1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биоорганическая химия
  4. T. 45, № 5, 2019

Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 5, стр. 524-533

Изменение протеомного профиля E. coli при удалении генов, кодирующих гистоноподобный белок HU: по данным дифференциального двумерного гель-электрофореза

Д. Э. Камашев 1, 2, *, Т. В. Ракитина 1, 3, Д. С. Матюшкина 4, Д. В. Евсютина 4, А. А. Ванюшкина 4, Ю. К. Агапова 3, В. Е. Анисимова 2, А. Л. Дробышев 2, И. О. Бутенко 4, О. В. Побегуц 4, Г. Ю. Фисунов 4

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/1, Россия

2 ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет)
119146, Москва, Большая Пироговская ул., 19 с.1, Россия

3 ФГБУ НИЦ “Курчатовский институт”
123098 Москва, пл. Академика Курчатова, 1, Россия

4 ФГБУ Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины федерального медико-биологического агентства
119435 Москва, Малая Пироговская ул., д. 1а, Россия

* E-mail: dkamashev@gmail.com

Поступила в редакцию 05.03.2019
После доработки 08.04.2019
Принята к публикации 13.05.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Гистоноподобный белок HU принадлежит к семейству белков, ассоциированных c бактериальным нуклеоидом (nucleoid associated proteins, NAPs) и является наиболее консервативным белком этого семейства. Он неспецифически связывает двуцепочечную ДНК и предпочтительно связывает ДНК, имеющую разрывы и изгибы. Белок HU пределяет архитектуру бактериального нуклеоида; его удаление ведет к потере жизнеспособности бактерий Bacillus subtilis и Mycoplasma genitalium, у которых отсутствуют другие белки семейства NAPs. Влияние белка HU на экспрессию генов известно из транскриптомных исследований, в которых были определены его регулоны. Генетическая делеция белка HU вызывает нарушение регуляции экспрессии генов в E. coli, при этом скорость роста бактерии в стандартных условиях почти не изменяется. Для того, чтобы понять, как бактерия противостоит беспорядочной экспрессии генов, мы предприняли сравнительный протеомный анализ клеток E. coli дикого типа и клеток, нокаутных по генам, кодирующим белок HU. Методом двумерного гель-электрофореза установлено, что в целом белковый профиль следует изменению профиля экспрессии генов. В то же время, обнаружено, что в некоторых случаях уровень экспрессии генов и представленность кодируемых белков меняются разнонаправленно, что указывает на необходимость дополнения транскриптомного анализа результатами протеомных исследований.

Ключевые слова: гистоноподобный белок, сравнительный протеомный анализ, дифференциальный двумерный гель-электрофорез, регуляция экспрессии

ВВЕДЕНИЕ

Нуклеоид-ассоциированные белки (NAPs) – это глобальные регуляторы топологии ДНК и экспрессии генов у бактерий [1–3]. Влияние NAPs на ДНК-топологию приводит к многочисленным эффектам в бактериальных клетках, включая изменения в регуляции транскрипции [1]. В кишечной палочке Escherichia coli известно двенадцать типов NAPs, отличающихся разной ДНК специфичностью; их гены обычно экспрессируются на высоком уровне по сравнению с другими генами, при этом уровень экспрессии зависит от фазы роста бактериальной культуры [2, 3].

Регуляторный эффект NAPs осуществляется путем модуляции компактизации ДНК, приводящей к обеспечению доступности свободных супервитков ДНК для транскрипционного комплекса [4, 5]. В настоящее время для E. coli и Salmonella enterica проведены несколько полногеномных исследований связывания NAPs c нуклеоидом бактерий и выявлено влияние такого связывания на транскрипцию [5–7].

Наиболее распространенный представитель семейства NAPs назвали HU от “H” – histone (гистон) и “U” – U93 по названию штамма E. coli, который в 70-х годах использовали для выделения бактериального нуклеоида [8, 9]. Основное свойство HU-белков – компактизация хроматина и регуляция суперспирализяции бактериальной хромосомы [1]. На самом деле, HU легко получить не только из штамма U93 E. coli, а также из любой бактерии. Кроме того, HU часто расшифровывают как heat unstable (неустойчивый при нагревании), тогда как, наоборот, за небольшим исключением, белки HU являются одними из самых термостабильных [10, 11]. Поэтому мы предлагаем для русской литературы другое название – хроматин-упорядочивающий (ХУ) белок, которое характеризует главное свойство этого гистоноподобного белка.

