинности лекарственного средства и его радиохимической чистоты метод радио-ВЭЖХ можно применять в качестве вспомогательного способа определения содержания [¹⁸F]фторида в радиофармпрепарате [¹⁸F]ФДГ. Установлено, что единственным регистрируемым радиоактивным продуктом авторадиолитических превращений радиофармпрепарата [¹⁸F]ФДГ является [¹⁸F]фторид, доля активности которого в радиофармпрепарате увеличивается по мере хранения. Показано, что увеличение начальной объемной активности радиофармпрепарата или снижение концентрации этанола в нем приводят к ускорению авторадиолитического разложения [¹⁸F]ФДГ. Повышение температуры хранения растворов с 25 до 40°С не приводит к интенсификации радиационно-индуцированного разложения [¹⁸F]ФДГ. Получено экспериментальное подтверждение соответствия радиохимической чистоты препарата [¹⁸F]ФДГ с начальными объемными активностями порядка 1–2 ГБк/мл требованиям статьи 01/2014:1325 европейской фармакопеи на протяжении восьмичасового срока хранения.

Авторы выражают благодарность Баскаловой Юлии Олеговне за помощь в изучении радиохимической чистоты радиофармацевтического препарата [¹⁸F]ФДГ.