Физикохимия поверхности и защита материалов, 2021, T. 57, № 6, стр. 581-587

ВВЕДЕНИЕ

Модифицирование поверхности пористых углеродных материалов биологически активными веществами (полимеры, белки, аминокислоты, гидроксикислоты и т.д.) относится к ключевым способам получения новых сорбентов медицинского назначения [1–4]. В результате модифицирования расширяются спектр и эффективность применения углеродных сорбентов. Разнообразие и сочетание биоспецифических свойств модификаторов позволяет получать сорбенты комплексного действия [5–7].

Известны исследования по синтезу композитов полимолочная кислота – углеродные наноматериалы (углеродные нанотрубки, материалы на основе графена) для медицинских целей полимеризацией in situ. Метод включает смешивание углеродного наноматериала с чистым мономером или раствором мономера в присутствии катализаторов и последующей поликонденсацией [8]. Отечественными учеными ведутся исследования о возможности применения природных биологически активных веществ (бетулин) как компонентов материалов медицинского применения. Установлено, что иммобилизация бетулина в структуре материала повышает эффективность его применения и расширяет спектр действия [9]. Китайскими учеными разработаны пористые микрочастицы, содержащие лизоцим и полимолочную кислоту в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний легких [10].

В ЦНХТ ИК СО РАН разработаны методики синтеза гранулированных углеродных сорбентов медицинского и ветеринарного назначений, модифицированных олигомерами молочной кислоты, поливинилпирролидоном и бетулином [11, 12]. Продолжаются исследования по модифицированию углеродной поверхности комплексами биологически активных веществ (поливинилпирролидон-бетулин, молочная кислота-лизоцим) [13].

В рамках данной работы изучены физико-химические и медико-биологические свойства углеродных сорбентов, модифицированных композициями молочной кислотой с лизоцимом, и N-винилпирролидона с бетулином. Дана оценка перспективам их применения в лечебной практике.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве исходного образца использовался гранулированный мезопористый углеродный сорбент (УС) с удельной площадью поверхности 300–400 м²/г (ЦНХТ ИК СО РАН, Россия). Для модифицирования использовали молочную кислоту (МОСРЕАКТИВ, Россия), лизоцим (“Sigma-Aldrich”, Германия), N-винилпирролидон (“Merck”, Германия) и бетулин (ФГБУН Институт химии и химической технологии СО РАН, г. Красноярск).

Получение сорбента, модифицированного молочной кислотой (УС-МК-ЛИЗ), включало в себя пропитку гранул углеродного сорбента 50 мас. % водным раствором молочной кислоты при массовом соотношении сорбент : раствор модификатора 1 : 1 с последующей сушкой при температуре не выше 185°С в течении суток. Дополнительное модифицирование проводят 1 мас. % раствором лизоцима в ацетатном буфере (рН 7.4) при температуре 4°С и массовом соотношении сорбент : раствор 1 : 1.

Модифицирование углеродного сорбента поли-N-винилпирролидоном совместно с бетулином (УС-ПВП-Б) проводили путем пропитки углеродного материала 2.5 мас. % раствором бетулина в N-винилпирролидоне при объемном соотношении сорбент/раствор бетулина в N-винилпирролидоне 1 : 2 на водяной бане при температуре 70°С с последующей сушкой при 150°С.

Контроль процесса модифицирования углеродного сорбента по изменению текстуры и определение количества нанесенного модификатора осуществляли методами низкотемпературной адсорбции азота (анализатор Gemini 2380, Micromeritics, США) и термического анализа (термоанализатор DTG-60H, Shimadzu, Япония). Морфологию поверхности исследуемых образцов изучали методом сканирующей электронной микроскопии (электронный микроскоп JSM–6460LV, JEOL, Япония с энергодисперсионной приставкой для рентгеновского микроанализа INCA_X-Act, “Oxford Instruments”, Англия). Перед началом исследования проводили вакуумное напыление на образец сорбента платиновой пленки толщиной 10–15 нм. Изучали по 5–10 гранул сорбента. Исследования проводили при напряжении 15–20 кВ для обеспечения контрастности электронных снимков. ЭДС микроанализ проводили на 4–6 участках поверхности гранул каждого из исследуемых сорбентов.

Антиоксидантные свойства сорбентов оценивали по степени разложения водного раствора пероксида водорода. Константы скорости реакции разложения пероксида водорода (k) без сорбента и в присутствии исследуемых сорбентов рассчитывали по результатам газометрического метода. Использовали 3% раствор пероксида водорода объемом 30 см³, масса образца составляла 0.5000 ± 0.0002 г, продолжительность эксперимента – 1 ч [13].

