Биоорганическая химия, 2022, T. 48, № 6, стр. 721-731

ВВЕДЕНИЕ

Функционирование эукариотического промотора – сложный процесс, включающий взаимодействие цис- и транс-регуляторных элементов промотора с факторами транскрипции (ФТ), ферментами транскрипционного комплекса и регуляторными РНК [1]. Существенную роль в регуляции транскрипции играют эпигенетические механизмы, такие как конформационные изменения хроматина, метилирование ДНК, модификации гистонов [2], а также физико-химические процессы, связанные с разделением фаз [3]. Однако в основе всей регуляции активности промоторов лежит связывание ФТ со специфическими последовательностями в ДНК и взаимодействие между факторами.

Всего в настоящее время известно более 1600 ФТ человека, их число постоянно растет, но для значительной части из них (более 500 факторов) неизвестны последовательности сайтов связывания с ДНК [4]. Существенная черта сайтов связывания ФТ – их вырожденность и перекрестное сродство разных ФТ к одной и той же последовательности ДНК [5]. Это обеспечивает вероятностную и конкурентную регуляцию транскрипции.

Особенности транскрипции генов наряду с перестройкой метаболизма в трансформированных клетках определяют способности опухолей расти, избегая контроля со стороны окружающих тканей и организма, поэтому изучение этих процессов имеет теоретическое и практическое значение для онкологии. Некоторые из известных ФТ рассматривают в качестве диагностических маркеров опухолей или их метастазов. Так, CDX2 – чувствительный маркер колоректальных аденокарцином, TTF1 – значимый маркер для аденокарцином легкого, PAX8 может служить маркером гинекологических опухолей и т.д. [6]. Поэтому изучение ФТ, в частности присутствия их профилей узнавания в промоторах, остается актуальным.

В настоящее время накопленные данные о структуре промоторов уже открывают большие перспективы для использования промоторов в практической медицине, например, в составе генно-инженерных векторов для генной терапии опухолей [7, 8]. Однако выбор оптимальных промоторов, а также поиск новых промоторов для генно-инженерных терапевтических векторов остаются нетривиальными задачами. В последнее время большой интерес к промоторам возобновился в связи с необходимостью создания вакцинных векторов для профилактики или терапии инфекционных заболеваний и рака [9, 10].

Ранее мы клонировали ряд промоторов генов, регулирующих пролиферацию клеток, которые проявляют опухолеспецифическую активность [11, 12] (табл. 1). Целью данной работы стал поиск особенностей этих промоторов, а также полученных из них химерных промоторов [13], которые обусловливают их повышенную активность в клетках опухолей. Для этого мы сравнили эти промоторы с набором промоторов генов домашнего хозяйства по составу известных профилей узнавания ФТ, а также провели поиск нуклеотидных мотивов de novo в промоторах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Профили, преобладающие в опухолеспецифических промоторах. Ранее мы показали, что относительно короткие (размером в сотни нуклеотидов) промоторы ряда генов (табл. 1), участвующих в регуляции пролиферации, обладают опухолеспецифической активностью [11, 12]. Известно, что в исследованных промоторах наиболее важные регуляторные элементы сосредоточены на участке приблизительно до –500 п.н. от точки начала транскрипции (TSS) [12, 14, 15]. Поэтому мы выбрали из базы эукариотических промоторов EPDnew семь последовательностей ДНК с координатами [‒499; +100] по отношению к точке начала транскрипции, которые соответствовали ранее исследованным опухолеспецифическим промоторам. Поскольку для некоторых из этих генов известно более одного промотора, мы отобрали только те промоторы, которые были исследованы в прямых экспериментах (табл. 1). Для сравнения мы использовали 23 промотора генов домашнего хозяйства такой же длины. С помощью программы CiiiDER [16] и базы профилей транскрипционных факторов JASPAR (http://jaspar.genereg.net/) [5] мы провели сравнение (enrichment) опухолеспецифических промоторов с промоторами генов домашнего хозяйства по составу профилей узнавания ФТ (рис. S1 в дополнительных материалах). При этом мы сопоставляли число промоторов в обеих группах, содержащих соответствующие профили ФТ; результат оценивали по критерию Манна–Уитни. Полные результаты сравнения промоторов приведены в табл. S1 в дополнительных материалах. В табл. 2 и S2 (см. дополнительные материалы) приведены профили ФТ, которые статистически значимо (p < 0.05) преобладают в опухолеспецифических промоторах по сравнению с промоторами генов домашнего хозяйства (далее – условно опухолеспецифические ФТ).

