Физикохимия поверхности и защита материалов, 2022, T. 58, № 6, стр. 594-599

Влияние растворителя

На рис. 1 приведен масс-спектр растворителя вода–ацетонитрил использовавшегося для вычитания фона при получении экспериментальных масс-спектров соединений.

Рис. 1.

Масс-спектр растворителя, использовавшегося для растворения и ввода пробы (вода–ацетонитрил – 50 : 50).

Из рисунка видно, что растворитель содержит около десятка ионизируемых соединений в количествах менее нг/л (в пересчете на исследуемые соединения). Это количество вполне соответствует степени чистоты используемых растворителей, однако следует учитывать, что при проведении эксперимента возможно большое количество побочных реакций, которые могут влиять на ход эксперимента. В то же время в ходе эксперимента было показано, что величина напряжения на распылительном конусе может влиять на величину фона. При этом однако, подбор этого параметра производится индивидуально в каждом эксперименте и зависит от структуры и сечения ионизации конкретной аминокислоты.

Сечение ионизации

Эксперимент по определению сечения ионизации показал, что при использовании мягкого метода ионизации кривые могут иметь ряд особенностей (рис. 2).

Рис. 2.

Кривые ионизации исследуемых аминокислот в диапазоне от 1 до 1000 мкг/л: (а) глицин–глицин, (б) тирозин, (в) триптофан.

Из рис. 1 видно, что кривые ионизации глицин-глицина и триптофана имеют характерный перегиб в области концентрации 100–200 мкг/л. Такой перегиб крайне нехарактерен для “жестких” методов ионизации (например, электронного удара), которые работают в условиях высокого вакуума, в то время, как применяемый электрораспылительный метод работает при атмосферном давлении и в присутствии растворителя. Подобный перегиб говорит об изменении в путях кластерообразования при прохождении критической концентрации и начале образования многоатомных кластеров, что объясняется сокращением среднестатистического расстояния между молекулам аминокислот с ростом концентрации и наличии в них открытых ионогенных групп и/или π-сопряженной системы. В то же время следует отметить, что несмотря на различие в химическом строении исследуемых молекул интенсивность пиков протонированных ионов при одинаковых концентрациях соединений различается менее, чем на 15%. Можно утверждать, что при ионизации в присутствии избытка посторонних соединений (компонентов воздуха, растворителя) влияние геометрии молекул уходит на второй план и решающее значение в данном случае имеют именно побочные процессы.

Деструкция соединений

Диглицин является линейной и наименее поляризованной молекулой, что объясняет его относительную стабильность в условиях ионизации. Основным направлением распада диглицина является дегидратирование с образованием иона 115.0505 Да (экспериментальна величина). Однако интенсивность этого иона составляет всего 2–3% от протонированной молекул и не зависит от концентрации диглицина в исследуемом растворе.

В отличии от диглицина, тирозин и триптофан являются сильно поляризованными молекулами и значительно подвержены деструкции.

Из рис. 3 видно, что наиболее интенсивные пики в масс-спектре тирозина принадлежат продуктам декарбоксилирования (136.0761 Да) и дегидратирования (165.0552 Да) тирозина. Данные пики в 1.5–2 раза больше протонированного иона. Для триптофана еще более характерен процесс деструкции: продукт деаминирования аминокислоты в 6–8 раз больше протонированного иона и является самым интенсивным в масс-спектре. Таким образом, ионизация в присутствии растворителя приводит прежде всего к множеству побочных реакций, что в свою очередь вызывает значительную деструкцию исследуемых соединений.

Кластерообразование

Следует отметить, что помимо процессов деструкции в процессе ионизации образуются также кластерные ионы. Наиболее четко этот процесс прослеживается при ионизации глицин-глицинового дипептида. Уже при концентрации в 10 мкг/л (рис. 3а) прослеживается образование димера с заряженным центром в виде иона натрия (пик с массой 287.0891 Да). При увеличении концентрации глицин–глицина увеличивается количество и размер образующихся кластеров.

Рис. 3.

Масс-спектры в режиме регистрации положительных ионов исследуемых соединений в концентрации 10 мкг/л: (а) диглицина, (б) тирозина, (в) триптофана – стрелками указан протонированный ион соответствующего соединения.

Активное кластерообразование начинается уже при концентрации 2–10 мкг/л из-за уменьшения межмолекулярного расстояния в исследуемом растворе. При этом увеличивается вероятность столкновения и взаимодействия молекул вещества с образованием кластерных ассоциатов. С ростом концентрации увеличивается не только количество кластерных ионов, но и количество молекул в ассоциате, которое при наибольшей концентрации может достигать 10–12 молекул в одном кластерном ионе. Также стоит отметить, что при концентрации 200 мкг/л плотность заряда в растворе достигает таких величин, что происходит образование многозарядных кластерных ионов [10]. Так на рисунке 4 четко обнаруживаются двухзарядные ассоциаты из 11 и 13 молекул глицин–глицина. При этом максимальное число молекул глицин-глицина в двухзарядных ассоциатах может достигать 15–17 молекул.

Рис. 4.

Масс-спектр раствора глицин–глицина в концентрации 1000 мкг/л в режиме регистрации положительных ионов. Гли – молекула глицин–глицина.

Следует отметить, остальные исследуемые молекулы имеют значительно меньшее стремление к кластерообразованию. Так, молекула тирозина крайне склонна к деструкции и кластерообразование для нее наименее характерно из-за крупного ароматического кольца в структуре. При этом кластерный ион больше димера получить не удается даже при максимальной концентрации аминокислоты (рис. 5).

Рис. 5.

Масс-спектр раствора тирозина в концентрации 1000 мкг/л в режиме регистрации положительных ионов. Тир – молекула тирозина.

Затруднение в образовании кластерных ионов с большим количеством молекул аминокислоты обусловлено стерическими затруднениями из-за крупного ароматического кольца, которое исключает возможность образования крупных заряженных кластеров.

Подобные процессы наблюдаются и при ионизации триптофана, который обладает сопряженной гетероциклической системой из двух ароматических колец.

При концентрации выше 50 мкг/л наблюдается образование димера триптофана (пик с массой 409.1892 Да). Более крупные кластерные ионы триптофана также не образуются.

Следует также отметить, что для ароматических аминокислот более характерна деструкция, чем кластерообразование, в то время как глицин глицин более стремится именно к молекулярной ассоциации.

Рис. 6.

Масс-спектр раствора триптофана в концентрации 1000 мкг/л в режиме регистрации положительных ионов. Трп – молекула триптофана.

Ионизация аминокислот

Настоящее исследование направлено на более углубленное изучение процессов ионизации и является частью большой работы авторов по исследованию физикохимии процессов ионизации в различных условиях [11–13].

Исследование направлено на поиск закономерностей в процессах ионизации аминокислот для повышения информативности масс-спектров подобных соединений и для аналитических целей. Следует отметить, что кластерообразование играет важную роль как в физикохимии ионизации, так и в анализе. Из результатов работы можно сделать ряд крайне важных выводов, как в области процессов иоинизации, так и для прикладных целей. По результатам работы становиться очевидным, что наиболее активно кластерообразования проходит в простых аминокислотах со стерически незатрудненными ионогенными группами, хотя, являясь цвиттер-ионом, любая аминокислота может образовывать кластерные ионы, в той или иной степени. Наличие открытых ионогенных групп и малого радикала в глицине обуславливает активное кластерообразование его при ионизации. Рисунок 4 показывает, что диглицин в ионизированном состоянии находится сразу во множестве форм, в том числе и многозарядных ионов. Очевидно, что в этом случае значительно повышается информативность масс-спектра и надежность идентификации соединения на качественном уровне. Однако при этом сечение ионизации принимает сложную форму с перегибом и потому значительно затрудняется количественный анализ, необходимый при выполнении исследований, связанных с реальными образцами, содержащими целый набор соединений, в том числе искомых аминокислот.