Цитология, 2020, T. 62, № 9, стр. 638-653

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Культивирование клеток. В работе использовали линию клеток пигментного эпителия сетчатки взрослого человека ARPE-19, депонированную в УНУ “Коллекция клеточных культур для биотехнологических и биомедицинских исследований (общебиологического и биомедицинского направления)" (ККК УНУ Института биологии развития РАН, Москва). Для стабилизации культуры клетки после размораживания субкультивировали в течение трех пассажей при 37°С и 5% СО₂ в ростовой среде, состоящей из культуральной среды DMEM/F12 (Sigma-Aldrich, США), L-глутамина (2 мM; Sigma-Aldrich, США), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (PanBiotech, Германия) и 10% ЭТС (Gibco, США). Снятие клеток с подложки при пассировании проводили смесью растворов трипсина (0.25%) и версена (0.48 мМ; Gibco, Invitrogen, США) при объемном соотношении 1 : 3.

Для экспериментов клетки в концентрации 10⁴/см² высаживали на поверхность культуральных флаконов для адгезивных культур Т-25 Greiner CELLSTAR® (Greiner Bio-One GmbH, Германия) или в 6-луночные планшеты (Greiner Bio-One Gm-bH, Германия) в ростовой среде, состоящей из DMEM/F12, L-глутамина (2 мM), антибиотиков в стандартной концентрации, ЭТС (Gibco, США) и КС регенератов сетчаток тритонов. КС добавляли к ростовой среде в соотношении 1 : 1 с конечной концентрацией ЭТС 1%. В качестве контроля использовали клетки, культивированные в ростовой среде того же состава с 1% ЭТС, но без добавления КС. Изменения морфологии клеток изучали с помощью инвертированного микроскопа Olympus CKX31 (Япония) через 24, 48, 72 и 120 ч после посадки клеток. В течение всего срока культивирования среду не меняли. Фотографии получали с помощью микроскопа Olympus c цифровой камерой DP70.

Получение КС от регенерирующих сетчаток тритонов. Работа выполнена с соблюдением международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным. Использовали взрослых половозрелых тритонов Pleurodeles waltl в возрасте от 6 мес до 1 года, разводимых в аквариальной ИБР РАН. Тритонов наркотизировали в растворе MS-222 (1 : 1000; Sigma-Aldrich, США) в течение 10–15 мин до полной иммобилизации животного. Выделение глаз проводили в стерильных условиях с помощью микрохирургических инструментов. С помощью бинокулярной лупы выделяли сетчатку, полностью свободную от других тканей задней стенки глаза (пигментного эпителия, хороидальной и склеральной оболочек).

Образцы 2-х сетчаток помещали в стеклянные флаконы с 5 мл ростовой среды, состоящей из культуральной среды 199 (Биолот, Россия) и стерильной бидистиллированной воды в соотношении 70% среды 199 и 30% воды, 1 М буфера HEPES, 80 мг/л сульфата гентамицина и 10% ЭТС. Сетчатки культивировали в темноте при температуре 22–24°С в мини-роллере RM-1 (Elmi, Латвия) при скорости вращения 60 об./мин. Через 120 ч культивирования меняли среду на ростовую среду того же состава, но без ЭТС и культивировали еще 48 ч. Далее полученную КС стерилизовали через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм (Millipore, США), аликвотировали и хранили при −70°С. В работе использовали КС только от целых, не разрушенных регенерирующих сетчаток тритона.

Морфометрический анализ. Для оценки морфологических изменений клетки ARPE-19 высаживали в культуральные флаконы для адгезивных культур Т-25 Greiner CELLSTAR® (Greiner Bio-OneGmbH, Германия). После культивирования в течение 24, 48, 72 и 120 ч в присутствии КС или без нее (контроль) клетки фотографировали с помощью микроскопа Olympus (Япония) с цифровой камерой DP70 (Olympus, Япония). Затем из клеток выделяли тотальную РНК (см. ниже). Поскольку через 120 ч клетки достигали конфлюэнтного монослоя, что затрудняло проведение адекватного морфометрического исследования, оценку морфологии клеток ARPE-19 проводили на сроках 24, 48 и 72 ч по изображениям случайных полей зрения (формат JPEG, размер изображения 1360 × 1024 пикселей).

С помощью графического планшета и стилуса в программе ImageJ1.51j8 (Wayne Rasband, National Institute of Health, США) на изображениях вручную обводили каждую клетку, исключая двуядерные клетки и те, края которых соприкасались с границами изображения. Для каждого срока анализировали от 150 до 300 клеток, используя 4–16 микрофотографий независимых полей зрения с масштабным увеличением 200×. Программа автоматически рассчитывала площади проекций клетoк на подложке (далее площадь клетки). Площади клеток были рассчитаны в пикселях без перевода в метрические единицы измерения, поскольку для анализа были важны не абсолютные значения, а относительные. Дополнительно в программе CellsCount11f (Россия) проводили подсчет клеток. Для каждого срока анализировали от 1000 до 2000 клеток, используя 10–20 микрофотографий независимых полей зрения с масштабным увеличением 100×.