Из семи промоторов более других насыщены профилями ФТ этой группы промоторы MCM2 (13 профилей), CKS1B (10 профилей) и PLK1 (9 профилей) (табл. S3 в дополнительных материалах). Более чем в половине опухолеспецифических промоторов найдены профили узнавания факторов SREBF2, ZNF75D, Zfx (каждый в шести промоторах), RUNX2 и ETS2 (каждый в пяти промоторах), Creb3l2 (в четырех промоторах) (табл. 2). Для трех ФТ удалось выявить преимущественные зоны расположения в промоторах (рис. 1). Так, профили SREBF2 в четырех из семи промоторов расположены в области [–458; –384] относительно TSS на некодирующей цепи ДНК. Профили ZNF75D в четырех промоторах занимают область [–253; –184] относительно TSS также на некодирующей цепи ДНК и в трех промоторах вблизи TSS [–24; +30] на кодирующей цепи. Профили RUNX2 в четырех промоторах располагаются на кодирующей цепи в области [–414; –247].

Рис. 1.

Расположение профилей узнавания факторов транскрипции SREBF2, ZNF75D и RUNX2 в промоторах. Точки начала транскрипции (0) указаны в соответствии с базой эукариотических промоторов EPDnew. Жирные стрелки – Мотив 1.

Взаимодействие факторов транскрипции с промоторами. C помощью ресурса Pathway Сommons [17] мы построили сеть прямых регуляторных взаимодействий выявленных ФТ с продуктами исследованных опухолеспецифических генов (рис. 2). На схеме присутствует антиген пролиферирующих клеток PCNA, поскольку он взаимодействует с продуктами генов, промоторы которых мы исследовали. PCNA участвует в регуляции пролиферации клеток и обладает выраженной опухолеспецифической экспрессией [18]. Однако клонированный нами промотор PCNA [19] был активен как в опухолевых, так и в нормальных клетках [20], поэтому изначально он не был включен в дифференциальный анализ промоторов. В настоящей работе промотор PCNA (FP026732) рассматривается как неспецифический.

Рис. 2.

Прямые регуляторные взаимодействия между продуктами исследованных генов (в черных кружках) и факторами транскрипции (Pathway Commons): (а) – для условно опухолеспецифических факторов транскрипции; (б) – для условно неспецифических факторов транскрипции. Штрихпунктирные стрелки – регуляция экспрессии, штриховые стрелки – модификации, сплошная стрелка – контроль транспорта, штриховые линии без стрелок – связывание в комплекс.

Как видно на рис. 2а, MCM2 и PLK1 занимают центральное положение в данной регуляторной сети, что согласуется с наличием в их промоторах большого количества профилей условно опухолеспецифических ФТ. Факторы Creb3l2, CENPB, SIX1, ZNF75D, Zfx, HOXD11 и KLF11 в регуляторную сеть не вошли, хотя их профили узнавания присутствуют в опухолеспецифических промоторах значительно чаще, чем в промоторах генов домашнего хозяйства. Прямых данных о том, участвуют ли эти семь ФТ в регуляции исследованных промоторов, нет. Однако их отбор не кажется случайным, поскольку эти ФТ, согласно базе данных GEPIA2, демонстрируют дифференциальную экспрессию либо ассоциированы с определенным прогнозом в ряде опухолей (табл. S2 в дополнительных материалах) и, следовательно, могут играть важные роли в канцерогенезе.

