Зоологический журнал, 2022, T. 101, № 12, стр. 1424-1428

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Тридцатого мая 2020 г. на п-ове Краббе (42°35′54″ N, 130°54′13″ E) сотрудником базы отдыха Е.А. Кравцовой была подобрана поранившая крыло летучая мышь. По фотографии (рис. 1А), летучая мышь была предварительно определена как Eptesicus serotinus (Schreber 1774). В районе базы отдыха каждый вечер наблюдали охотящихся летучих мышей. Второго июля здесь была отловлена самка этого же вида (рис. 1B). Образец был зафиксирован в 70% этаноле для дальнейшего камерального изучения. Предварительно были взяты пробы на молекулярный анализ.

Рис. 1.

Внешний вид Eptesicus pachyomus: A – Eptesicus pachyomus, пойманный 13.05.2020 г. (фото выполнено Е.А. Кравцовой); B – Eptesicus pachyomus, пойманный 02.07.2020 г. (фото выполнено М.П. Тиуновым).

Выделение ДНК проводили при помощи стандартного фенол-хлороформного метода (Higuchi et al., 1988; Maniatis et al., 1989). Для определения видовой принадлежности по сиквенсу были амплифицированы два участка митохондриальной ДНК, ранее использованные в исследованиях летучих мышей рода Eptesicus (Juste et al., 2013): фрагменты генов цитохрома b (CytB) и NADH дегидрогеназы (ND). Для амплификации этих последовательностей были использованы праймеры: ND-f (5'-CCTCGATGTTGGATCAGG-3') и ND-r (5'-GTATGGGCCCGATAGCTT-3') (Mayer, von Helversen, 2001) и CytB-f (5'-ACTCTTTCTAGCCATGCACTAC-3'), CytB-r (5'-ACCCGGTTTCGTGTAAGAATAG-3'). Праймеры для цитохрома b были подобраны с использованием сервиса IDT. Ожидаемый размер ПЦР продукта для фрагмента гена NADH составлял 1427 п.н. и CytB 470 п.н.

Амплификацию регионов митохондриальной ДНК проводили помощью стандартной ПЦР. Амплификация проводилась по следующей схеме: денатурация в течение 5 мин при 95°C, 30 циклов амплификации (15 с при 95°C, отжиг праймеров 30 с при 55°C для ND и 53°C для CytB, 90 с при 72°C), финальная наработка продукта проводилась в течение двух минут при 72°C. Очистку полученных ПЦР-продуктов проводили с использованием стандартного набора ExoSAP-IT (Thermo-Fisher). С очищенным продуктом проводили реакцию с использованием стандартного набора BrightDye (Thermo-Fisher). Продукт реакции очищали с использованием BigDye XTerminator Purification Kit (Thermo Fisher) и далее производили секвенирование по Сэнгеру (капиллярный секвенатор 3500 Genetic Analyzer, Applied Biosystems).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для определения видовой принадлежности обнаруженного индивида был проведен молекулярно-генетический анализ образца по двум регионам митохондриальной ДНК: фрагментам генов цитохрома b (CytB) и NADH дегидрогеназы (ND). Полученные последовательности фрагментов генов ND (ON310507) и CytB (ON310508) сравнили c последовательностями других представителей рода Eptesicus (из базы данных GenBank): E. serotinus turcomanus, E. s. serotinus, E. pachyomus pallens, E. p. andersoni, E. p. pachyomus, E. ognevi, E. bottae omanensis, E. b. innesi и Myotis lucifugus, Myotis myotis, Vespertilio murinus, Rhyneptesicus nasutus matschiei, R. n. batinensis в качестве внешней группы. Последовательности митоходриальных генов Myotis lucifugus взяты из работы Isidoro-Ayza et al., 2018 (MG851810, MG851800), остальные последовательности – из филогенетического исследования Juste et al., 2013. При помощи программы MEGA последовательности генов были выровнены и построено филогенетическое древо на основе объединенной последовательности двух генов (CytB и ND) методом присоединения соседей (Neighbor joining) после 1000 итераций (рис. 2).

Рис. 2.

Филогенетическое древо, построенное на основании сравнения конкатенированных последовательностей фрагментов генов NADH дегидрогеназы и цитохрома b методом присоединения соседей (Neighbor joining) при 1000 итераций. Исследуемый образец обозначен Eptesicus pachyomus sp. (выделен синим цветом). Последовательности митохондриальных генов других видов летучих мышей из базы данных GenBank: Myotis lucifugus из работы Isidoro-Ayza et al., 2019 (MG851810, MG851800), остальные последовательности из филогенетического исследования Juste et al., 2013, номера животных сохранены из оригинального исследования.