Оценка пролиферативной активности клеток РПЭ (МТТ-тест). Клетки высаживали на поверхность 96-луночных планшетов в концентрации 10⁴/см² и культивировали в течение 24 ч в отсутствие (контроль) и присутствии КС. Для оценки пролиферативной активности клеток за 3 ч до окончания срока культивирования в каждую лунку добавляли маточный раствор МТТ (5 мг/мл; Sigma Aldrich, США) в соотношении 1 : 10 по отношению к объему ростовой среды. По окончании инкубации удаляли ростовую среду, затем для извлечения из клеток образовавшегося темноокрашенного формазана добавляли 100 мкл ДМСО (Applichem, Германия) и ресуспендировали осадок. Анализ оптической плотности окрашенного раствора проводили на планшетном анализаторе StatFax 2100 (Awareness Technology Inc, США) при длине волны 545 нм и корректирующем фильтре 630 нм. Исследования проведены дважды по 16 повторностей на одно разведение вещества и (или) контрольную группу. Для вычисления средних значений оптической плотности окрашенных растворов и стандартных отклонений применяли программное обеспечение Excel 2013 (Microsoft Corporation, США). Пролиферативную активность клеток (%) оценивали по изменению средних значений оптической плотности растворов по отношению к контролю, принятому за 100%.

Иммуноцитохимическое исследование (ИЦХ). Клетки высаживали на круглые покровные стекла (CellStar, Германия) в 24-луночные планшеты (Greiner Bio-One GmbH, Германия) и после культивирования в отсутствие (контроль) или присутствии КС через 24, 48 и 72 ч фиксировали в течение 6 мин 4%-ным раствором параформальдегида (Sigma-Aldrich, США). Препараты хранили в смеси глицерина и этиленгликоля при −20°C до проведения ИЦХ-окрашивания.

Дифференцировку клеток оценивали по иммунофлуоресценции, используя первичные антитела к следующим белкам: коннексину 43 (Сх43; C6219, кроличьи, разведение 1 : 200; Sigma-Aldrich, США); цитокератину 8 (СК8; Mob 054-05, мышиные, 1 : 40, Diagnostic BioSystems, США); белку OTX2 (AV32439, кроличьи, 1 : 100; Sigma-Aldrich, США); βIII-тубулину (ab7751, мышиные, 1 : 200; Abcam, Великобритания); нейрофиламентам средней и тяжелой фракции (N2912, мышиные, 1 : 400, Sigma-Aldrich, США); β-катенину (ab32572, кроличьи, 1 : 200; Abcam, Великобритания); фибронектину (ab23750, кроличьи, 1 : 100; Abcam, Великобритания); виментину (ab8978, мышиные, 1:100; Abcam, Великобритания); коллагену типа I (ab34710, кроличьи, 1 : 100; Abcam, Великобритания), разведенные в 0.1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА; Sigma-Aldrich, США).

Препараты экспериментальной и контрольной групп клеток ARPE-19 обрабатывали параллельно для последующего проведения сравнительного анализа. ИЦХ-окрашивание включало в себя обработку 1%-ным БСА для блокировки неспецифического связывания, инкубацию с первичными антителами при 4°С в течение ночи, связывание первичных антител с соответствующими вторичными антителами, меченными флуорохромами AlexaFluor 488 или 594 (1 : 300; Molecular Probes, США) в течение 2 ч при комнатной температуре, заключение в среду c ядерным красителем DAPI (Vectashield; Vector Laboratories, США).

Оценку результатов ИЦХ-анализа и фотографирование клеток проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Keyence BZ-9000E (Япония). Интенсивность флуоресцентного сигнала и число клеток (ядер) оценивали с помощью программы ImageJ на цифровых изображениях препаратов (RGB, формат TIFF) с разрешением 1360 × 1024 пикселей по методике, описанной нами ранее (Кузнецова и др., 2019). Для маркерных белков Сх43, OTX2, фибронектина, коллагена I типа и βIII-тубулина вычисляли количественный индекс (QI) интенсивности флуоресценции по отношению средних значений интенсивности флуоресцентного сигнала (IntDen, в пикселях) к количеству клеток (ядер) ARPE-19 (Takeuchi et al., 2012). Для СК8 подсчитывали долю положительно окрашенных клеток, используя программу CellsCount11f (Россия). Для каждого срока анализировали от 400 до 900 клеток, используя 8–12 микрофотографий независимых полей зрения с масштабным увеличением 200×. В случае β-катенина, локализующегося по цитоплазматической мембране и в цитоплазме, подсчитывали клетки, имеющие цитоплазматическое распределение гранул β-катенина, используя ту же программу. Для каждого срока анализировали от 300 до 700 клеток, используя 4–7 микрофотографий независимых полей зрения с масштабным увеличением 200×. Определяли число клеток, не содержащих гранул β-катенина и содержащих единичные или множество гранул этого белка.

Количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР). Подготовку проб, а также выделение тотальной РНК из культур клеток и кПЦР проводили по методике, описанной нами ранее (Шафеи и др., 2017; Кузнецова и др., 2018, 2019). Методом кПЦР оценивали изменения уровня экспрессии мРНК следующих генов транскрипционных факторов, сигнальных белков и маркеров дифференцировки: OCT4, NANOG, PAX6, OTX2, MITF, KRT18, βIII-тубулин (TUBB3), COL1A1, CTNNB1, GSK3B, KLF4, SPP1, RUNX2, FGF2, FGFR1, SMAD4, SMAD5, IGFR1 (праймеры и зонды от компании ДНК-Синтез, Россия), NES, BMP2, BMP4, CCND1 (циклин D1) (Applied Biosystems, США). В качестве эндогенного контроля использовали ген домашнего хозяйства GAPDH (праймеры и зонд от компании ДНК-Синтез, Россия). Праймеры и зонды представлены в табл. 1.

Смесь реагентов для кПЦР (25 мкл) включала 2 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTPs, 1 Ед Maxima HS Taq-полимеразы (Fermentas, Латвия), 5 мкл разведенной кДНК (эквивалентной 4 нг исходной тотальной РНК), 250 нM праймеров и 250 нM зонда. Реакцию проводили на приборе LightCycler®96System (Roche, Швейцария). Программа для ПЦР включала: 1 цикл денатурации при 95°C 3 мин, 40 циклов денатурации при 95°C 15 с и совмещенный этап отжига–синтеза при 60°C 1 мин. Пороговый цикл определяли, применяя программное обеспечение LightCycler® 96 Application Software Version 1.1 (Roche, Швейцария). Количество мРНК каждого исследованного гена в образцах оценивали в 3-х повторностях. Обработка данных кПЦР включала усреднение значений Ct для повторных точек в эксперименте, расчет значений относительной экспрессии исследуемых генов методом ΔΔCt для каждого образца с использованием значения Ct по гену GAPDH в качестве нормирующего.

Статистический анализ. Статистическую обработку полученных показателей, вычисление средних значений и ошибки среднего проводили с помощью программы Excel 2013 (Microsoft Corporation, США). Достоверность различий средних величин устанавливали с помощью t-критерия Стьюдента при уровне значимости P < 0.01 или P < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Морфология клеток. После воздействия КС в клетках ARPE-19 наблюдали морфологические отличия от контрольных клеток, имеющие место на протяжении всего срока эксперимента (рис. 1а). Так, через 24 ч после трипсинизации клеток ARPE-19 и посадки их на твердый субстрат доля распластанных клеток была выше в группе клеток, культивированных в ростовой среде с КС. Тогда как значительная доля контрольных клеток к этому моменту наблюдения оставалась округлой формы. На более поздних сроках культивирования (48–120 ч) клетки в экспериментальной группе также оставались более вытянутыми.

Рис. 1.

Изменение морфологии (а) и морфологических параметров (б, в) клеток ARPE-19 в различные временные промежутки после добавления в среду культивирования кондиционированной среды (КС) регенератов сетчаток тритонов. а – Фазовый контраст, прижизненная микроскопия; б – средние значения площади клеток (в пикселях) в отсутствие (контроль, черные столбики) и в присутствии КС (серые столбики) и их ошибки (вертикальные отрезки), *P < 0.01; в – распределение клеток по размеру площади, выраженное в %. Разными цветами обозначены значения площади клеток в пикселях ×1000.

Под действием КС наблюдали изменения и в формировании колоний. Клетки контрольной группы формировали эпителиоидные колонии, в центральной части которых преобладали клетки кубовидной или полигональной формы, в маргинальной зоне – вытянутые, при этом клетки в колониях плотно прилежали друг к другу (рис. 1а). Клетки в среде с КС формировали рыхлые, неупорядоченные колонии. Следует сказать, что, несмотря на возможные различия составов разных партий КС из-за отличий животных по возрасту (от 6 мес. до 1 г.), полу и размеру, изменения морфологии в клетках ARPE-19 были сходны.