Неспецифические факторы транскрипции. Дополнительно мы определили профили ФТ, которые чаще встречаются в промоторах генов домашнего хозяйства по сравнению с опухолеспецифическими промоторами (табл. S4 и S5 в дополнительных материалах, далее – условно неспецифические факторы). Следует отметить, что эти факторы также проявляют дифференциальную экспрессию и могут служить маркерами прогноза при некоторых опухолях. В то же время шесть из семи ФТ этой группы участвуют в развитии и дифференцировке клеток различного типа (Mafb [21], Arid3a [22], MEIS3 [23], BHLHA15 [24], BSX [25], E2F1 [26]). Фактор TBP имеет отношение к общим механизмам транскрипции [27]. Согласно Pathway Commons, только TBP и E2F1 напрямую взаимодействуют с продуктами исследованных опухолеспецифических генов (рис. 2б).

Поиск нуклеотидных мотивов de novo. Для улучшения поиска регуляторных последовательностей ДНК, характерных для опухолеспецифических промоторов, мы провели поиск мотивов de novo с помощью программы MEME Suite [28].

Мы провели дискриминационный поиск нуклеотидных мотивов в семи опухолеспецифических промоторах по отношению к промоторам генов домашнего хозяйства. Таким способом был выявлен Мотив 1 из 44 п.н., который присутствует во всех опухолеспецифических промоторах (рис. S2 в дополнительных материалах). Согласно тесту GOMO, функции Мотива 1 связаны с активностью обонятельных рецепторов, сенсорным восприятием запаха и сигнальным путем рецепторного белка, связанного с G-белком (G-protein coupled receptor protein signaling pathway). В шести из семи исследуемых промоторов Мотив 1 расположен приблизительно в области [–490; –210] по отношению к TSS. В промоторе CKS1B Мотив 1 расположен в области [–47; –4] в обратном направлении по отношению к ориентации промотора. Это может быть связано с двунаправленной природой промотора CKS1B/SHC1. Можно предположить, что Мотив 1 состоит из трех более коротких субмотивов. Поэтому мы проанализировали эти субмотивы отдельно, используя программу Tomtom из MEME Suite и базу данных ФТ позвоночных (табл. S6 в дополнительных материалах).

Так, субмотив 1a содержит профили узнавания энхансерных факторов миоцитов MEF2, которые могут активировать гены, индуцированные факторами роста и стрессом, и участвуют как в супрессии, так и в прогрессии рака в различных условиях [29]; профиль фактора forkhead E1, ассоциированного с раком щитовидной железы [30], и профиль транскрипционного фактора POU homeobox, который относится к главным (master) регуляторам мелкоклеточного рака легких [31]. Фактор NR2E1 также важен в канцерогенезе, т.к. он, в частности, связан с метастазированием рака молочной железы [32]. PHOX2B был определен как ключевой регулятор дифференцировки и поддержания стволовых свойств нейробластомы [33]. Sp100 представляет собой компонент ядерных телец промиелоцитарной лейкемии (PML) [34].

Субмотив 1b содержит профиль узнавания ретиноидных X-рецепторов (RXRs) и рецепторов ретиноевой кислоты (RARs) – ядерных рецепторов, которые опосредуют биологические эффекты ретиноидов, связанные с развитием опухолей [35]. Активация гена DMRT1 обнаружена при герминогенной неоплазии яичка [36]. Интерферон-регулирующий фактор 3 (IFN3) вовлечен в такие важные процессы, как противораковый иммунитет и устойчивость к некоторым бактериальным и вирусным инфекциям [37].

Субмотив 1c включает последовательность, отвечающую на cAMP (cAMP-response element) и способную связывать ФТ семейства CREB3, которые регулируют пролиферацию и миграцию раковых клеток [38], а также профиль фактора ATF6, участвующего в ответе на разворачивание белков (unfolded protein response), причем сверхэкспрессия ATF6 коррелирует с агрессивностью опухолей [39]. ZNF135 относится к мишеням регуляции дифференциально экспрессирующимися микроРНК в карциноме носоглотки [40].

Конечно, в составе Мотива 1 могут быть выявлены профили узнавания других ФТ, кроме перечисленных, а также неизвестных ФТ, по причине вырожденности. Тем не менее наши данные позволяют предположить, что Мотив 1 может быть характерен и для других опухолеспецифических промоторов.

Мы попытались найти другие промоторы, содержащие Мотив 1. Для этого мы просканировали 29 598 промоторов человека из базы данных промоторов EPDnew (все в координатах [–499; +100] относительно TSS) с помощью программы FIMO из пакета MEME Suite. Были найдены 4733 последовательности в обеих ориентациях с p < 0.0001, включая все семь исследуемых промоторов. Десять промоторов, содержащих наиболее близкие к Мотиву 1 последовательности, представлены в табл. 3. По данным The Human Protein Atlas, девять (90%) соответствующих им генов – прогностические маркеры опухолей (в основном, неблагоприятные). Примечательно, что расположение Мотива 1 в приведенных промоторах относительно TSS примерно соответствует таковому в семи исследованных опухолеспецифических промоторах.

Наиболее близкими к Мотиву 1 из семи исследованных промоторов оказались промоторы MCM2 и BIRC5. Отдельный анализ мотивов de novo в этих двух промоторах с помощью MEME Suite выявил консенсусный Мотив 2 длиной 184 п.н. в координатах [–579; –396] для MCM2 и [–496; –303] для BIRC5 относительно TSS (рис. S3 в дополнительных материалах). Интересно, что область сходства между промоторами MCM2 и BIRC5 заметно шире, она охватывает 296 п.н. и имеет одинаковый порядок более коротких мотивов. Мотив, похожий на Мотив 2, может быть выявлен и в других пяти промоторах с помощью FIMO, но с очень низкими оценками (данные не приведены). Поэтому мы считаем такое сходство особенностью промоторов MCM2 и BIRC5.

Анализ химерных промоторов. Мы исследовали химерные промоторы, которые обладали большей активностью в клетках эпидермоидной карциномы A431, чем в нормальных фибробластах (рис. S4 в дополнительных материалах) [13]. C помощью программы CiiiDER мы провели поиск условно опухолеспецифических и неспецифических профилей ФТ в химерных промоторах, а также в неспецифических промоторах CMV и PCNA. Профили Creb3l2, ETS2, HEY1, HEY2 и SREBF1 (var. 2) обнаружены только в химерных промоторах, обладающих повышенной активностью в клетках А431 (CH2, CH20, CH26, рис. S4 в дополнительных материалах), но отсутствуют в неспецифических промоторах CH10, CMV, PCNA (табл. S7 в дополнительных материалах). Все профили условно неспецифических ФТ, преобладающие в промоторах генов домашнего хозяйства (табл. S5 в дополнительных материалах), встречаются как минимум в одном из трех неспецифических промоторов (табл. S8 в дополнительных материалах).

Хотя это наблюдение вряд ли можно оценить статистически, мы склонны рассматривать его как тенденцию, которая подтверждает наши выводы, но требует дополнительной проверки. Только два химерных промотора, CH8 и CH16, содержат Мотив 1 длиной 44 п.н. в составе промоторного фрагмента POLD1 (данные не представлены).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Накопленные данные о структуре и функциях промоторов уже открывают большие перспективы для применения промоторов в практической медицине, например, в составе генно-инженерных векторов для генной терапии опухолей [7, 8]. Завершены клинические исследования генно-терапевтических конструкций, содержащих промоторы вирусов и человека (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01455259, NCT00891748, NCT00197522, NCT00051480; см. обзор Ginn et al. [8] и др.). Кроме генной терапии рака, природные промоторы могут использоваться в генно-инженерных векторах для лечения других заболеваний, в промышленности и различных биотехнологических процессах. Большой интерес к промоторам возобновился в последнее время в связи с необходимостью создания вакцинных векторов для профилактики или терапии инфекционных заболеваний и рака [9, 10]. Разрабатываются подходы с конструированием гибридных промоторов [41, 42] и химерных промоторов [13]. Поэтому исследование первичной структуры промоторов, в частности опухолеспецифических промоторов, остается актуальным.

