Зоологический журнал, 2022, T. 101, № 10, стр. 1173-1189

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовано 142 особи A. fortis, отловленные в 55 локальных популяциях (включая 13 островных) на севере ареала: на юге Дальнего Востока России, в Забайкальском крае, Бурятии, Монголии и Китае (табл. 1, рис. 1В и 1C). Образцы собственных сборов хранятся в коллекции тканей млекопитающих ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН, Владивосток.

Выделение ДНК осуществляли методом солевой экстракции (Aljanabi, Martinez, 1997) из фиксированных в спирте мышц и печени. Подробная методика по приготовлению реакционной смеси, схема ПЦР-реакции и подготовки проб к секвенированию были описаны ранее (Шереметьева и др., 2015). Нуклеотидную последовательность контрольного региона определяли на автоматическом секвенаторе ABI Prizm 3130 на базе Центра коллективного пользования ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН, Владивосток. От всех дальневосточных полевок из наших сборов были получены полные нуклеотидные последовательности контрольного региона, которые внесены в Genbank/NCBI под номерами MZ056579–MZ056719. Кроме того, в анализ включены полученные нами ранее и помещенные в Genbank/NCBI под номерами HM135815–HM135852 (Haring et al., 2011) 38 нуклеотидных последовательностей контрольного региона дальневосточных полевок из популяций России, а также 86 нуклеотидных последовательностей контрольного региона полевок из Китая, Genbank/NCBI KJ207290–KJ207373, FJ597650– FJ597731 и GU474450-GU474511 (Guo et al., 2012; Gao et al., 2017). В качестве внешней группы нами выбрана полевка-экономка (A. oeconomus) № HM135920 (Haring et al., 2011).

Редактирование и выравнивание полученных последовательностей проводили с использованием программы BioEdit 7.0.9.0 (Hall, 1999). Длина последовательностей варьировала от 925 до 958 п.н., а после выравнивания составила 905 п.н. Построение филогенетических деревьев методом максимального правдоподобия (Maximum Likelihood) выполнено в программе MEGA X (Kumar et al., 2018). Нами использована модель Hasegawa-Kishino-Yano с G-распределением (BIC = 8847.319), достоверность кластеризации оценивалась с помощью бутстрэп-анализа (1000 повторностей). Сети гаплотипов построены с помощью программы Network 10.0.0.0 с использованием метода “median joining” (Bandelt et al., 1999). При построении филогенетических деревьев и сетей делеции не учитывались. Расчет показателей генетического разнообразия (нуклеотидного (π) и гаплотипического (h) разнообразия, числа вариабельных сайтов (Vs), среднего числа попарных нуклеотидных различий (k)), а также построение графика распределения попарных нуклеотидных различий между гаплотипами выполнены с помощью программы DnaSP 6.00 (Rozas et al., 2017). Расчет статистик нейтральности (Tajima’ D и Fu’s F), анализ демографической и пространственной экспансии проводили в программе Arlequin 3.5 (Excoffier, Lischer, 2010).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В выборке из 142 особей A. fortis, не исследованных ранее, обнаружено 116 гаплотипов, из которых 111 выявлены впервые. С учетом гаплотипов, описанных ранее (Haring et al., 2011; Guo et al., 2012; Gao et al., 2017), их общее число для вида составляет 209, а число вариабельных сайтов – 169 (табл. 2). В целом, для вида отмечено высокое гаплотипическое (94%) и нуклеотидное (1.63%) разнообразие.

ML-филогенетическая реконструкция продемонстрировала разделение всех гаплотипов A. fortis на три обособленные клады с высокими бутстреп поддержками (рис. 2). Эти клады соответствуют филогенетическим линиям NORTH, SOUTH и GX, выделенным ранее на территории Китая (Gao et al., 2017). Все гаплотипы дальневосточных полевок с территории России, выявленные в ходе данной работы, принадлежали к линии NORTH.

Рис. 2.

Дендрограмма филогенетических отношений контрольного региона мтДНК дальневосточной полевки. GX, SOUTH и NORTH – филогенетические линии (по: Gao et al., 2017). HN, FJ–1 и FJ–2 – группы внутри линии SOUTH; MAIN и ISL – группы внутри линии NORTH.