Мономер HU-белка имеет молекулярную массу около 10 кДа и состоит из компактного альфа-спирального домена и подвижного, в отсутствие ДНК, бета-складчатого ДНК-связывающего домена [10–12]. Белок HU способен образовывать димеры и именно в форме димера он связывает ДНК [13, 14]. В отличие от большинства ДНК-связывающих белков E. coli, которые узнают определенные последовательности ДНК (например, lac-репрессор [15]), белок HU связывает хромосомную ДНК бактерий без специфичности к последовательности [2, 16]. Аффинность связывания белка HU существенно увеличивается при наличии в ДНК дефектов, например, одноцепочечных вставок, разрывов или мисматчей [17–21].

Хотя бы один ген белка HU присутствует в большинстве бактериальных геномов, что делает его наиболее консервативным NAP [22]. Помимо регуляции транскрипции, репликации и рекомбинации посредством связывания с ДНК, функции HU распространяются и на контроль инициации трансляции за счет взаимодействия белка и РНК [23, 24].

В E. coli имеются два гена, hupA и hupB, кодирующих субъединицы альфа и бета белка HU; эти субъединицы относятся к родственным кластерам HU [14, 22, 25]. В большинстве бактерий белок HU кодируется одним геном. В E. coli делеция только одного гена, hupA или hupB, существенно не ухудшает рост бактерии. По сравнению с ними, штамм с делецией обоих генов, hupAB, очень чувствителен к воздействиям окружающей среды, таким как высокие и низкие температуры, высокая осмолярность, низкий уровень pH, облучение и т. д. [26–29].

Несмотря на почти универсальную консервативность белка HU в бактериальном царстве [22], исследования его влияния на экспрессию генов были проведены относительно недавно. Кластеризация данных микроматричного транскриптомного анализа, проведенная для трех штаммов E. coli с делециями генов, кодирующих белок HU: hupA, hupB и hupA/hupB (hupAB), во время экспоненциальной, переходной и стационарной фаз роста клеток, позволила идентифицировать регулоны hupA, hupB и hupAB, содержащие гены, задействованные в регуляции энергетического метаболизма, SOS-ответе и в ответах бактерии на изменения осмолярности и кислотный стресс [30]. Установив влияние белков HU на суперскрученность ДНК, авторы работы [30] тем не менее не обнаружили генов, регулирующих сверхспирализацию ДНК, в hup-регулонах. Более позднее микроматричное исследование штамма с двойной делецией hupA/hupB показало, что геномные локусы, кодирующие HU-белок-чувствительные гены, имеют тенденцию проявлять высокое связывание с ДНК-гиразой и, соответственно, повышенную чувствительность к сверхспирализации [31, 32]. Наконец, три регулона, определенные при исследовании трех штаммов (hupA, hupB и hupA/hupB) Salmonella имели разнородные наборы генов, дифференциально экспрессирующиеся на разных фазах роста [33].

В данной работе мы представляем результаты сравнительного протеомного профилирования клеток E. coli дикого типа и нокаутных по генам hupA и hupB, проведенного с помощью 2D-дифференциального электрофореза с последующей идентификацией белков посредством масс-спектрометрии, которые позволили выявить различия в представленности белков разных классов в E. coli дикого типа и E. coli, лишенной HU-белка. Мы демонстрируем, что изменения протеомного профиля сходны с изменением профиля экспрессии соответсвующих генов, однако изменение представленности некоторых белков не коррелирует с изменением уровня транскрипции соответствующих мРНК, что указывает на необходимость дополнения транскриптомного анализа результатами протеомных исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для исследования влияния белка HU на протеомный профиль бактерии, мы использовали штамм E. coli C600, называемый JO2057, происходящий из Института Пастера (Pasteur Institute, Париж) и полученный на его основе штамм JO3020 с делецией двух генов, кодирующих субъединицы альфа и бета белка HU (hupAB–) hupA::Cm, hupB::Km [30], любезно предоставленный Жаком Оберто из университета Париж-Сакле (Dr. J. Oberto, Université Paris-Saclay). Оба этих штамма ранее были использованы в транскриптомных исследованиях [30].

Определение скорости роста клеток штаммов JO2057 и JO3020, проводимое путем измерения оптической плотности через различные промежутки времени после разбавления суспензии бактерий свежей средой, показало, что в стандартной среде LB при 37°C оба штамма имеют сходную скорость роста. Этот результат согласуется с наблюдениями других исследователей, согласно которым E. coli с делетироваными генами, кодирующими белок HU, имеют множественные дефекты роста только при выращивании в измененных условиях культивирования [26–29].