Активность ферментов антиоксидантной системы (супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы) гемолизата эритроцитов после контакта с исследуемыми сорбентами при соотношении сорбент/гемолизат = = 1/9 в течение 1 ч определяли по стандартным методикам [14].

Для оценки биоспецифических свойств применяли метод секторных посевов (метод Голда). Количественный учет роста микроорганизмов определяли путем высева из пробирки со смесью “образец−микроорганизм” при соотношении 1 : 1 через определенные промежутки времени термостатирования (0–48 ч) на чашки Петри с простым питательным агаром.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 1 представлены термограммы модифицированных углеродных сорбентов, полученные в области температур до 700°С.

Рис. 1.

ТГ-ДТА термограммы модифицированных углеродных сорбентов, УС-МК-ЛИЗ (а), УС-ПВП-Б (б).

В температурном интервале 20–650°С для обоих модифицированных образцов на кривых ДТА наблюдаются выраженные экзотермические пики. Наиболее значимые потери массы происходят в области 200–400°С и составляют 9–11 мас. %. Экзоэффекты в области 200–400°С очевидно связаны с разложением нанесенных модификаторов. Полученные ранее термограммы исходного углеродного сорбента показывают, что он начинает медленно окисляться с потерей массы лишь при температурах выше 650°С [15].

Для образца УС-МК-ЛИЗ в области температур 230–400°С наблюдается один пик потери массы с экзоэффектом на кривой ДТА при 350°С. В образце УС-ПВП-Б наблюдается несколько пиков потери массы. Общая потеря массы для модифицированных образцов УС-МК-ЛИЗ и УС-ПВП-Б составляет 23.5 и 36.3 мас. % соответственно.

В результате модифицирования наблюдается снижение удельной площади поверхности и суммарного объема пор сорбентов (табл. 1). Важно отметить, что мезопористый характер структуры модифицированных сорбентов сохраняется. Распределение мезопор по размерам не меняется и средний диаметр пор составляет 10–11 нм. При этом общий объем пор углеродного сорбента, модифицированного композицией N-винилпирролидон–бетулин остается выше, чем углеродного сорбента, модифицированного композицией молочная кислота-лизоцим при практически одинаковом содержании модификаторов. По-видимому, на значения удельной поверхности и пористости модифицированных сорбентов, прежде всего, влияет разное распределение модификаторов по внешней поверхности и в порах образцов.

Электронно-микроскопические изображения поверхности гранул исходного и модифицированных углеродных сорбентов представлены на рис. 2 и 3.

Рис. 2.

Электронно-микроскопические снимки гранул образцов УС (а) и УС-МК-ЛИЗ (б).

Рис. 3.

Электронно-микроскопические снимки гранул модифицированного углеродного сорбента УС-ПВП-Б.

Гранулы исходного углеродного сорбента характеризуются гладким рельефом поверхности и округлой формой (рис. 2а). Видно, что в процессе модифицирования размер и форма гранул сорбента сохраняются. Однако при этом наблюдаются изменения рельефа и морфологии поверхности модифицированных образцов. На поверхности образца УС-МК-ЛИЗ (рис. 2б) видны частицы модификатора неправильной формы с размерами от 10 мкм и более, распределенные локально в виде “островков”.

На поверхности образца УС-ПВП-Б модификатор распределен в виде полимерной пленки (рис. 3).

Из данных табл. 2 видно, что имеет место заметное различие содержания углерода и кислорода на поверхности углеродного сорбента до и после модифицирования. Этот результат характерен для всех исследованных участков поверхности модифицированных образцов (рис. 4). На поверхности модифицированных образцов содержание кислорода существенно выше, чем в исходном (0.05 мас. % О) и может достигать на отдельных участках поверхности образца УС-МК-ЛИЗ величины 14.31 мас. %, в то время как для образца УС-ПВП-Б лишь величины 2.15 мас. % кислорода. В образце УС-МК-ЛИЗ отличия в содержании кислорода на различных участках поверхности гранул варьируются примерно в 5 раз (табл. 2, рис. 4). Это указывает на неоднородное распределение композиции модификаторов на поверхности гранул сорбента УС-МК-ЛИЗ. Практически одинаковые значения содержания кислорода 2.0–2.2 мас. % на различных участках поверхности гранул сорбента УС-ПВП-Б свидетельствует о равномерном распределении композиции модификаторов поли-N-винилпирролидон–бетулин на его поверхности.