В пределах линии SOUTH можно выделить три субклады: HN, FJ−1 и FJ−2 (рис. 2 и 3). Гаплотипы этих групп, так же как и линии GX, имеют четкую географическую локализацию. При этом гаплотипы, относящиеся к сильно дифференцированным субкладам FJ−1 и FJ−2, были обнаружены у особей из одной локальной популяции в провинции Фуцзянь, Китай (Gao et al., 2017). Показатели гаплотипического и нуклеотидного разнообразия в субкладах линии SOUTH и в пределах линии GX не превышают значений 0.723 и 0.0053 соответственно, что значительно ниже, чем для вида в целом (табл. 2).

Рис. 3.

Филогенетическая сеть гаплотипов контрольного региона мтДНК дальневосточной полевки. GX, SOUTH и NORTH – филогенетические линии (по: Gao et al., 2017). HN, FJ–1 и FJ–2 – группы внутри линии SOUTH; MAIN и ISL – группы внутри линии NORTH.

В пределах линии NORTH как на филогенетическом дереве, так и на медианной сети можно выделить две субклады: MAIN и ISL (рис. 3). При этом показатели гаплотипического разнообразия в субкладах MAIN и ISL остаются высокими (0.972 и 0.957 соответственно), тогда как значения нуклеотидного разнообразия ниже (0.0082 и 0.0065 соответственно), чем для вида в целом (табл. 2). Распределение гаплотипов в субкладах MAIN и ISL не имеет четкой географической локализации. В северной части ареала вида преимущественно обитают особи, имеющие гаплотипы субклады MAIN. Доля полевок с гаплотипами субклады ISL составляет только 11% от всех особей линии NORTH.

Значение D Tajima для всех субклад за исключением линии GX было отрицательным, однако значимым оно было только для групп линии NORTH. Результаты теста Фу (Fu’s F) на селективную нейтральность для всех субклад были не только отрицательными, но и высоко достоверно отличались от нуля, что свидетельствует в пользу гипотезы роста численности в прошлом (табл. 2).

Распределение попарных нуклеотидных различий между гаплотипами полевок для групп HN, MAIN и ISL имело унимодальную форму, при этом только для группы HN пик приходится на начало шкалы (рис. 4). Распределение попарных нуклеотидных различий между гаплотипами особей в популяции провинции Фуцзянь характеризуется бимодальным распределением, что является следствием смешивания гаплотипов субклад FJ−1 и FJ−2. Присутствие пика в области минимальных различий в субкладах HN, FJ−1 и FJ−2 предполагает внезапный рост популяции с эффектом основателя.

Рис. 4.

Частота (ось ординат) попарных нуклеотидных различий (ось абсцисс) в филогенетических группах дальневосточной полевки с применением модели роста-уменьшения популяции. Наблюдаемая частота обозначена сплошной линией, ожидаемое распределение – пунктирной линией.

Небольшие значения условного времени экспансии τ, а также низкие и статистически недостоверные значения суммы отклонений SSD свидетельствуют в пользу гипотезы роста численности для популяций всех исследуемых субклад кроме FJ−1 (табл. 3).

Распределение гаплотипов филогенетических субклад на материковой части юга Дальнего Востока России. Для определения филогенетических отношений гаплотипов A. fortis на юге Дальнего Востока России построена медианная сеть (рис. 5). Обнаруженные у исследованных особей варианты гаплотипов относятся к двум субкладам: MAIN и ISL. При этом доля особей с гаплотипами субклады MAIN значительно выше в сравнении с ISL (91.2 и 8.8% соответственно). Образующие отдельную группу гаплотипы ISL были обнаружены в выборках из окрестностей городов Хабаровск (KHAB) и Бикин (BIK), а также в выборке из нижнего Приамурья (окрестности пос. Власьево, VLAS) и западного Приморья (окрестности с. Кроуновка, KROU) (табл.1). Гаплотипы субклады MAIN группируются на сети в структуру, близкую к звездчатой, большинство их были уникальными (т.е. выявлены только у одной особи), однако обнаружено три гаплотипа (H1, H2 и H3), которые встречались у трех и более особей из разных удаленных друг от друга выборок. Гаплотип H1 на сети имеет центральное положение. В целом, гаплотипы этой субклады не формировали групп в соответствии с их географической принадлежностью.