Протеомные исследования, направленные на идентификацию белков, количество которых заметно различалось в двух указанных штаммах, проводили с использованием метода 2D-дифференциального электрофореза. Оба штамма, JO2057 и JO3020, растили в среде LB до поздне-логарифмической фазы роста. Клетки собирали центрифугированием и белки экстрагировали как описано в “Экспериментальной части”. Белковые экстракты метили цианинами согласно рекомендациям фирмы-изготовителя (Amersham): экстракт клеток дикого типа – зеленым флуоресцентным красителем CyDye3-DIGE, экстракт hupAB– клеток – красным флуоресцентным красителем CyDye5-DIGE. Перед смешиванием образцов и проведением 2D-гель-электрофореза, интенсивности флуоресценции образцов были выравнены. Для этого для обоих образцов по-отдельности проводили одномерный гель-электрофорез, сканировали гель и определяли значение общей интенсивности флуоресценции для каждого образца. Образцы смешивали в соответствующих пропорциях, проводили двумерный гель-элекрофорез, после чего гели сканировали при длинах волны лазера 532 и 633 нм и идентифицировали пятна, имеющие зеленый или красный цвет, который свидетельствовал о превышении количества белка в клетках дикого типа или в клетках hupAB– соответственно.

Результат сканирования типичного геля представлен на рис. 1. Белки, представленность которых заметно различалась в клетках дикого типа и клетках hupAB–, идентифицировали посредством MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Эксперимент был повторен дважды со сходными результатами.

Рис. 1.

Сравнение представленности белков у E. coli дикого типа и E. coli с делетированными генами, кодирующими белок HU, посредством двумерного электрофореза с дифференциальным окрашиванием цианинами. Флуоресцентно-меченные белковые лизаты E. coli дикого типа (Cy3, зеленый) и E. coli с делетированными генами, кодирующими белок HU (Cy5, красный), сравнивали путем проведения двумерного электрофореза и сканирования геля при длинах волны лазера 532 и 633 нм. Стрелками отмечены положения белков, количество которых различается в исследуемых образцах. Отмеченные стрелками районы вырезали из геля и идентифицировали находящиеся в геле белки.

Таким образом методом 2D-дифференциального электрофореза мы идентифицировали 27 белков, которые по сравнению с E. coli дикого типа, были более представлены в hupAB-мутанте и 61 белок, менее представленный в hupAB-мутанте. Списки белков, представленность которых в hupAB-мутанте увеличена и уменьшена, приведены в табл. 1 и 2, соответственно. Следует отметить, что большую часть белков с измененной представленностью (70%), составляют белки, представленность которых в клетках с делетированным белком HU уменьшилась.

Таблица 1.

Список генов, кодирующих белки E. coli, представленность которых в бактериях с делетированным белком HU (hupAB–) значимо увеличена по результатам 2D-дифференциального электрофореза и идентификации белка посредством трипсинолиза и MALDI-TOF-масс-спектрометрии

Код гена Ген Название белка Score pI Масса
Биосинтез аминокислот      
b3433 asd Aspartate-semialdehyde dehydrogenase 118 5.37 39 992
b2551 glyA Serine methylase 120 6.03 45 288
b0907 serC Phosphoserine aminotransferase 199 5.37 39 758
Метаболизм углеводов без ЦТК      
b0759 galE UDP-galactose 4-epimerase 91 5.89 37 242
b0755 gmpA Phosphoglyceromutase 144 5.85 28 539
b4034 malE Maltodextrin-binding protein 112 5.53 43 360
b0688 pgm Phosphoglucomutase 62 5.43 58 324
b1702 ppsA Phosphoenolpyruvate synthase 162 4.93 87 380
b2935 tktA Transketolase 1 135 5.38 71 189
ЦТК, метаболизм углеводов      
b1612 fumA Fumarate hydratase 124 6.11 60 260
Биосинтез нуклеотидов      
b2507 guaA GMP synthase 200 5.24 58 601
Ответ на стрессовые воздействия      
b0957 ompA Outer membrane protein A 134 5.59 36 282
b0436 tig Trigger factor 69 4.83 47 836
Метаболизм жирных кислот      
b3846 fadB 3-Hydroxybutyryl-CoA epimerase 60 5.84 79 486
b1395 paaH 3-Hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase 58 5.64 51 700
Трансляция и тРНК лигазы      
b4375 prfC Peptide chain release 81 5.66 59 536
b1866 aspS Aspartate–tRNA ligase 117 5.37 65 315
b1713 pheT Phenylalanine–tRNA ligase 242 5.12 87 377
b0026 ileS Isoleucine–tRNA ligase 130 5.66 104 215
b0642 leuS Leucine–tRNA ligase 97 5.16 97 140
b0930 asnS Asparagine–tRNA ligase 202 5.17 52 537
Транспортеры      
b4391 yjjK Uncharacterized ABC transporter ATP-binding protein 60 6.11 60 260
Другие пути      
b3926 glpK Glycerol kinase 53 5.36 56 195
b0565 ompT Protease A 60 5.76 35 540
b4371 rsmC Ribosomal RNA small subunit methyltransferase C 108 6 37 601
b2521 sseA 3-Mercaptopyruvate sulfurtransferase 95 4.86 26 135
b3407 yhgF Protein YhgF 98 5.92 85 067