Рис. 4.

ЭМ-изображения поверхности образцов углеродных сорбентов с указанием участков, для которых выполнен локальный элементный анализ.

Газометрическим методом определены константы скорости реакции разложения пероксида водорода в присутствии углеродных сорбентов (табл. 3).

Полученные данные показывают, что углеродные сорбенты, как исходный, так и модифицированные, на порядок ускоряют разложение пероксида водорода по сравнению с системой без сорбента. Это может свидетельствовать о наличии антиоксидантных свойств у исходного и модифицированного углеродных сорбентов.

Результаты исследования активности ферментов антиоксидантной системы супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ), глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионредуктазы (ГР) гемолизата эритроцитов после контакта с исследуемыми углеродными сорбентами в сравнении с контролем К (без контакта с сорбентами) представлены в табл. 4.

Все исследованные углеродные сорбенты повышают активность ферментов антиоксидантной системы: супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ), глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионредуктазы (ГР) в различной степени. Углеродный сорбент УС увеличивает активность супероксиддисмутазы в 1.1 раза, каталазы в 1.1 раза и глутатионпероксидазы в 1.1 раза по сравнению с контролем К. Углеродный сорбент, модифицированный композицией олигомеры молочной кислоты – лизоцим УС-МК-ЛИЗ увеличивает активность супероксиддисмутазы в 1.1 раза по сравнению с контролем К. Углеродный сорбент, модифицированный композицией поли-N-винилпирролидон – бетулин УС-ПВП-Б увеличивает активность супероксиддисмутазы в 1.2 раза и глутатионредуктазы в 1.6 раза по сравнению с контролем К.

Исходный углеродный сорбент способствует снижению роста микроорганизмов только через 24 ч после контакта. Для углеродного сорбента, модифицированного композицией олигомеры молочной кислоты – лизоцим УС-МК-ЛИЗ, наблюдается полное отсутствие роста микроорганизмов уже через 3 ч после контакта и сохраняется в дальнейшем. Углеродный сорбент, модифицированный композицией поли-N-винилпирролидон–бетулин УС-ПВП-Б, способствует прекращению роста микроорганизмов и их смеси по истечению 24 ч.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Получены углеродные сорбенты, модифицированные композициями биологически активных веществ: олигомерами молочной кислоты с иммобилизованным лизоцимом (УС-МК-ЛИЗ) и поли-N-винилпирролидоном совместно с бетулином (УС-ПВП-Б). Установлено, что в процессе модифицирования углеродного сорбента снижается удельная площадь поверхности и суммарный объем пор: в 12.3 и 4.8 раза для образца УС-МК-ЛИЗ, в 7.2 и 2.9 раза для образца УС-ПВП-Б, но средний диаметр мезопор в обоих сорбентах одинаков и составляет 10–11 нм. Методом термического анализа определено количество нанесенных модификаторов, которое составляет 10.7 мас. % для образца УС-МК-ЛИЗ и 9.3 мас. % для образца УС-ПВП-Б. Исследование поверхности методом сканирующей электронной микроскопии показало, что для углеродного сорбента, модифицированного олигомерами молочной кислоты с иммобилизованным лизоцимом наблюдается локальное, в виде “островков”, распределение композиции модификатора на поверхности. Для сорбента, модифицированного поли-N-винилпирролидоном совместно с бетулином композиция модификатора распределена в виде равномерной полимерной пленки. Методом рентгеновского локального анализа установлено различие в элементном составе поверхности исходного и модифицированных образцов углеродного сорбента. Наблюдается увеличение содержания кислорода на поверхности сорбентов по сравнению с исходным образцом до 14.31% (УС-МК-ЛИЗ) и до 2.15% (УС-ПВП-Б). Установлена антиоксидантная способность исследуемых углеродных сорбентов в отношении модельной системы (пероксид водорода). Показана способность исследуемых углеродных сорбентов увеличивать активность ферментов антиоксидантной системы в различной степени. Проведена микробиологическая оценка биоспецифических свойств сорбентов. Исследуемые образцы проявляют свою активность в отношении микрорганизмов и их смеси в различной степени. Полученные модифицированные образцы представляют интерес для применения в медицине и ветеринарии в качестве материалов комплексного действия (антибактериального, антиоксидантного и т.д.).