На основе сравнения последовательностей ДНК можно утверждать, что описываемая нами летучая мышь принадлежит роду Eptesicus (рис. 2). Также на полученном филогенетическом древе изучаемый образец входит в ветвь вида E. pachyomus (поддержка 94).

Из четырех подвидов, выделяемых в составе E. pachyomus (andersoni, pallens, pachyomus и horikawai), в базе данных NCBI имеются последовательности фрагментов митохондриальной ДНК только для первых трех подвидов. Однако проведенные филогенетические построения не позволяют однозначно определить, к какому подвиду принадлежит исследуемый образец. На филогенетическом древе исследуемый нами образец E. pachyomus ssp. кластеризуется с поддержкой 98 E. p. andersoni, что указывает на принадлежность к подвидовому комплексу andersoni в рамках вида E. pachyomus. Интересно, что последовательности фрагмента гена цитохрома b исследуемой здесь летучей мыши имеет большое сходство с последовательностями летучих мышей из Китая (MG570068.1) – 99.27% и Гонконга (KFBG_HZ0123, Ades et al., 2018) – 99.2%, однако при проведении филогенетического анализа исследованный нами экземпляр из Приморья и летучие мыши из Китая и Гонконга не образуют единой клады.

От близкого по размерам Vespertilio sinensis (Peters 1880), встречающегося на юге Дальнего Востока России в летний период, добытый нами экземпляр отличается, в первую очередь, строением козелка и более крупным черепом. У V. sinensis козелок короткий булавовидный, заметно расширенный в предвершинной части. У рассматриваемого экземпляра козелок высокий и прямой, наиболее широк у основания.

Основные морфометрические параметры (мм) добытого экземпляра следующие: длина головы и тела 59.0, длина хвоста 47.8, длина предплечья 50.3, длина уха 14.6, длина козелка 5.7, длина ступни 11.9, наибольшая длина черепа 20.7, кондилобазальная длина черепа 19.6, межглазничная ширина 4.7, ширина мозговой капсулы 9.1, наибольшая ширина черепа 10.8, длина верхнего ряда зубов 7.4, длина нижнего ряда зубов 8.2, длина нижней челюсти 15.3. В отличие от V. sinensis, у которого задний край передненёбной вырезки достигает линии, соединяющей передние грани больших переднекоренных зубов, у рассматриваемого экземпляра носовая вырезка небольшая, задний край передненёбной вырезки не достигает линии, соединяющей задние грани клыков (рис. 3).

Рис. 3.

Череп и нижняя челюсть Eptesicus pachyomus. Шкала 5 мм.

В настоящее время считается, что на востоке Азии обитает E. pachyomus (Tomes 1857), ранее рассматривавшийся в качестве подвида или группы подвидов E. serotinus (Simmons, 2005) и признаваемый самостоятельным видом большинством современных авторов (Juste et al., 2013). При этом отдельные авторы считают, что его статус пока окончательно не определен, поскольку данные анализа яДНК противоречат данным митохондриальной филогении и больше поддерживают гипотезу о существовании единого видового комплекса E. serotinus s. l. (Артюшин др., 2018).

В составе E. pachyomus выделяют четыре подвида – E. p. pachyomus (Tomes 1857), E. p. andersoni (Dobson 1871), E. p. horikawai (Kishida 1924) и E. p. pallens (Miller 1911) (Juste et al., 2013; Ruedi et al., 2018; Wilson, Mittermeier, 2019). К подвиду Eptesicus p. pachyomus относят кожанов, обитающих в Пакистане, Индии, Непале, Иране и, возможно, в Мьянме (Smith, Xie, 2008; Benda et al., 2012; Juste et al., 2013; Ades et al., 2018), к подвиду E. p. horikawai – кожанов, встречающихся на Тайване (Smith, Xie, 2008; Huang et al., 2020), к подвиду E. p. andersoni – кожанов, распространенных в Лаосе. А также в южных и юго-восточных провинциях Китая (Smith, Xie, 2008; Juste et al., 2013), к подвиду E. p. pallens – кожанов, обитающих в Корее, северо-восточных и центральных провинциях Китая (Smith, Xie, 2008; Jo et al., 2018).

По однотонной светло-каштановой окраске шерстного покрова (Allen, 1938), размерам тела и черепа (рис. 1, 3) добытая нами особь ближе к подвиду E. p. pallens.