Указаны названия генов, белков, достоверность идентификации (Score), изоэлектрическая точка белка (pI), и его масса.

Таблица 2.  

Список генов, кодирующих белки E. coli, представленность которых в бактериях с делетированным белком HU (hupAB–) значимо снижена по результатам 2D-дифференциального электрофореза и идентификации белка посредством трипсинолиза и MALDI-TOF-масс-спектрометрии

Код гена Ген Название белка Score pI Масса Эксп-рессия
Биосинтез аминокислот        
b2310 argT LAO-binding protein 82 5.22 26 991  
b1748 astC Succinylornithine transaminase 162 5.91 43 638  
b0032 carA Carbamoyl-phosphate synthetase 81 5.91 41 405  
b2309 hisJ Histidine-binding periplasmic protein 93 5.47 28 480  
b3617 kbl Glycine acetyltransferase 161 5.64 43 090  
b3708 tnaA Tryptophanase 261 5.88 52 740 Down
b1260 trpA Tryptophan synthase alpha chain 109 5.31 28 734  
b1261 trpB Tryptophan synthase beta chain 83 5.71 42 956  
b1262 trpC Tryptophan biosynthesis protein TrpC 76 5.51 49 330  
Метаболизм углеводов без ЦТК        
b1415 aldA Lactaldehyde dehydrogenase 144 5.07 52 240  
b2662 gabT GABA aminotransferase 108 5.87 45 718  
b1676 pykF Pyruvate kinase I 62 5.77 50 697  
b2416 ptsI Phosphotransferase system 117 4.71 55 200  
b2417 treD Glucose-specific phosphotransferase 55 4.73 18 240  
b2465 tktB Transketolase 2 75 5.86 73 025 UP
ЦТК, метаболизм углеводов        
b1276 acnA Aconitate hydratase 1 74 5.59 97 616  
b0720 gltA Citrate synthase 155 6.11 47 385 Down
b0724 sdhB Succinate dehydrogenase 155 6.16 26 716 Down
b1611 fumC Fumarase C 68 6.12 50 430  
b4014 aceB Malate synthase A 162 5.39 60 236 UP
b3236 mdh Malate dehydrogenase 152 6.22 27 508  
b0729 sucD Succinyl-CoA ligase 111 6.09 29 386 Down
Биосинтез нуклеотидов        
b2508 guaB IMP dehydrogenase 144 6.02 51 990 Down
b4005 purD Phosphoribosylamine–glycine ligase 138 4.96 45 911  
b2557 purL Phosphoribosylformylglycinamidine synthase 165 5.23 141 314  
b2476 purC Phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide synthase 72 5.07 26 978  
b4006 purH Phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase 75 5.51 57 345  
b4245 pyrB Aspartate transcarbamylase 98 6.12 34 406 Down
b2780 pyrG CTP synthetase 117 5.63 60 336  
Ответ на стрессовые воздействия        
b4213 cpdB 2',3'-Cyclic-nucleotide 2'-phosphodiesterase 149 5.36 56 179  
b0092 ddlB D-alanine–D-alanine ligase B 131 4.77 32 819  
b4383 deoB Phosphopentomutase 77 5.11 44 342 Down
b2579 yfiD Autonomous glycyl radical cofactor 62 5.09 14 275 Down
b1967 hchA Glyoxalase III 60 5.42 31 186 UP
b3619 hldD ADP-glyceromanno-heptose 6-epimerase 189 4.8 34 871  
b0473 htpG Chaperone protein HtpG 185 5.09 71 378  
b3942 katG Catalase-peroxidase (CP) 91 5.14 79 990 Down
b3229 sspA Stringent starvation protein A 151 5.22 24 289  
b1333 uspE Universal stress protein E 63 5.16 35 684  
Трансляция и тРНК лигазы        
b3340 fusA Elongation factor G 229 5.24 77 532  
b3339 tufA Elongation factor Tu 1 218 5.3 43 256  
b3168 infB Translation initiation factor IF-2 158 5.8 97 290  
b0911 rpsA 30S ribosomal protein S1 113 4.89 61 121  
b0169 rpsB 30S ribosomal protein S2 144 6.61 26 727  
b2114 metG Methionine–tRNA ligase 161 5.38 69 526  
b0194 drpA Proline–tRNA ligase 208 5.12 63 653  
b3871 typA Tyrosine phosphorylated protein A 126 5.16 67 313  
Транспортеры        
b1920 fliY Cystine-binding periplasmic protein 74 6.21 29 021 UP
b0809 glnQ Glutamine transport ATP-binding protein 71 6.08 26 714  
b1243 oppA Periplasmic oligopeptide-binding protein 111 6.05 60 861  
b3751 rbsB D-ribose-binding periplasmic protein 138 6.85 30 931  
Другие пути        
b2296 ackA Acetate kinase 66 5.85 43 263  
b0240 crl Sigma factor-binding protein 58 5.67 15 643  
b2133 dld D-lactate dehydrogenase 98 6.15 64 577  
b0356 frmA Alcohol dehydrogenase class-III 69 5.85 39 334  
b2091 gatD Galactitol-1-phosphate 5-dehydrogenase 59 5.94 37 366  
b2241 glpA G-3-P dehydrogenase 205 6.2 58 921 Down
b2242 glpB Anaerobic G3Pdhase B 77 5.75 45 328 Down
b1656 sodB Superoxide dismutase 138 5.58 21 253 Down
b2431 yfeX Probable deferrochelatase 175 5.34 33 031 Down
b3928 zapB Cell division protein ZapB 76 4.69 9397  