Результаты количественного анализа представлены на рис. 1б, в. Они показывают изменения морфологических параметров клеток ARPE-19 после воздействия КС с течением времени по сравнению с контролем. На всех сроках наблюдения средние значения площади клеток в эксперименте выше, чем в контроле (рис. 1б), однако их различия с течением времени постепенно уменьшаются: в 1.99 (24 ч), 1.43 (48 ч) и 1.36 (72 ч) раза. Увеличение площади клеток свидетельствует об изменении их размера и (или) появлении субпопуляций (пула) клеток большего размера под влиянием КС, что подтверждается при анализе распределения клеток ARPE-19 по площади (рис. 1в). Так, через 24 ч после воздействия КС отмечается увеличение доли клеток среднего (рис. 1в) и крупного размера (рис. 1в), тогда как доля клеток мелкого размера (рис. 1в) уменьшается. Известно, что малые размеры клеток коррелируют со стволовостью и, наоборот, увеличение размера клеток коррелирует с фенотипом дифференцированных клеток (Li et al., 2015).

Пролиферативная активность. Пролиферация является естественным процессом для клеток in vitro, однако темпы пролиферации могут зависеть от условий культивирования. Наблюдение за клетками ARPE-19 на светооптическом уровне показало увеличение их числа с течением времени культивирования от момента посадки (рис. 1а), что подтверждает количественный анализ на микрофотографиях в программе CellsCount11f (рис. 2а). Это свидетельствует о том, что клетки продолжают делиться как в контроле, так и в экспериментальной группе. Кроме того, как в контроле, так и в эксперименте наблюдали митотические фигуры при окраске красителем DAPI. Однако темпы пролиферации различались в контроле и под действием КС. Число клеток ARPE-19 после воздействия КС было статистически ниже, чем в контроле во временном промежутке 24–72 ч, и это различие постепенно увеличивалось с течением времени: на 17.7 (24 ч), 20.8 (48 ч) и 22.2% (72 ч).

Рис. 2.

Среднее число клеток ARPE-19 (а) на микрофотографиях независимых полей зрения в разные промежутки времени после добавления в среду КС (серые столбики), а также их пролиферативная активность (б) через 24 ч после добавления КС (серый столбик). Черные столбики – контроль. Клетки считали в программе CellsCount11f (Россия), пролиферативную активность определяли по МТТ-тесту. Вертикальные отрезки – ошибки среднего, *P < 0.01. по сравнению с контролем.

Данные количественного анализа числа клеток ARPE-19 в присутствии КС указывают на снижение темпов пролиферации и совпадают с результатами МТТ-теста, проведенного на сроке 24 ч (рис. 2б). Таким образом, КС при добавлении в среду культивирования понижала пролиферативную активность клеток ARPE-19 человека в период культивирования от 24 до 72 ч, что сходно с поведением клеток тритона во время их трансдифференцировки (Chiba et al., 2006; Yasumuro et al., 2017). Чтобы понять основные механизмы морфологических изменений в клетках ARPE-19, наблюдаемых после культивирования с КС, были проведены ИЦХ-анализ и кПЦР.

ИЦХ-анализ. Мы оценили маркеры РПЭ и других возможных дифференцировок – нейральной и мезенхимной, поскольку это наиболее частые пути трансдифференцировки клеток РПЭ (Salero et al., 2012). В качестве маркеров РПЭ мы использовали белок щелевых контактов Cх43 и белок цитоскелета СК8. В клетках ARPE-19 отмечали снижение интенсивности иммунофлуоресцентного сигнала от Cx43 через 24, 48 и 72 ч после воздействия КС по сравнению с контрольными клетками тех же сроков (рис. 3а). Определение количественного индекса (QI) интенсивности флуоресцентного сигнала в целом подтвердило нашу визуальную оценку и показало, что интенсивность сигнала была более чем в 5 раз ниже на сроках 24 и 72 ч (рис. 3б). Снижение интенсивности окрашивания белка межклеточных контактов Cx43 свидетельствует о потере большинством клеток РПЭ эпителиальной морфологии под действием КС.

Рис. 3.

Изменения интенсивности свечения белков Cx43 и βIII-тубулина в клетках ARPE-19 через 24, 48 и 72 ч после воздействия КС: а – двойное иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью специфических антител на Cx43 (красное свечение) и βIII-тубулин (зеленое свечение); ядра окрашены DAPI (синее свечение); об.: 40×. б – Количественный индекс (QI) интенсивности флуоресцентных сигналов после воздействия КС по отношению к контролю, принятому за 1 (штриховая линия). Вертикальные отрезки – ошибки среднего, *P < 0.05.

С течением времени культивирования в контрольных клетках ARPE-19 происходило снижение доли клеток, окрашенных на СК8, которая составляла 8.9% (24 ч), 1.7% (48 ч) и 0.8% (72 ч), что говорит о дедифференцировке клеток in vitro по мере культивирования. Изменения же количества СК8-позитивных клеток ARPE-19 после воздействия КС не выявлено (рис. 4а). Однако по сравнению с контролем отмечено увеличение доли таких клеток относительно общего количества с течением времени культивирования (рис. 4б), что свидетельствует о том, что часть клеток под действием КС сохраняет свои эпителиальные характеристики.

Рис. 4.

Изменения интенсивности свечения белков OTX2 и СК8 в клетках ARPE-19 через 24, 48 и 72 ч после воздействия КС: а – двойное иммунофлуоресцентное окрашивание на OTX2 (красное свечение) и CК8 (зеленое свечение), ядра окрашены DAPI (синее свечение), об.: 40×. б – Изменение количества СК8⁺-положительных клеток по отношению к контролю, принятому за 1 (штриховая линия). Вертикальные отрезки – ошибки среднего, *P < 0.05.

Анализ ИЦХ-окрашивания антителами против βIII-тубулина, маркера ранней стадии дифференцировки нейронов сетчатки, выявил увеличение числа маркированных клеток через 24 и 72 ч после воздействия КС по сравнению с контролем (рис. 3а, б). Различий в иммуноокрашивании антителами против средних и тяжелых цепей нейрофиламентов на сроках 24 и 48 ч не обнаружено. Достоверных различий в окрашивании на маркер РПЭ и нейроэпителия OTX2 в клетках ARPE-19 под действием КС по сравнению с контролем не выявлено (рис. 4а).

Оценка маркеров мезенхимной дифференцировки выявила усиление окрашивания на белок внеклеточного матрикса фибронектин через 24 и 48 ч после воздействия КС (рис. 5). Другой белок внеклеточного матрикса, коллаген I типа, характерный для развития эпителиально-мезенхимного перехода (ЭМП), окрашивался слабоположительно как в контрольной, так и в экспериментальной группе. Значимых различий при этом не выявлено.

Рис. 5.

Иммунофлуоресцентное окрашивание на фибронектин (красное свечение) в клетках ARPE-19 через 24 и 48 ч после воздействия КС. Ядра окрашены DAPI (синее свечение). Об.: 40×.

При визуальной оценке окрашивания на β-катенин (белок адгезионных контактов и центральный медиатор канонического Wnt-сигнального пути) через 24 ч после воздействия КС отмечали увеличение числа клеток с гранулярным цитоплазматическим окрашиванием, которое увеличивалось к 48 ч и сохранялось до 72 ч наблюдения, что подтверждено количественным анализом (рис. 6а). Перераспределение β-катенина в клетке и изменение его локализации с цитоплазматической мембраны на внутриклеточное говорит об ослаблении межклеточной адгезии и объясняет появление рыхлых колоний.

Рис. 6.

Количественная оценка распределения гранул β-катенина в цитоплазме клеток ARPE-19 (а) и примеры иммунофлуорисцентного окрашивания на β-катенин (красное свечение), демонстрирующие его отсутствие (б), единичные (в) и множественные (г) гранулы в цитоплазме. а – Число клеток, не содержащих гранул (Нет) и содержащих единичные гранулы (Ед.) или множество их (Мн.) через 24, 48 и 72 ч после добавления в среду КС по сравнению с контролем, в %.

Результаты кПЦР. Через 24 ч после воздействия КС на клетки ARPE-19 отмечено увеличение уровней мРНК гена-маркера пронейральной дифференцировки TUBB3 более чем в 1.6 раза (рис. 7) и специфического регулятора перехода G₁/S-фазы в клеточном цикле циклина D1 (CCND1) в 1.7 раза по сравнению с контролем (рис. 7). На этом же сроке по сравнению с контролем наблюдается снижение уровней мРНК OTX2 в 3.6 раза, маркера РПЭ гена BMP4 – в 3.5 раза и BMP2 – в 1.7 раза (рис. 7б). При этом по сравнению с контролем, принятым за единицу, отмечается увеличение уровня экспрессии мРНК SMAD5, участвующего в передаче сигналов белков семейства BMP, в 1.5 раза (рис. 7), тогда как изменения уровня экспрессии мРНК транскрипционного фактора SMAD4, медиатора трансдукции сигналов BMP и TGF-β, не выявлено (рис. 7). Кроме того, на этом же сроке наблюдается увеличение уровня экспрессии мРНК трансмембранного рецептора IGFR1 в 1.5 раза (рис. 7) и незначительное снижение уровня экспрессии мРНК FGFR1 при увеличении уровня экспрессии мРНК bFGF более чем в 1.4 раза по сравнению с контролем (рис. 7). Следует отметить, что на этом же сроке отмечается экспрессия мРНК гена-маркера белка внеклеточного матрикса COL1A1 по сравнению с контролем, где его экспрессия не детектируется. Уровень экспрессии мРНК RUNX2, ключевого фактора транскрипции, связанного с дифференцировкой остеобластов, в клетках ARPE-19 после воздействия КС был ниже в 1.4 раза, чем в контроле (рис. 7). В то же время, экспрессия SPP1, кодирующего секретируемый фосфопротеин 1/остеопонтин (белок, участвующий в формировании костной ткани), не детектировалась ни в контрольных, ни в экспериментальных группах клеток ARPE-19. Таким образом, мы установили отсутствие остеогенной дифференцировки ARPE-19 под действием КС.

Рис. 7.

Изменение профиля экспрессии генов клеток ARPE-19 под действием КС регенератов сетчаток тритонов относительно соответствующего контроля (в отсутствии КС), принятого за единицу (штриховая линия).

кПЦР подтвердил экспрессию в клетках ARPE-19 взрослого человека генов OCT4 и NANOG. Экспрессия этих генов-маркеров плюрипотентности в контрольных клетках постоянной линии РПЭ человека невысока (рис. 7). OCT4 в кПЦР определяется после 35-го цикла амплификации кДНК, а NANOG – после 38-го цикла, что свидетельствует об их неактивности (Lengner et al., 2007). Через 48 ч после воздействия КС отмечено снижение уровней мРНК OCT4 в 3.4 раза и NANOG – в 1.7 раза, что косвенно свидетельствует о дифференцировочных процессах, происходящих в клетках ARPE-19 под действием КС тритонов. Кроме того, на этом же сроке кПЦР-анализ показал снижение в 1.5 раза уровней мРНК KLF4 и GSK3B (гена киназы гликогенсинтазы-3β, GSK3β) с сохранением на низком уровне мРНК генов ВМР2 и ВМР4 по сравнению с контролем (рис. 7).

Через 72 ч по сравнению с контролем выявляется снижение уровня мРНК NES в 2 раза, PAX6 и TUBB3 – в 1.5 раза, KRT18 – в 1.7 раза с сохранением на низком уровне мРНК генов NANOG и KLF4 (рис. 7). Через 120 ч наблюдения на низком уровне сохраняются мРНК генов TUBB3, KRT18, ВМР2 и ВМР4 и отмечается подъем уровней мРНК генов OTX2 в 1.5 раза и MITF в 1.3 раза (рис. 7).

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты морфологического и морфометрического исследований показали изменения морфологии клеток линии РПЭ человека ARPE-19, проявляющиеся в изменении их формы и увеличении их размеров в течении 120 ч культивирования после воздействия КС регенератов сетчаток тритонов. По данным литературы известно, что по мере увеличения размера клеток увеличивается содержание рибосом и скорость синтеза белка (Mueller, 2015). В то же время результаты проведенного нами впервые количественного исследования наглядно продемонстрировали неоднородность клеточной популяции линии ARPE-19 человека по морфологическим параметрам, что дополняет наблюдения, представленные в ранее опубликованных работах, выполненных на первичном материале (Burke, Hjelmeland, 2005; Al-Hussaini et al., 2008).

Результаты ИЦХ-исследования показали снижение интенсивности окрашивания клеток на белок щелевых контактов Сх43 и перераспределение β-катенина по сравнению с контролем. Так, во временном отрезке культивирования 24–48 ч отмечалось увеличение доли клеток, имеющих внутриклеточную локализацию β-катенина. Поскольку β-катенин является не только центральным медиатором канонического Wnt-сигнального пути (Katoh, Katoh, 2006), но и белком адгезионных контактов (Nelson, Nusse, 2004), это наблюдение совместно с результатами окраски на белок Сх43 говорит об ослаблении межклеточной адгезии и объясняет появление рыхлых колоний под действием КС. Снижение через 24 ч после воздействия КС экспрессии OTX2, маркера предшественников РПЭ, и BMP4, участвующего в определении ранней специализации клеток РПЭ из нейроэпителия (Wordinger, Clark, 2007), свидетельствует наряду с ослаблением межклеточных контактов о частичной потере эпителиальной дифференцировки.

Снижение интенсивности окрашивания на β-катенин по цитоплазматической мембране в клетках ARPE-19 сопровождалось сохранением уровня экспрессии его гена (CTNNB1) одновременно со снижением уровня экспрессии GSK3B. В отсутствие Wnt-сигнализации GSK3β препятствует стабилизации и накоплению β-катенина в цитоплазме. При активации Wnt-сигнального пути накопленный β-катенин мигрирует в ядро, где взаимодействует с мишенями Wnt, регулирующими экспрессию многих генов (Cadigan, 2012). Кроме того, в ARPE-19 под действием КС наблюдали увеличение экспрессии гена коллагена I типа COL1A1, но усиления синтеза белка при ИЦХ-окрашивании не выявлено. Однако отмечено усиление иммуноокрашивания на белок внеклеточного матрикса фибронектин.

Рассматриваемые вместе эти изменения указывают на возможный ЭМП клеток РПЭ и активацию канонического Wnt-сигнального пути. Связь между ЭМП и активацией Wnt/β-катенинового пути показана при эмбриональном развитии и регенерации (Han et al., 2015; Bosada et al., 2016). Нарушение межклеточных контактов и реорганизация цитоскелета, о которых свидетельствуют изменения морфологии клеток и появление рыхлых колоний, являются одними из ранних событий ЭМП (Miyazono, 2009). Клетки, подвергшиеся ЭМП, приобретают мезенхимоподобный фенотип, характеризующийся экспрессией соответствующих белков цитоскелета (в частности виментина) и повышенным отложением белков внеклеточного матрикса, включая коллаген I типа и фибронектин (Lee et al., 2001; Feist et al., 2014; Che et al., 2016).

ИЦХ-окрашивание на виментин не выявило значимых различий между контрольной и экспериментальной группой. Однако виментин не является надежным показателем для выявления ЭМП в культуре РПЭ, поскольку различные виды эпителия экспрессируют его в культуре (Pieper et al., 1992). Кроме того, виментин экспрессируется в тканях, регенерирующих после повреждения (Witzgall et al., 1994). Часто процесс регенерации связан с возвращением клеток к менее дифференцированному фенотипу (Witzgall et al., 1994).

Как и РПЭ низших позвоночных, РПЭ человека может быть репрограммирован в нейральном направлении (Salero et al., 2012; Li et al., 2019), однако для этого требуются дополнительные манипуляции, в то время, как у низших позвоночных трансдифференцировка РПЭ является естественным процессом (Григорян и др., 2013). У низших позвоночных трансдифференцировка происходит через стадию специфических мультипотентных клеток, сохраняющих некоторые свойства РПЭ. В процессе трансдифференцировки клетки РПЭ низших позвоночных демонстрируют признаки ЭМП: они теряют пигментацию, в них снижается экспрессия маркеров РПЭ, увеличивается подвижность и пролиферация (Grigoryan, Markitantova, 2016; Yasumuro et al., 2017). У млекопитающих признаки ЭМП проявляются в клетках РПЭ как при различных патологиях глаз, так и при восстановлении РПЭ после воздействия лазера (Han et al., 2015; Che et al., 2016). Таким образом, наблюдаемые нами эффекты КС на клетки ARPE-19 могут свидетельствовать о начале ЭМП, который, однако, не имеет завершенного характера из-за однократного воздействия КС. По мере снижения концентрации КС клетки возвращаются к исходному состоянию.

Одновременно с событиями ЭМП в культуре наблюдали признаки, характерные для нейральной и эпителиальной дифференцировок, что, вероятно, связано с выделением двух субпопуляций. Увеличение доли СК8-положительных клеток после воздействия КС на фоне общего снижения эпителиальных маркеров говорит о поддержании небольшого пула клеток ARPE-19 в дифференцированном состоянии. В пользу попытки клеток выйти в нейральную дифференцировку свидетельствуют повышение уровня экспрессии гена TUBB3, усиление иммуноокрашивания на белок βIII-тубулин на фоне понижения экспрессии BMP2 и BMP4.

Ингибирование передачи сигналов BMP играет центральную роль во время нейральной индукции у млекопитающих (Di-Gregorio et al., 2007). Однако затем, ввиду краткосрочного воздействия КС в нашем эксперименте, во временном промежутке 72–120 ч наблюдали снижение транскрипции маркеров нейрональной дифференцировки (TUBB3, NES, PAX6) и увеличение транскрипции маркеров предшественников РПЭ (OTX2, MITF), что, вероятно, связано с возвратом клеток к исходной дифференцировке. Изменений в иммуноокрашивании против нейрофиламентов не наблюдали, вероятно из-за короткого времени воздействия дифференцировочного фактора. О попытке изменения дифференцировки на раннем сроке после воздействия КС и возврате к исходной говорит и характер изменения размера клеток по сравнению с контролем. Максимальные различия в площади клеток наблюдались на сроке 24 ч, которые постепенно уменьшались с течением времени культивирования.

Тот факт, что клетки ARPE-19 под действием КС совершают попытку выйти в нейральную дифференцировку, предполагает, что фактор(ы), присутствующий(ие) в КС регенератов сетчаток тритонов, способны обеспечить триггер для инициирования этого процесса. Подобные факторы, по существующему мнению (Mcgann et al., 2001), могут принадлежать ряду различных типов биомолекул, включая белки, липиды, нуклеиновые кислоты и полисахариды.

Проведя ряд экспериментов по выявлению природы дедифференцировочного сигнала по отношению к кардиомиоцитам мыши в экстракте регенерирующих конечностей тритона, исследователи (Mcgann et al., 2001) показали его белковую природу. Данные о составе секретома регенерирующей in vitro сетчатке глаза тритона пока отсутствуют. Однако нам известно, что на первой неделе органотипического культивирования in vitro изолированных тотальных сетчаток тритона по данным ПЦР в них происходит значительное возрастание экспрессии мРНК гена bFgf (Markitantova et al., 2019). Ростовой фактор bFGF, член FGF-сигнального пути, функционирует на самых ранних стадиях эмбрионального развития (Dorey, Amaya, 2010), в том числе развития глаза, способствуя специализации нейроэпителия в сетчатку (Bharti et al., 2006). Основными молекулами, стимулирующими трансдифференцировку РПЭ в клетки сетчатки при регенерации у тритона являются bFGF и IGF-1 (Mitsuda et al., 2005). Самостоятельно IGF-1 не способен вызвать изменения в РПЭ, скорее всего он участвует в повышении эффективности передачи сигнала bFGF (Mitsuda et al., 2005). В нашей работе мы наблюдали увеличение уровней экспрессии мРНК IGFR1 и FGF2 в клетках ARPE-19 под действием КС, что свидетельствует о консервативности механизмов трансдифференцировки РПЭ у позвоночных и возможном присутствии IGF-1 и bFGF в КС.

Важным участником контроля пролиферации и дифференцировки клеток является KLF4. Значение KLF4 показано при спецификации эпителиальных клеток и созревании нейронов (Li et al., 2012; Qin, Zhang, 2012). В нашем исследовании ингибирование экспрессии KLF4 положительно коррелировало со снижением экспрессии генов-маркеров дифференцировки РПЭ (OTX2, BMP4, KRT18) через 24–72 ч после воздействия КС. Кроме того, на этом же сроке мы наблюдали снижение пролиферативной активности клеток ARPE-19 по сравнению с контролем. Снижение пролиферации совпадало со снижением уровня экспрессии KLF4.

В наших предыдущих исследованиях показана связь между повышением экспрессии KLF4 и усилением пролиферации после воздействия bFGF как в иммортализованной (Шафеи и др., 2017), так и в неиммортализованных культурах клеток РПЭ (Кузнецова и др., 2018). Усиление пролиферации клеток ARPE-19 и повышение уровня экспрессии KLF4 наблюдали через 24 ч после воздействия bFGF, в то время как в первичных клетках РПЭ в первые 48 ч пролиферативная активность была снижена при неизменном уровне KLF4, а повышение уровня пролиферации и экспрессии KLF4 происходили только через 72 ч после воздействия bFGF. Такое различие, вероятно, связано с разной чувствительностью линейных и первичных клеток на одинаковую концентрацию фактора (Alge et al., 2006). По всей видимости, в зависимости от контекста KLF4 может регулировать клеточный цикл либо негативно (Chen et al., 2003; Li et al., 2012), либо позитивно (Tien et al., 2015). Еще один белок, контекст-зависимо влияющий на пролиферативный ответ и дифференцировку – BMP2 (Shu et al., 2011; Wang et al., 2017). Если сопоставлять результаты падения пролиферативной активности клеток ARPE-19 человека и данные кПЦР, показавшие снижение уровня экспрессии мРНК BMP2 в интервале 24–72 ч, то можно отметить их прямую корреляцию.

Отсутствие пролиферативного эффекта при использовании КС и экстрактов из регенерирующих конечностей тритона, показанное ранее в других работах (Kawesa et al., 2015; Middleton et al., 2018) и подтвержденное в нашем исследовании, может быть связано с тем, что для активации пролиферации требуется больше времени. Так, в экспериментах японских авторов (Yasumuro et al., 2017) клетки РПЭ тритона входили в клеточный цикл между 5 и 10 сут после ретиноэктомии, а полная регенерация сетчатки занимала более 65 сут.

В качестве основного фактора, влияющего на клетки РПЭ человека, мы предполагаем bFGF. Однако в КС могут присутствовать и другие активные молекулы, кроме того, концентрация bFGF может быть недостаточна для того, чтобы стимулировать пролиферативный ответ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа является первой в попытке тестировать действие КС, полученных из регенерирующих сетчаток тритона, на клетки ARPE-19 человека с целью обнаружить изменения дифференцировки этих клеток, в частности в сторону нейронального пути развития. Полученные первые свидетельства о возможности с помощью КС уже в первые сутки культивирования индуцировать экспрессию пронейральных маркерных молекул по сравнению с контролем требуют дальнейшего изучения, как и определение активных, действующих в этом направлении молекул “секретома” амфибий.