Рис. 5.

Филогенетическая сеть гаплотипов мтДНК Alexandromys fortis дальневосточной части ареала (материк). Размеры кружков пропорциональны количеству образцов с данным гаплотипом. Гаплотипы обозначены в соответствии с кодами выборок в табл. 1. Цифры на ветвях сети соответствуют числу нуклеотидных замен, превышающему 2.

Распределение гаплотипов филогенетических субклад на дальневосточных островах. Медианная сеть (рис. 6), построенная для гаплотипов дальневосточных полевок из островных популяций, также выявила их принадлежность к двум субкладам: MAIN и ISL. К субкладе ISL относятся гаплотипы полевок островов Матвеева (MAT) и Большой Пелис (BP) архипелага Римского-Корсакова Японского моря, а к группе MAIN – гаплотипы полевок всех остальных островов залива Петра Великого Японского моря и о-ва Сахалин.

Рис. 6.

Филогенетическая сеть гаплотипов мтДНК Alexandromys fortis с островов залива Петра Великого и Сахалин. Размеры кружков пропорциональны количеству образцов с данным гаплотипом. Гаплотипы обозначены в соответствии с кодами выборок в табл. 1. Цифры на ветвях сети соответствуют числу нуклеотидных замен, превышающему 2.

Гаплотипы островных полевок, относящиеся к субкладе MAIN, формируют на сети четыре группы. В первую группу вошли особи с островов Рикорда (RIK), Пахтусова (PAX) и Путятина (PUT). В эту же группу попадают два гаплотипа (H1 и H2), которые часто встречаются у полевок в материковых популяциях Дальнего Востока, при этом гаплотип H1 сохранился в популяции о-ва Путятина, а гаплотип H2 – на о-ве Пахтусова. Следует отметить, что полевки островов Рикорда и Пахтусова имеют один общий гаплотип. Это, вероятно, связано с тем, что предковая популяция полевок этих островов была единой. Во вторую группу вошли гаплотипы особей с о-ва Сахалин, при этом два из них отличаются от общего гаплотипа островов Рикорда и Пахтусова только двумя заменами, тогда как различия между сахалинскими гаплотипами достаточно велики (до шести нуклеотидных замен). Третью группу образуют гаплотипы полевок с островов Лисий (LIS), Камни Унковского (UNK), а также значительно удаленного от них о-ва Фуругельма (FUR). Особи островов Лисий и Камни Унковского имеют общий гаплотип. Четвертую группу составляют гаплотипы особей четырех близлежащих островов архипелага Императрицы Евгении: Русский (RUS), Попова (POP), Рейнеке (REI) и Клыкова (KL).

Распределение гаплотипов филогенетических субклад в Забайкалье. Бо́льшая часть гаплотипов исследованных животных из Забайкалья (Бурятия, Забайкальский край) также относится к субкладе MAIN (рис. 7). На филогенетической сети они сформировали две группы в соответствии с их географической принадлежностью: Восточное и Западное Забайкалье. Лишь одна особь из Восточного Забайкалья (окрестности пос. Первомайский, PER) имела гаплотип, близкий особям Западного Забайкалья. Гаплотипы субклады ISL обнаружены только у обеих особей, отловленных в Бурятии, в Баргузинской котловине (окрестности с. Баргузин, BAR и окрестности с. Ина-соел, INA). К сожалению, эти выборки были слишком малы, и утверждать, что здесь отсутствуют полевки с гаплотипом субклады MAIN, нельзя.

Рис. 7.

Филогенетическая сеть гаплотипов мтДНК Alexandromys fortis забайкальской части ареала. Размеры кружков пропорциональны количеству образцов с данным гаплотипом. Гаплотипы обозначены в соответствии с кодами выборок в табл. 1. Цифры на ветвях сети соответствуют числу нуклеотидных замен, превышающему 2.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты проведенного нами анализа изменчивости нуклеотидных последовательностей контрольного региона A. fortis подтвердили наличие трех филогенетических линий (NORTH, SOUTH и GX), выделенных ранее (Gao et al., 2017). При этом, как отмечалось в указанной работе, филогенетическая линия GX является наиболее древней. Филогенетическая линия NORTH – эволюционно самая молодая и наиболее распространенная, она отмечена на большей части ареала.