*  ЦТК, цикл трикарбоновых кислот.

Приведены названия белков, генов, достоверность идентификации (Score), изоэлектрическая точка белка (pI), и его масса. “UP” и “Down” указывают на увеличение и уменьшение экспрессии соответствующего гена, обнаруженное в работе [30].

Нами была предпринята попытка сравнения полученных результатов с ранее опубликованными данными о hup-зависимых транскриптомных изменениях [30]. Поскольку транскриптомное профилирование в указанной работе проводили с использованием микрочипов, не все гены E. coli были исследованы. Тем не менее, для 17 белков, у которых нами было отмечено значимое снижение представленности в нокаутных по белку HU клетках, имеются данные об изменении экспрессии соответствующих генов в той же (поздней логарифмической) фазе роста клеток JO3020. [30] (табл. 2). Из этих 17 генов экспрессия 13 генов значимо снижена в мутантных клетках, что показывает высокую степень корреляции результатов протеомных и транскрипционных исследований. В то же время экспрессия четырех генов повышена в мутантных бактериях, хотя анализ изменения протеома показывает снижение представленности кодируемых ими белков. Это можно объяснить регуляцией синтеза этих белков на уровне трансляции их мРНК. В других фазах роста (логарифмической и стационарной), исследованных в работе [30], профили экспрессии генов значительно отличались от поздне–логарифмической фазы роста и корреляции с результатами наших протеомных исследований не наблюдалось.

На рис. 2 представлено распределение белков, количество которых заметно меняется при отсутствии белка HU, по функциональным классам. Анализ диаграммы показывает, что при делеции генов, кодирующих гистоноподобный белок HU, представленность белков, отвечающих за регуляцию клеточного ответа на стрессовые воздействия, изменяется наиболее однонаправленно. Из 61-го белка, представленность которых снижена в hupAB-мутанте, семь белков (16%) отвечают за регуляцию клеточного ответа на стрессовые воздействия, тогда как более представлены только 7% (2 белка из 27). Данный факт хорошо согласуется с повышенной чувствительностью бактерий, лишенных белка HU, к стрессовым воздействиям, описанной литературе. Известно, что при воздействии повышенной температуры, высокой концентрации соли и кислоты, а также при ультрафиолетовом и гамма-облучении бактерии, лишенные белка HU, выдерживают значительно меньшие дозы воздействия [26–29].

Рис. 2.

