Цитология, 2020, T. 62, № 6, стр. 396-402

Получение и характеристика эмбриональных стволовых клеток мыши с нокаутом по гену Pcbp1

Е. И. Бахмет 1*, С. В. Пономарцев 1, П. А. Дыбан 2, И. Б. Назаров 1, А. А. Кузьмин 1, Н. Д. Аксёнов 1, Е. В. Потапенко 1, М. Н. Гордеев 1, А. Н. Томилин 13**

1 Институт цитологии РАН
194064 Санкт-Петербург, Россия

2 Институт экспериментальной медицины
197376 Санкт-Петербург, Россия

3 Институт трансляционной биомедицины, Санкт-Петербургский Университет
199034 Санкт-Петербург, Россия

* E-mail: e.bakhmet@incras.ru
** E-mail: a.tomilin@incras.ru

Поступила в редакцию 19.02.2020
После доработки 27.02.2020
Принята к публикации 27.02.2020

Аннотация

KH-доменные PolyC-связывающие белки выполняют множество функций: от регуляции транскрипции до альтернативного сплайсинга. Существуют свидетельства важной роли этих белков в эмбриогенезе и в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК). ЭСК являются культивируемыми аналогами клеток эпибласта до имплантации и находятся в состоянии так называемой наивной плюрипотентности. Ранее нами было показано, что представители этого семейства белков – hnRNP-K, Pcbp1 и Pcbp2 – способны связываться с PolyC-сайтами регуляторных элементов гена Pou5f1, кодирующего ключевой для плюрипотентности фактор Oct4. Кроме того, в литературе представлены данные о раннем летальном фенотипе Pcbp1–/– эмбрионов мыши. Для исследования роли Pcbp1 в ЭСК нами были получены ЭСК с нокаутом по гену Pcbp1. В отличие от показанного нами ранее летального фенотипа hnRNP-K-дефицитных ЭСК, Pcbp1–/– ЭСК оказались жизнеспособны, продолжали экспрессировать фактор Oct4 и, в целом, сохраняли плюрипотентные свойства. Полученные результаты говорят о том, что Pcbp1 не нужен ни для регуляции экспрессии Oct4, ни для поддержания состояния наивной плюрипотентности. В последующих исследованиях будет проанализирована роль Pcbp1 в процессах перехода клеток в состояние праймированной плюрипотентности, а также дальнейшего выхода из него путем дифференцировки в клетки трех зародышевых листков.

Ключевые слова: Pcbp1, Oct4, hnRNP-K, эмбриональные стволовые клетки, плюрипотентность

DOI: 10.31857/S0041377120060024

Список литературы

  1. Назаров И.Б., Красноборова В.А., Миттенберг А.Г., Чихиржина Е.В., Давыдов-Синицын А.П., Лисковых М.А., Томилин А.Н. 2013. Исследование транскрипционной регуляции гена Oct4 (Pou5F1) через его дистальный энхансер. Т. 55. № 10. С. 697. (Nazarov I.B., Krasnoborova V.A., Mitenberg A.G., Chikhirzhina E.V., Davidov-Sinitzin A.P., Liskovykh M.A., Tomilin A.N. 2014. Transcription regulation of Oct4 (Pou5F1) gene by its distal enhancer. Cell Tiss. Biol. V. 8. P. 27.)

  2. Bakhmet E.I., Nazarov I.B., Gazizova A.R., Vorobyeva N.E., Kuzmin A.A., Gordeev M.N., Sinenko S.A., Aksenov N.D., Artamonova T.O., Khodorkovskii M.A., Alenina N., Onichtchouk D., Wu G., Schöler H.R., Tomilin A.N. 2019. hnRNP-K targets open chromatin in mouse embryonic stem cells in concert with multiple regulators. Stem Cells. V. 37. P. 1018.

  3. Boroviak T., Loo, R., Bertone P., Smith A., Nichols J. 2014. The ability of inner-cell-mass cells to self-renew as embryonic stem cells is acquired following epiblast specification. Nat. Cell Biol. V. 16. P. 516.

  4. Chia N.Y., Chan Y.S., Feng B., Lu X., Orlov Y.L., Moreau D., Kumar P., Yang L., Jiang, J., Lau M.S., Huss M., Soh B.S., Kraus P., Li P., Lufkin T. et al. 2010. A genome-wide RNAi screen reveals determinants of human embryonic stem cell identity. Nature. V. 468. P. 316.

  5. Choi H.S., Song K.Y., Hwang C.K., Kim C.S., Law P.Y., Wei L.N., Loh H.H. 2008. A proteomics approach for identification of single strand DNA-binding proteins involved in transcriptional regulation of mouse mu opioid receptor gene. Mol. Cell. Proteom. V. 7. P. 1517.

  6. Evans M.J., Kaufman M.H. 1981. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. V. 292. P. 154.

  7. Ghanem L.R., Kromer A., Silverman I.M., Chatterji P., Traxler E., Penzo-Mendez A., Weiss M.J., Stanger B.Z., Liebhaber S.A. 2015. The Poly(C) binding protein Pcbp2 and its retrotransposed derivative Pcbp1 are independently essential to mouse development. Mol. Cell. Biol. V. 36. P. 304.

  8. Hwang C.K., Wagley Y., Law P.Y., Wei L.N., Loh H.H. 2017. Phosphorylation of poly(rC) binding protein 1 (PCBP1) contributes to stabilization of mu opioid receptor (MOR) mRNA via interaction with AU-rich element RNA-binding protein 1 (AUF1) and poly A binding protein (PABP). Gene. V. 598. P. 113.

  9. Lynch M., Chen L., Ravitz M.J., Mehtani S., Korenblat K., Pazin M.J., Schmidt E.V. 2005. hnRNP K binds a core polypyrimidine element in the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) promoter, and its regulation of eIF4E contributes to neoplastic transformation. Mol. Cell. Biol. V. 25. P. 6436.

  10. Martin G.R. 1981. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. V. 78. P. 7634.

  11. Michelotti E.F., Michelotti G.A., Aronsohn A.I., Levens D. 1996. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K is a transcription factor. Mol. Cell. Biol. V. 16. P. 2350.

  12. Mikula M., Dzwonek A., Karczmarski J., Rubel T., Dadlez M., Wyrwicz L.S., Bomsztyk K., Ostrowski J. 2006. Landscape of the hnRNP K protein-protein interactome. Proteomics. V. 6. P. 2395.

  13. Morgani S., Nichols J., Hadjantonakis A.K. 2017. The many faces of pluripotency: In vitro adaptations of a continuum of in vivo states. BMC Dev. Biol. V. 17 : 7.

  14. Niwa H., Miyazaki J.-I., Smith A.G. 2000. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. V. 24. P. 372.

  15. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J., Agarwala V., Scott D.A., Zhang F. 2013. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. V. 8. P. 2281.

  16. Ritchie S.A., Pasha M.K., Batten D.J.P., Sharma R.K., Olson D.J.H., Ross A.R.S., Bonham K. 2003. Identification of the SRC pyrimidine-binding protein (SPy) as hnRNP K: implications in the regulation of SRC1A transcription. Nucl. Acid. Res. V. 31. P. 1502.

  17. Takahashi K., Yamanaka S. 2006. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. V. 126. P. 663.

  18. Thompson P.J., Dulberg V., Moon K.M., Foster L.J., Chen C., Karimi M.M., Lorincz M.C. 2015. hnRNP K coordinates transcriptional silencing by SETDB1 in embryonic stem cells. PLoS Genet. V. 11 : e1004933.

  19. Wang X., Kiledjian M., Weiss I.M., Liebhaber S.A. 1995. Detection and characterization of a 3' untranslated region ribonucleoprotein complex associated with human alpha-globin mRNA stability. Mol. Cell. Biol. V. 15. P. 1769.

  20. Zhang P., Wang N., Lin X., Jin L., Xu H., Li R., Huang H. 2016. Expression and localization of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K in mouse ovaries and preimplantation embryos. Biochem. Biophys. Res. Comm. V. 471. P. 260.

Дополнительные материалы отсутствуют.