В настоящей работе нами впервые показано, что линия NORTH разделена на две сестринские филогенетические субклады, обозначенные нами как MAIN и ISL. Гаплотипы первой из них имеют широкое географическое распространение, тогда как гаплотипы второй приурочены к островам архипелага Римского-Корсакова Японского моря (Большой Пелис и Матвеева) и Баргузинской котловине в Бурятии, а также с небольшой частотой встречаются в материковых популяциях на юге Дальнего Востока России, прежде всего в бассейне нижнего Амура. Следует отметить, что гаплотипы субклады ISL на территории Китая обнаружены не были, но, возможно, это обусловлено небольшим числом исследованных выборок и особей. Популяции островов Большой Пелис и Матвеева, а также, возможно, Баргузинской котловины в настоящее время не контактируют с популяциями основной части ареала, сохраняя один (ISL) тип мтДНК.

В литературе, в том числе посвященной млекопитающим Северо-Восточной Азии (Matsuhashi et al., 2001; Abramson et al., 2012; Ye et al., 2015), имеются примеры сходных геногеографических паттернов, когда на краях ареала какого-либо вида обнаруживаются редкие филогенетические линии (как наряду с основной линией, так и фиксировано), не встреченные в основной части ареала. Традиционно такую филогеографическую картину объясняют обусловленными изменениями климата, флуктуациями границ ареалов видов в плейстоцене. Заселение отдельных участков ареалов происходит линиями, сформировавшимися в разных рефугиумах. Как известно, резкие колебания климата в плейстоцене, особенно в последний ледниковый максимум (21 000–18 000 л.н.), оказывали сильное влияние на географическое распространение и генетическое разнообразие многих видов умеренного пояса в Северном полушарии (Hewitt, 2000). Несмотря на отсутствие крупного четвертичного оледенения на территории Восточной Азии, климатические колебания на данной территории были весьма значительными. Так, известно, что климат северной части субтропического Китая (между 32° и 45° с.ш.) был холоднее, по крайней мере, на 7–10°С и суше по сравнению с климатом в настоящее время (Xiangjun, Yinshuo, 1991). В результате климатических изменений ареалы многих видов умеренного пояса сократились за счет их северной части до макрорефугиумов на юге, где региональный климат был приемлем для существования. После последнего ледникового максимума многие виды повторно заселили северные территории, которые они занимали ранее, причем в ряде случаев экспансия происходила гораздо быстрее, чем предсказывают ее модели (Clark et al., 2003; Magri, 2008). Известно, что многие современные представители фауны Восточной Азии распространились из ледниковых рефугиумов, находящихся в Северо-Восточном Китае и на Корейском п-ове (Xie, Zhang, 2005; Zhang et al., 2008; Sakka et al., 2010; Aizawa et al., 2012; Kim et al., 2018; Lee, et al., 2018; Choi et al., 2020).

Самая ранняя находка A. fortis (600–700 тыс. л.н.) известна из отложений раннего плейстоцена пещеры Choukoutien в Центральном Китае (Zheng, Li, 1990), поэтому этот вид, несомненно, претерпел неоднократные значительные изменения в своем распространении и численности, следуя за глобальными климатическими колебаниями в течение плейстоцена. Интересно, что A. fortis отмечается в отложениях позднего плейстоцена на о-ве Мияко (Япония), хотя в современной фауне острова не встречается (Kaneko, Hasegawa, 1995). Кавамура (Kawamura, 2014) предположил, что A. fortis мигрировал с континента на о-в Мияко в среднем плейстоцене. В этот период ареал дальневосточной полёвки был значительно шире современного, 30–24 тыс. л.н. она была обычным, широко распространенным видом на юге Дальнего Востока (Алексеева, Голенищев, 1986; Панасенко, Тиунов, 2010) и встречалась в Юго-Западном Забайкалье (Тологой, верхняя толща) (Алексеева, 2005). Начиная с 24–21 тыс. л.н. численность вида резко сокращалась вплоть до начала голоцена (10 тыс. л.н.) в связи с похолоданием (Панасенко, Тиунов, 2010); вместо дальневосточной полевки в раскопках начинают преобладать полевка Максимовича и лемминги. В этот период отмечался последний климатический минимум, среднегодовые температуры были ниже современных на 8–12°С при небольшом количестве осадков – 400–500 мм в год (Короткий и др., 1996). Бо́льшая часть популяций дальневосточной полевки сместилась, вероятно, значительно южнее, где она сохранялась в рефугиумах вместе с другими видами (Aizawa et al., 2012; Kim et al., 2018; Sakka et al., 2010; Zhang et al., 2008). На большей части Забайкалья популяции A. fortis были уничтожены огромным ледниково-подпрудным озером (“Витимское море”), которое существовало в период Сартанского оледенения, 28–12.5 тыс. л.н. (Еникеев, Старышко, 2009). После 10 тыс. л.н. начинаются резкий подъем численности (Панасенко, Тиунов, 2010) и восстановление ареала дальневосточной полевки. После деградации “Витимского моря” освободившаяся от него территория Забайкалья, возможно, была вторично заселена дальневосточными полевками из южных регионов двумя путями: первый путь проходил по бассейну р. Селенга, а второй – вдоль р. Амур и ее притоков. Таким образом, популяции A. fortis Восточного и Западного Забайкалья могли сформироваться независимо друг от друга. Эта гипотеза подтверждается морфологическими данными, согласно которым полевки, обитающие в Восточном и Западном Забайкалье, принадлежат к разным подвидам (Фетисов, 1940): в Западном Забайкалье встречается исключительно полевка Михно (A. f. michnoi), а в Восточном Забайкалье обитает форма, близкая к дальневосточному подвиду (A. f. pelliceus). Кроме того, на различия между A. fortis Восточного и Западного Забайкалья указывают и сведения об изменчивости гетерохроматиновых блоков в хромосомах (Ковальская и др., 1991).

Полученные нами данные по изменчивости контрольного региона у дальневосточной полевки подтвердили опубликованные ранее результаты, свидетельствующие о существовании крупного макрорефугиума на территории Северо-Восточного Китая (Gao et al., 2017). Существование двух субклад MAIN и ISL в филогенетической линии NORTH и неравномерность распределения соответствующих им линий можно рассматривать в свете нескольких гипотез: с одной стороны, как свидетельство более древнего (анцестрального) полиморфизма, что (с учетом небольшой генетической дистанции между субкладами ISL и MAIN) позволяет допустить нерефугиальное происхождение их гаплотипов вследствие случайной утраты промежуточных вариантов. С другой стороны, можно предположить заселение краевых участков ареала из двух рефугиумов, в которых независимо сформировались гаплотипы субклад MAIN и ISL, а неравномерность их распределения можно объяснить генетико-автоматическими процессами. Например, снижением встречаемости гаплотипов субклады ISL на большей части ареала со временем и случайной их фиксацией в небольших изолированных популяциях.

В случае с дальневосточной полёвкой мы имеем возможность детализировать историю формирования генетической структуры вида, привлекая для сравнения данные анализа древней ДНК из ископаемых образцов. Ранее нами было проведено сравнение древней мтДНК, которая была выделена из палеоматериала, взятого из разновозрастных слоев пещеры Медвежий Клык (Haring et al., 2015), и мтДНК от дальневосточных полевок из современных популяций островов залива Петра Великого Японского моря (Шереметьева, 2020). В результате было показано, что все древние гаплотипы, так же как и современные, делятся на две субклады, MAIN и ISL, имея фиксированные отличия по 4 сайтам (длина анализируемого фрагмента для древних гаплотипов – 344 п. н.). При этом отмечено, что все древние гаплотипы субклады ISL, схожие с гаплотипами современных полевок архипелага Римского-Корсакова, были выявлены в более старых останках (>40 и >30 тыс. л. н.). Возможно, что обитавшие на территории юга Приморского края полевки в период 30–24 тыс. л. н. имели, в основном, гаплотипы субклады ISL (Шереметьева, 2020), но впоследствии были “вытеснены” гаплотипами субклады MAIN. Как предполагалось выше, это могло произойти в результате случайных генетико-автоматических процессов. Но нам представляется возможным рассмотреть филогенетические паттерны у A. fortis также с позиций гипотезы микрорефугиумов или “загадочных рефугиумов” (Rull, 2009). Существование множественных микрорефугиумов предполагалось несколькими авторами у разных видов животных в континентальной части Восточной Азии (Bao et al., 2015; Zeng et al., 2015; Ye et al., 2019). Важной характеристикой микрорефугиума является стабильный микроклимат, который достаточно отличается от климатических условий окружающего региона, чтобы способствовать сохранению вида (Hampe, Jump, 2011). Эта гипотеза предполагает, их небольшой размер, поскольку они локальны и окружены неподходящими местами обитания. Микрорефугиумы могут находиться в защищенных местах, например в глубоко изрезанных долинах рек и озер. Эти долины обеспечивают микроклимат, способствующий выживанию видов (Stewart, Lister, 2001). Также микрорефугиумы могут находиться на морском побережье, где климат более влажный и с меньшей сезонной изменчивостью (Stewart et al., 2010). При этом, согласно результатам исследований, микрорефугиумы достаточно трудно идентифицировать даже по генетическим данным. Следует также отметить, что не все виды способны сохраняться в микрорефугиумах (Hylander et al., 2015), поскольку малые изолированные популяции особо подвержены негативному воздействию инбридинга и демографических колебаний численности (Примак, 2002). Однако дальневосточная полевка способна длительно существовать даже в очень маленьких популяциях благодаря механизмам регуляции плотности населения (Катин, 1989). Такие малые популяции мы можем наблюдать и сейчас на мелких островах залива Петра Великого. Вероятно, эта особенность имеет глубокие эволюционные корни, поскольку она характерна и для других видов серых полевок (Lomolino, 1986).

Следуя теории микрорефугиумов, можно предположить, что во время последнего климатического минимума, при смещении основного ареала дальневосточных полёвок на юг, небольшая часть особей удерживалась в прежних (расположенных севернее) местообитаниях со стабильным микроклиматом, прежде всего, на морском побережье, где оставались луговые сообщества, и именно в этих небольших изолятах сохранились гаплотипы субклады ISL. Свидетельства существования микрорефугиумов мы можем наблюдать на изолированных шельфовых островах залива Петра Великого (Матвеева и Большой Пелис) – именно тех, которые раньше отделились от материка (Велижанин, 1976; Шереметьев, 2001). Следы существования микрорефугиумов могут быть обнаружены и на других островах архипелага Римского-Корсакова в заливе Петра Великого. По крайней мере, на двух о-вах Дурново и Де-Ливрона у дальневосточных полевок были отмечены особенности морфотипической изменчивости антероконидной формы первого нижнего моляра по сравнению с другими островными и материковой популяциями (Винокурова и др., 2022). Предполагать наличие микрорефугиумов у дальневосточной полевки можно также в бассейне нижнего течения реки Амур и в более континентальной, северо-западной части ареала – в межгорных котловинах Забайкалья, таких как Баргузинская, где в популяциях имеются особи с гаплотипами субклады ISL (рис. 1). Таким образом, микрорефугиумы могли способствовать сохранению гаплотипов субклады ISL в некоторых краевых популяциях как в период климатического минимума, когда произошло исчезновение большинства популяций вида в северной части ареала, так и во время голоцена, когда данные территории были повторно заселены полёвками с гаплотипами субклады MAIN. Однако остается не ясным, почему за время длительной изоляции этих удаленных друг от друга небольших популяций (т.е. при невысокой эффективной численности животных) в них не накопилось заметных различий гаплотипов субклады ISL. Возможно, это обусловлено особенностями биологии вида.

Таким образом, возможны несколько гипотез, объясняющих выявленную в данной работе генетическую изменчивость дальневосточной полевки на территории Забайкалья и Дальнего Востока. Часть из них с большей вероятностью объясняют существование гаплотипов субклад ISL и MAIN в пределах линии NORTH, тогда как роль микрорефугиумов могла заключаться в сохранении гаплотипов субклады ISL в период климатического минимума и после его завершения при широкой экспансии вида на север. Для проверки этих гипотез данная работа нуждается в продолжении как с исследованием материала из ранее неизученных локалитетов, так и с вовлечением в анализ дополнительных молекулярных маркеров.