Распределение по функциональным классам белков, представленность которых в отсутствие белка HU снижена (верхняя диаграмма) или повышена (нижняя диаграмма).

Мы также обнаружили, что в бактериях с делетированными генами, кодирующими белок HU, изменена представленность многих белков, участвующих в метаболизме углеводов. Так, среди белков, вовлеченных в цикл трикарбоновых кислот (ЦТК), 12% (семь белков из 61) менее представлены в бактериях с делетированными генами, кодирующими белок HU, и только 4% (1 белок из 27) более представлены (рис. 2). Это хорошо согласуется с исследованиями транскрипционного профиля мутантных бактерий, которые показали, что белок HU является регулятором экспрессии генов, кодирующих ферменты путей энергетического метаболизма и катаболических путей [30]. Данное наблюдение также подтверждается проведенным в работе Lazazzera et al. сравнением регулонов белка HU и белка FNR – сенсора, регулирующего метаболизм в анаэробных условиях [34].

Еще одну группу белков, представленность которых меняется в отсутствие HU белка составляют белки, ответственные за трансляцию и тРНК-лигазы, представленность которых меняется как в сторону увеличения, так и в сторону снижения (рис. 2).

В заключение отметим, что, хотя влияние отсутствия HU белка на транскриптомный профиль E. coli хорошо изучено [30–32], исследование HU-зависимых протеомных изменений проведено в нашей работе впервые. Необходимость уточнения и дополнения транскриптомных исследований результатами протеомного анализа диктуется тем, что именно протеомный профиль определяет эффективность метаболических процессов клетки [35, 36]. При этом количество белка регулируется не только на уровне транскрипции, что наглядно продемонстрировано в нашем исследовании. Результаты протеомного профилирования позволили определить функциональные классы белков, количество которых меняется в бактериях с делетированными генами, кодирующими белок HU. При этом направленность протеомных изменений в большинстве случаев совпадала с результатами транскрипционного профилирования.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Дифференциальный двумерный электрофорез

Перед постановкой двумерного электрофореза клеточный осадок (5 × 107 – 2 × 108 клеток) ресуспендировали в 10 мкл 50 мМ Трис-HCl-буфера, рН 8.0 и добавляли лизоцим (конечная концентрация 0.5 мг/мл). После одночасовой инкубации во льду к образцу добавляли 10 мкл смеси детергентов (30% СHAPS и 10% NP-40), 1 мкл смеси нуклеаз (Nuclease Mix, GE Healthcare) и инкубировали еще 1 ч при 4°С. Затем к образцу добавляли 100 мкл буфера для изоэлектрофокусирования (40 мМ Трис-НСl, рН 9.5, содержащий 8 М мочевину, 2 М тиомочевину, 4% CHAPS + NP-40). После 15 мин инкубации при комнатной температуре образцы центрифугировали 15 мин при 14 000 g. Супернатант отбирали и измеряли в нем концентрацию белка методом Бредфорд с помощью Quick start Bradford dye reagent (Bio-Rad). Мечение белков цианинами CyDye3-DIGE (зеленая флуоресценция) и CyDye5-DIGE (красная флуоресценция) проводили согласно рекомендациям фирмы-изготовителя (GE Healthcare). После остановки 45-минутной реакции связывания цианинов с белком с помощью 10 мМ раствора лизина, добавляли дитиотреитол до конечной концентрации 100 мМ и амфолины 3–10 до 1%.

Перед смешиванием двух сравниваемых образцов проводили электрофоретическое разделение каждого из них путем электрофореза в 12% ПААГ в денатурирующих условиях. После проведения электрофореза гель анализировали на сканере TyphoonTrio (GE Healthcare) при длинах волны лазера 532 нм (зеленая флуоресценция) и 633 нм (красная флуоресценция) и определяли значение общей интенсивности флуоресценции для каждого образца. Учитывая эти значения, два меченных разными цианинами образца смешивали в определенной пропорции с учетом выравнивания значений общей интенсивности флуоресценции для каждого из них. Изоэлектрофокусирование проводили в стеклянных 18-см трубочках в 4% ПААГ, содержащем 8 М мочевину, 2% амфолины (рН 3–10), 4% амфолины (рН 5–8), 6% смеси двух детергентов (30% CHAPS и 10% NP-40), 0.1% ТЕМЕД (тетраметилэтилендиамин), 0.02% персульфат аммония.