В данной работе мы исследовали семь опухолеспецифических промоторов (табл. 1) по содержанию профилей узнавания известных ФТ. Несмотря на то что в регуляции транскрипции участвуют как прилежащие к TSS последовательности ДНК, так и отдаленные, было показано, что определенные регуляторные функции сохраняются в относительно коротких проксимальных промоторах, представляющих собой минимальные (core) промоторы с прилегающими цис-регуляторными элементами, общей длиной в несколько сотен нуклеотидов [43]. Это справедливо и для исследованных промоторов, в которых многие важные регуляторные элементы сосредоточены на участке приблизительно до –500 п.н. от TSS [12, 14, 15]. Такой размер промоторов удобен для генно-инженерных манипуляций с ними.

В ходе сравнения промоторов мы выявили 17 профилей узнавания ФТ, более частых в опухолеспецифических промоторах, чем в промоторах генов домашнего хозяйства (условно опухолеспецифические ФТ, табл. 2). В табл. S2 (см. дополнительные материалы) приведены профили узнавания данных факторов в соответствии с базой данных JASPAR [5]. Профили факторов SREBF2, ZNF75D, Zfx, RUNX2, ETS2 и Creb3l2 встречались более чем в половине опухолеспецифических промоторов. Остальные из 17 ФТ встречались в некоторых опухолеспецифических промоторах, но ни в одном из 23 промоторов группы сравнения. Нам также удалось определить преимущественные зоны расположения профилей узнавания факторов SREBF2, ZNF75D и RUNX2 в опухолеспецифических промоторах (рис. 1). Следует отметить, что промоторы CKS1B и PLK1, содержащие, соответственно, 10 и 9 профилей ФТ этой группы (табл. S9 в дополнительных материалах), ранее показали наибольшую опухолевую специфичность по сравнению с другими промоторами [12].

Ряд опухолеспецифических промоторов содержит профили узнавания ФТ, об участии которых в регуляции данных промоторов известно недостаточно. К таким факторам относятся Creb3l2, CENPB, SIX1, ZNF75D, HOXD11, Zfx и KLF11.

Возможно, наши результаты послужат доводом в пользу изучения роли данных ФТ в регуляции соответствующих генов.

Также мы выявили семь профилей ФТ, более представленных в промоторах генов домашнего хозяйства, чем в исследуемых промоторах (табл. S4 и S5 в дополнительных материалах). Шесть из семи ФТ этой группы участвуют в развитии и дифференцировке клеток различного типа (см. выше). Дифференцировку клеток часто рассматривают как процесс, обратный опухолевой трансформации, а также предлагают использовать для терапии опухолей [44]. Наши наблюдения указывают на неслучайность отбора ФТ по признаку неспецифичности в данном случае. В то же время дифференциальная экспрессия этих ФТ в некоторых опухолях и их связь с прогнозом (табл. S4 в дополнительных материалах) свидетельствуют о необходимости более глубокого изучения этого вопроса.

Очевидно, что связывание транскрипционного фактора с ДНК зависит не только от последовательности нуклеотидов, но и от многих других параметров – ориентации профиля, соседних последовательностей, взаимодействия данного ФТ с другими регуляторными молекулами и последовательностями и т.д. [43]. Кроме того, условно опухолеспецифические ФТ могут иметь отношение не столько к опухолевой трансформации клеток, сколько к пролиферативным функциям генов, и это различие следует изучить в каждом конкретном случае. Тем не менее полученные данные дают возможность более прицельно исследовать регуляцию промоторов в прямых экспериментах.

С помощью дискриминационного поиска мотивов de novo мы обнаружили последовательность из 44 п.н. (Мотив 1), которая присутствует во всех семи опухолеспецифических промоторах, но не характерна для промоторов генов домашнего хозяйства. В базе данных EPDnew мы нашли группу промоторов с таким мотивом, причем соответствующие им гены – это прогностические маркеры опухолей. Мы полагаем, что по крайней мере некоторые из этих промоторов могут обладать опухолеспецифической активностью.

Мы показали, что два промотора – BIRC5 и MCM2 – содержат очень близкий мотив из 184 п.н. Более того, область сходства между этими двумя промоторами распространяется на 296 п.н. Мы предполагаем, что такое сходство – скорее особое свойство этих двух промоторов, связанное с их регуляцией, чем типичная общая черта опухолеспецифических промоторов. Хотя это наблюдение представляет интерес, оно выходит за рамки нашего исследования.

Отчасти проверкой наших выводов может служить исследование профилей ФТ в химерных промоторах. Пять из 17 профилей условно опухолеспецифических ФТ, а именно профили Creb3l2, ETS2, HEY1, HEY2 и SREBF1 (var. 2), прошли селекцию на клетках A431 и были отобраны в химерных промоторах по признаку опухолевой специфичности [13]. Только два химерных промотора, CH8 и CH16, содержат Мотив 1 длиной 44 п.н., который был найден в семи нативных опухолеспецифических промоторах. В совокупности с другими данными это может означать, что наличие Мотива 1 в промоторе – достаточное, но не необходимое условие для опухолевой специфичности. Очевидно, эти вопросы требуют более глубокого изучения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Последовательности промоторов человека получены из базы данных EPDnew (Eucaryotic Promoter Database, https://epd.epfl.ch/EPDnew_database.php) [45] в координатах [–499; +100] по отношению к точке начала транскрипции (TSS) (табл. 1). Для поиска и сравнения профилей ФТ в промоторах, поиска мотивов de novo использовали программы CiiiDER [16], MEME Suite [28] (https://meme-suite.org/meme/) с параметрами по умолчанию и базы профилей узнавания транскрипционных факторов JASPAR (http://jaspar.genereg.net/) [5] и Jolma, 2013 [46]. Различия групп промоторов по частоте профилей ФТ оценивали по статистическому критерию Манна–Уитни, при этом в первую очередь учитывали показатели “significance score” и “gene р-value” (CiiiDER). Экспрессия ФТ в опухолях приведена по базе данных GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn/). Прогностическое значение ФТ в опухолях определяли по базе данных The Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/) [47]. Для построения сетей регуляторных взаимодействий использовали ресурс Pathway Commons (http://www.pathwaycommons.org/) [17].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показано, что исследованные опухолеспецифические промоторы отличаются от неспецифических промоторов генов домашнего хозяйства присутствием профилей узнавания 17 факторов транскрипции, а также мотива длиной 44 п.н., которые могут быть перспективными объектами исследования опухолеспецифической регуляции экспрессии генов. Присутствие данных последовательностей в каком-либо неизвестном промоторе может указывать на его опухолевую специфичность. Мы полагаем, что наши результаты могут способствовать выбору перспективных природных промоторов для использования в генно-инженерных противоопухолевых конструкциях, таких как векторы с генами-убийцами (killer genes) или векторные вакцины. Из семи исследованных промоторов более других насыщены профилями условно опухолеспецифических ФТ промоторы MCM2, CKS1B и PLK1, что согласуется с данными о значительной опухолевой специфичности этих промоторов [12]. Практическое значение могут иметь и некоторые химерные промоторы, полученные нами ранее [13].

Необходимо подчеркнуть, что выводы данной работы сделаны на основании теоретического анализа нуклеотидной последовательности промоторов. Мы рассматривали профили узнавания ФТ только как нуклеотидные мотивы с определенной вариабельностью. Поэтому все заключения относятся только к присутствию таких последовательностей в промоторах. Действительная роль факторов транскрипции в опухолеспецифической регуляции промоторов должна быть исследована в прямых экспериментах. Мы надеемся, что наша работа поможет лучше понять механизмы опухолеспецифической транскрипции генов и откроет новые возможности для создания искусственных промоторов и генно-инженерных векторов, применяемых в генной терапии опухолей.