На трубочки со щелочного конца наносили по 200 мкг тотального белка. Изоэлектрофокусирование осуществляли в следующем режиме: 100 В – 200 В – 300 В – 400 В – 500 В – 600 В – по 45 мин, 700 В – 10 ч, 900 В – 1 ч. После завершения изоэлектрофокусирования гель выталкивали из трубочек и уравновешивали в течение 30 мин в буфере, содержащем 6 М мочевину, 30% глицерола, 62.5 мМ Трис-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 20 мМ дитиотреитол, бромфеноловый синий. Затем гель переносили на поверхность градиентного полиакриламидного геля (9–16%), и закрепляли 0.9% агарозой с бромфеноловым синим. Электрофорез проводили в Трис-глициновом буфере в следующем режиме: по 20 мА на стекло 20 мин, по 40 мА на стекло 2 ч, по 35 мА на стекло 2.5 ч. В процессе электрофореза температура камеры поддерживалась при 10°С. Полученные гели анализировали на сканере TyphoonTrio (Amersham) при длинах волны лазера 532 нм (зеленая флуоресценция) и 633 нм (красная флуоресценция). Для обработки изображений гелей использовали программу PDQuest (Bio-Rad). Затем гели окрашивали серебром для последующего вырезания белковых пятен и их идентификации.

Триптические пептидные экстракты для масс-спектрометрического анализа

Триптический гидролиз белка в ПААГ проводили следующим образом: к кусочку геля объемом 1 мм3 для удаления красителя добавляли раствор 15 мМ тиосульфата натрия и 50 мМ красной кровяной соли и инкубировали в нем гель пока его окраска не становилась желтой, затем раствор отбирали и кусочек геля отмывали в воде до прозрачного состояния. После удаления воды для дегидратации геля добавляли по 100 мкл ацетонитрила. Удалив ацетонитрил и высушив кусочек геля, добавляли к нему 3 мкл раствора трипсина (20 нг/мкл) в 40 мМ NH4HCO3 и 10% ацетонитриле, инкубировали сначала 1 ч на льду, а затем 16 ч при 37°С. Для остановки трипсинолиза и экстракции пептидов из геля к образцу добавляли 6 мкл 0.5% раствора трифторуксусной кислоты (TFA) и тщательно перемешивали. Полученный пептидный экстракт использовали для получения MALDI-масс-спектров.

Масс-спектрометрический анализ и идентификация белков

На мишени смешивали 2 мкл образца и 0.5 мкл раствора, содержащего 10 мг/мл 2,5-дигидроксибензойной кислоты, 20% ацетонитрила и 0.5% TFA. Полученную смесь высушивали на воздухе. Масс-спектры были получены на тандемном MALDI-времяпролетно-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером (Nd). Масс-спектры получены в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона; точность измеренных масс после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 0.007%, точность измеренных масс фрагментов 1 Да. Идентификацию белков осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск по “пептидному фингерпринту” проводили в базе данных NCBI среди белков E. coli (штамму С600) с указанной точностью с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха и возможной модификации цистеинов акриламидом.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 18-15-00061).

Работы с клетками E. coli дикого типа и нокаутными по белку HU проводили при финансовой поддержке НИЦ Курчатовский институт (приказ № 1606).

Список литературы

  1. Dillon S.C., Dorman C.J. // Nature Reviews. Microbiology. 2010. V. 8. P. 185–195.

  2. Azam T.A., Ishihama A. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 33105–33113.

  3. Azam T.A., Iwata A., Nishimura A., Ueda S., Ishihama A. // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 6361–6370.

  4. Dame R.T. // Mol. Microbiol. 2005. V. 56. P. 858–870.

  5. Travers A., Muskhelishvili G. // Curr. Opin. Genet. Dev. 2005. V. 15. P. 507–514.

  6. Kahramanoglou C., Seshasayee A.S.N., Prieto A.I., Ibberson D., Schmidt S., Zimmermann J., Benes V., Fraser G.M. // Nucleic Acids Res. 2012. V. 40. № 8. P. 3535.

  7. Luscombe N.M. // Nucleic Acids Res. 2011. V. 39. P. 2073–2091.

  8. Rouviere-Yaniv J., Gros F. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1975. V. 72. P. 3428–3432.

  9. Drlica K., Rouviere-Yaniv J. // Microbiol. Rev. 1987. V. 51. P. 301–319.

  10. Boyko K.M., Rakitina T.V., Korzhenevskiy D.A., Vlaskina A.V., Agapova Y.K., Kamashev D.E., Kleymenov S.Y., Popov V.O. // Sci. Rep. 2016. V. 3. P. 36366.

  11. Timofeev V., Altukhov A., Talyzina A., Agapova Yu., Vlaskina A., Korzhenevskiy D., Kleymenov S., Bocharov E., Rakitina T. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2018. P. 1–13

  12. Altukhov D.A., Talyzina A.A., Agapova Y.K., Vlaskina A.V., Korzhenevskiy D.A., Bocharov E.V., Rakitina T.V., Timofeev V.I., Popov V.O. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2018. V. 36. P. 45–53.

  13. Claret L., Rouviere-Yaniv J. // J. Mol. Biol. 1997. V. 273. P. 93–104.

  14. Pinson V., Takahashi M., Rouviere-Yaniv J. // J. Mol. Biol. 1999. V. 287. P. 485–497.

  15. Kamashev D.E., Esipova N.G., Ebralidse K.K., Mirzabekov A.D. // FEBS Lett. 1995. V. 13. P. 27–30.

  16. Benevides J.M., Danahy J., Kawakami J., Thomas G.J. // Biochemistry. 2008. V. 47. P. 3855–3862.

  17. Castaing B., Zelwer C., Laval J., Boiteux S. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 10291–10296.

  18. Kamashev D., Balandina A., Rouviere-Yaniv J. // EMBO J. 1999. V. 18. P. 5434–5444.

  19. Kamashev D., Rouviere-Yaniv J. // EMBO J. 2000. V. 19. P. 6527–6535.

  20. Kobryn K., LavoieB.D., Chaconas G. // J. Mol. Biol. 1999. V. 289. P. 777–784.

  21. Kamashev D., Oberto J., Serebryakova M., Gorbachev A., Zhukova Y., Levitskii S., Mazur A.K., Govorun V. // Biochemistry. 2011. V. 50. P. 8692–8702.

  22. Kamashev D., Agapova Y., Rastorguev S., Talyzina A.A., Boyko K.M., Korzhenevskiy D.A., Vlaskina A.,Vasilov R., Timofeev V.I., Rakitina T.V. // PLoS One. 2017. V. 12. P. e0188037.

  23. Balandina A., Claret L., Hengge-Aronis R., Rouviere-Yaniv J. // Mol. Microbiol. 2001. V. 39. P. 1069–1079.

  24. Balandina A., Kamashev D., Rouviere-Yaniv J. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 27622–27628.

  25. Kano Y., Wada M., Nagase T., Imamoto F. // Gene. 1986. V. 45. P. 37–44.

  26. Huisman O., Faelen M., Girard D., Jaffe A., Toussaint A., Rouviere-Yaniv J. // J. Bacteriol. 1989. V. 171. P. 3704–3712.

  27. Boubrik F., Rouviere-Yaniv J. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995. V. 92. P. 3958−3962.

  28. Álvarez A., Toledo H. // Helicobacter. 2017. P. e12381

  29. Li S., Waters R. // J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 3750−3756.

  30. Oberto J., Nabti S., Jooste V., Mignot H., Rouviere-Yaniv J. // PLoS One. 2009. V. 4. P. e4367.

  31. Berger M., Farcas A., Geertz M., Zhelyazkova P., Brix K., Travers A., Muskhelishvili G. // EMBO Rep. 2010. V. 11. P. 59–64.

  32. Prieto A.I., Kahramanoglou C., Ali R.M., Fraser G.M., Seshasayee A.S., Luscombe N.M. // Nucleic Acids Res. 2012. V. 40. P. 3524–3537.

  33. Mangan M.W., Lucchini S.O., Cróinín T., Fitzgerald S., Hinton J.C.D., Dorman C.J. // Microbiology. 2011. V. 157. P. 1075–1087.

  34. Lazazzera B.A., Beinert H., Khoroshilova N., Kennedy M.C., Kiley P.J. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 2762–2768.

  35. Alexeev D., Kostrjukova E., Aliper A., Popenko A., Bazaleev N., Tyakht A., Selezneva O., Akopian T., Prichodko E., Kondratov I., Chukin M., Demina I., Galyamina M., Kamashev D., Vanyushkina A., Ladygina V., Levitskii S., Lazarev V., Govorun V.J. // Proteome Res. 2012. V. 11. P. 224–236.

  36. Vanyushkina A.A., Fisunov G.Y., Gorbachev A.Y., Kamashev D.E., Govorun V.M. // PLoS One. 2014. V. 9. P. e89312.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биоорганическая химия

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал