Цитология, 2021, T. 63, № 3, стр. 292-299

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Клетки. Культивируемая клеточная линия лимфомы Беркитта Raji была получена из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки культивировали на среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки для суспензионных клеточных культур (Sus-Biol, Биолот, Россия) и 80 мкг/мл гентамицина при 37°С и 5% CO₂. Клетки пересевали 3 раза в неделю в соотношении 1 : 3. За 1 ч до экспериментов клетки высевали на покровные стекла (4 × 4 мм), предварительно покрытые поли-DL-лизином (Sigma-Aldrich, США).

Метод локальной фиксации потенциала. Установка для регистрации ионных токов состоит из операционного усилителя Axon 200B (Molecular Devices, США) c регистрирующей головкой Axon CV203BU (Molecular Devices, США), аналогово-цифрового преобразователя Digidata 1550A (Molecular Devices, США) и персонального компьютера под управлением ОС Windows 7 (Microsoft, США). Управление экспериментом, регистрацию и запись данных осуществляли с помощью специализированного пакета программного обеспечения pClamp 10.7 (Molecular Devices, США). При регистрации ионных токов частота дискретизации сигнала составляла 10 кГц, фильтр нижних частот – 0.3 кГц. Стекла с клетками помещали в экспериментальную камеру, заполненную стандартным наружным раствором (состав см. ниже). Оптические наблюдения осуществляли с помощью инвертированного микроскопа с дифференциальным контрастом по Номарскому (объектив PlanApochromat 16×/0.25, Carl Zeiss, Германия, окуляр 16×).

Стеклянные микропипетки изготавливали из боросиликатных заготовок со стандартной толщиной капилляра (внешний/внутренний диаметр капилляра 1.5/0.86 мм, кат. № BF-150-86-10, Molecular Devices, США) на горизонтальной автоматизированной микрокузнице Флеминга−Брауна (Flaming/Brown Puller, модель P-97, Sutter Instruments, США) и заполняли стандартным наружным раствором (состав см. ниже), контактирующим с внеклеточной стороной участка мембраны. Электрическое сопротивление пипеток составляло 5–8 МОм. Стеклянную микропипетку подводили к клетке с помощью микроманипулятора, касание микропипеткой клеточной поверхности наблюдали в микроскоп. Для формирования сверхплотного гигаомного контакта с плазматической мембраной (Giga-seal) через стеклянную микропипетку подавали и запасали в системе “отрицательное” давление (suction, около 70–80 мм. рт. ст.). При подаче отрицательного давления наблюдали быстрое увеличение электрического сопротивления (R) контакта между микропипеткой и плазматической мембраной клетки. При достижении значений R > 200 МОм давление в системе сбрасывали, что приводило к дальнейшему повышению R до значений 3–5 ГОм и стабилизации гигаомного контакта, после чего приступали к регистрации ионных токов. Все эксперименты проводили при комнатной температуре (22–23°С).

Растворы. В электрофизиологических экспериментах стандартный наружный раствор в регистрирующей микропипетке содержал (в мМ): 145 NaCl, 2 СаCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES/TrisOH. В режиме отведения токов cell-attached раствор в камере был аналогичен стандартному наружному раствору с эквивалентной заменой ионов Na⁺ на K⁺ для установления потенциала покоя мембраны клетки близким к нулю. Величину pH всех растворов поддерживали на уровне 7.2–7.3.

Регистрация ионных токов и анализ данных. После образования гигаомного контакта в условиях отведения токов от участка плазматической мембраны неповрежденной клетки (вариант cell-attached, «калиевый» наружный раствор) в начале эксперимента в течение 1–2 мин регистрировали фоновую активность ионных каналов в контрольных условиях при различных уровнях поддерживаемого трансмембранного потенциала в диапазоне от –70 до 30 мВ (непрерывная регистрация с ручной установкой значения потенциала, протокол gap-free). Далее эксперименты проводили по стандартному протоколу, состоящему из следующих последовательных этапов:

1) установка трансмембранного потенциала (Е) на заданный уровень;

2) регистрация фоновой активности каналов при заданном значении Е;

3) подача механического стимула (отрицательного давления) и регистрация ответа;

4) снятие давления, регистрация активности после прекращения стимуляции;

5) повторение этапов 1, 2 и др.

Использовали широко распространeнный способ механической стимуляции участка плазматической мембраны нативных клеток, который состоял в натяжении (деформации) мембраны посредством снижения гидростатического давления Р (ΔP < 0, suction) или его повышения (ΔP > 0, pressure) в регистрирующей пипетке. Упрощенная схема активации механозависимых ионных токов в ответ на растяжение плазматической мембраны представлена в наших ранних публикациях (например: Chubinskiy-Nadezhdin et al., 2018). Контроль и регистрацию уровня стимула, необходимого для активации каналов, осуществляли по манометру.

Обработку и анализ записей токов проводили в программном обеспечении Clampfit 10.7. Для фильтрации записей использовали фильтр Гаусса нижних частот с частотой среза 170 Гц (–3 dB cut off frequency); кроме того, записи дополнительно фильтровали от электрических помех с опорной частотой 50 Гц (частота переменного тока в электрической сети). Из записей токов при различных уровнях мембранного потенциала получали характеристики одиночных каналов и идентифицировали их по проводимости и селективности. Амплитуды токов рассчитывали из амплитудных гистограмм, описанных функцией Гаусса, или измеряли вручную с помощью программы Clampfit 10.7. Для проверки корректности значений определяемых амплитуд в некоторых случаях использовали опцию “Single-channel search”, встроенную в программное обеспечение.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Механочувствительные ионные каналы в клетках лимфомы Беркитта линии Raji. В наших предыдущих исследованиях была описана активность механочувствительных SAC-каналов в различных клеточных типах, включая трансформированные клетки крови. Нами были разработаны и апробированы протоколы для регистрации и анализа одиночных механозависимых ионных токов, которые мы и использовали в настоящей работе для проверки предположений о функциональной активности SAC-каналов в клетках лимфомы Беркитта линии Raji. Действительно, подача механического стимула (отрицательного или положительного давления) приводила к активации механочувствительных каналов в 30 экспериментах (из 49 стабильных патчей, что составляет около 60%) при отведении от участка плазматической мембраны нативных клеток (конфигурация cell-attached). При этом в остальных 19 экспериментах мы не наблюдали активации механозависимых токов, и фоновая активность каких-либо других ионных каналов была крайне незначительна или совсем отсутствовала.

На рис. 1а представлена запись тока, демонстрирующая активность SAC-каналов в плазматической мембране клеток лимфомы при различных уровнях поддерживаемого потенциала. Амплитудные гистограммы, соответствующие представленным записям токов, приведены на рис. 1б. Вольтамперная характеристика зарегистрированных SAC-каналов, полученная на основании измеренных значений амплитуд в диапазоне от –20 до –70 мВ, аппроксимирована линейной зависимостью; унитарная проводимость составляет 23.7 пСм (рис. 1в). Потенциал реверсии близок к нулю, что означает отсутствие натрий-калиевой избирательности и является характерной особенностью SAC-каналов в клетках млекопитающих. Активация SAC-каналов развивалась без видимой задержки, и после снятия стимула уровень активности каналов возвращался к фоновому значению, близкому к нулю (рис. 1а). На рис. 1 приведен эксперимент, в котором регистрировали активность одного SAC-канала в участке мембраны нативной клетки. В большинстве случаев наблюдали несколько кратных уровней тока, отражающих одновременные открывания пор нескольких независимых канальных молекул (см. рис. 2, 3).

Рис. 1.

Активация механочувствительных SAC-каналов в плазматической мембране клеток лимфомы Беркитта линии Raji. а – Репрезентативные записи токов I (конфигурация cell-attached), демонстрирующие активацию SAC-каналов в ответ на приложение механического стимула (отрицательного давления, ΔP < 0, около 40 мм рт. ст.). Значения поддерживаемого мембранного потенциала указаны над записями токов. б – Амплитудные гистограммы, построенные по представленным записям токов; расстояние между пиками соответствует амплитуде одиночного открывания канала при соответствующем мембранном потенциале. в – Вольтамперная характеристика SAC-каналов, соответствует унитарной проводимости 23.7 пСм. Здесь и на рис. 2, 3: з – закрытое состояние каналов (уровень нулевого тока); открывание SAC-каналов (входящие токи) отмечено нижней штриховой линией.

Рис. 2.

Активация кальций-зависимых калиевых каналов (КСа) различной проводимости, вызванная высоколокализованным входом ионов Са²⁺ через SAC-каналы. Показаны результаты двух независимых репрезентативных экспериментов. Поддерживаемый мембранный потенциал –20 мВ. а – Функциональное сопряжение кальций-проницаемых SAC-каналов и каналов КСа большой проводимости (ВК). б – Сопряженная активация кальций-проницаемых каналов SAC и КСа малой проводимости (SK). Здесь и на рис 3. открывания BK- и SK-каналов обозначены красной и зеленой штриховыми линиями соответственно. Предполагаемые модели сопряжения между SAC- и KCa-каналами представлены справа от записей токов. [Ca²⁺]_i – внутриклеточная концентрация Ca²⁺.

Рис. 3.

Сопряженная активация кальций-проводящих SAC-каналов c калиевыми каналами BK и SK в одном мембранном патче. Поддерживаемый потенциал –20 мВ. Активность BK- и SK-каналов показана в расширенном масштабе времени на врезках вверху. Схема регуляции активности каналов ВК и SК локальным входом ионов кальция через механоуправляемые SAC-каналы показана под записью токов.

Сопряженная механозависимая активация каналов SAC и KCa в клетках лимфомы Беркитта линии Raji. Ранее нами был продемонстрирован феномен кальций-зависимого функционального сопряжения между каналами SAC и KCa в различных типах клеток (см. вводную часть). Возник вопрос о том, может ли присутствовать феномен сопряженной активации каналов SAC и KCa в клетках лимфомы Беркитта линии Raji. Это предположение опирается, прежде всего, на данные мРНК-скрининга на микрочипах, представленного в транскриптомной базе данных: так, в клетках Raji наблюдаются высокие уровни экспрессии мРНК некоторых типов KCa-каналов (например, KCa2.3, ген KCNN3; Wu et al., 2016).

Результаты наших электрофизиологических экспериментов по регистрации одиночных ионных токов позволили документировать феномен сопряженной активации в клетках лимфомы Беркитта линии Raji (рис. 2 и 3). В результате проведенного анализа механозависимых токов в 18 экспериментах (из 30 стабильных патчей с SAC-каналами) была выявлена сопряженная активация колокализованных Са²⁺-транспортирующих SAC-каналов и Са²⁺-управляемых KCa-каналов. Важно отметить, что в клетках Raji мы наблюдали сопряженную активацию SAC-каналов и KCa-каналов различных типов, значительно различающихся по значениям амплитуд открываний одиночных каналов и, соответственно, по унитарной проводимости. Так, на основании амплитуд мы можем четко разделить наблюдаемые KCa-каналы на два типа: калиевые каналы высокой проводимости (BK, рис. 2а) и калиевые каналы низкой проводимости (SK, рис. 2б). Близкие значения амплитуд и проводимости для BK-каналов мы регистрировали ранее в стволовых клетках эндометрия человека (Chubinskiy-Nadezhdin et al., 2017, 2019b), а каналы SK, имеющие сходные характеристики, были описаны нами в клетках миелоидной лейкемии человека линии К562 (Chubinskiy-Nadezhdin et al., 2019a) и фибробластах мыши (клеточные линии BALB/3Т3 и 3T3B-SV40; Chubinskiy-Nadezhdin et al., 2014, 2018).

Сопряженную активацию каналов SAC и SK наблюдали в 7 экспериментах, а сопряжение между SAC- и BK-каналами наблюдали в 6 экспериментах из 18. На рис. 2 показаны типичные записи ионных токов, представляющих последовательное развитие активности SAC-каналов и функционально солокализованных с ними каналов BK (рис. 2а) или SK (рис. 2б). Механическая стимуляция вызывала стретч-активацию токов входящего направления через Са²⁺-проводящие SAC-каналы в клетках Raji (см. также рис. 1: активация токов через SAC-каналы). Далее, в том же патче наблюдали развитие токов выходящего направления, отражающих опосредованную активацию KCa-каналов, не имеющих собственной механочувствительности. Имеющиеся данные (рис. 2) согласуются c результатами наших предшествующих работ и позволяют заключить, что активация KCa-каналов в клетках лимфомы человека, наблюдаемая через 1–2 с после подачи стимула, и активации Са²⁺-проницаемых SAC-каналов, обусловлена кратковременным локальным повышением уровня Са²⁺ в околомембранной зоне кластеризации SAC- и KCa-каналов.

В 5 из 18 экспериментов на клетках Raji активация SAC-каналов сопровождалась развитием активности как BK-, так и SK-каналов в одном фрагменте клеточной мембраны (рис. 3). Важно отметить (рис. 3), что снятие механического стимула, приводящее к инактивации SAC-каналов (а, следовательно, прекращению локального входа кальция), приводила к постепенному исчезновению активности сначала BK-, а затем и SK-каналов. Это хорошо коррелирует с различной степенью кальциевой чувствительности каналов BK (активация при уровне внутриклеточного свободного ионизированного кальция >1 мкМ) и SK (активация при концентрациях >0.1 мкМ: Fakler, Adelman, 2008). Соответственно SK-каналы, активирующиеся при более низких значениях уровня внутриклеточного кальция, работают дольше и инактивируются позже каналов BK в условиях прекращения локального входа кальция через SAC-каналы.

ОБСУЖДЕНИЕ

В клетках лимфомы Беркитта впервые выявлены механоуправляемые катионные каналы, активирующиеся при растяжении участка плазматической мембраны (стретч-активация, SAC-каналы). В ионных условиях, близких к физиологическим, было продемонстрировано функциональное сопряжение между SAC-каналами и КСа-каналами различных типов: высоколокализованный вход кальция через SAC-каналы стимулирует активность калиевых каналов SK и BK в плазматической мембране. Таким образом, SAC-каналы, по-видимому, формируют один из физиологически значимых путей для эффективного входа ионов кальция в клетках Raji.

Учитывая высокие пролиферативную и инвазивную способности лимфомы Беркитта (Xiong et al., 2012), в которых очевидна важная роль кальций-зависимых сигнальных путей и молекул, SAC‑каналы могут являться определяющими регуляторами поведения клеток лимфомы. Следует отдельно отметить, что ионные механизмы транспорта кальция в клетках различных лимфом практически не изучены. Теперь, после выявленного нами присутствия и активности кальций-проницаемых SAC-каналов, важным вопросом является идентификация их потенциальных молекулярных коррелятов в клетках данного типа. По значению унитарной проводимости (около 25 пСм), которая является важной биофизической характеристикой одиночного канала, SAC-каналы в клетках Raji близки к каналам, идентифицированным нами ранее в стволовых клетках эндометрия человека (Chubinskiy-Nadezhdin et al., 2017) и трансформированных фибробластах мыши линии 3T3B-SV40 (Chubinskiy-Nadezhdin et al., 2014, 2018, 2019с). В клетках 3T3B-SV40 мы показали, что наиболее вероятным коррелятом SAC-каналов являются белки Piezo1: мы обнаружили соответствие биофизических характеристик каналов, активируемых в ответ на растяжение мембраны и в присутствии селективного активатора каналов Piezo1 низкомолекулярного гетероциклического соединения Yoda1 (Chubinskiy-Nadezhdin et al., 2019с). Анализ баз данных транскриптом (Wu et al., 2019) позволил обнаружить крайне высокий уровень экспрессии мРНК PIEZO1 в клетках Raji: он находится на втором месте среди более 80 образцов различных клеток и тканей, использованных в тесте (oligonucleotide array). Таким образом, весьма вероятно, что белки Piezo1 формируют кальций-проницаемые SAC-каналы в клетках лимфомы Беркитта. Это предположение может быть использовано для формирования отдельного направления исследований.

Ранее детально были изучены SAC-каналы в клетках другого рака (крови) – клетках миелоидной лейкемии человека линии К562 (Staruschenko, Vedernikova, 2002; Staruschenko et al., 2005, 2006), показана их проницаемость для ионов кальция, исследованы некоторые механизмы регуляции их активности мембранными липидами и актиновым цитоскелетом (Morachevskaya et al., 2007; Chubinskiy-Nadezhdin et al., 2011). С помощью анализа записей одиночных ионных токов в участке клеточной мембраны нативных клеток К562 нами было показано, что кальциевый вход через SAC-каналы в клетках К562 вызывает активацию кальций-зависимых калиевых каналов SK. Напротив, в мезенхимных стволовых клетках эндометрия человека SAC-каналы стимулируют активность калиевых каналов BK, но не SK, которые, несмотря на их присутствие в том же мембранном фрагменте, не активируются SAC-опосредованным локальным входом кальция (Chubinskiy-Nadezhdin et al., 2017).

В представленной работе на клетках лимфомы Беркитта мы обнаружили, что активация SAC-каналов может стимулировать активность как каналов BK или SK по отдельности, так и одновременно двух типов KCa-каналов в одном мембранном фрагменте. Феномен SAC-зависимой стимуляции активности одновременно каналов SK и BK может быть интерпретирован двумя предположениями.

Первая гипотеза – в мембране присутствуют два независимых типа канальных кластеров – SAC/SK и SAC/BK, и их случайное попадание в один фрагмент плазматической мембраны в эксперименте приводит к наблюдениям сопряжения SAC-каналов одновременно с двумя типами KCa-каналов. В таком случае, активация разных SAC-каналов внутри независимых кластеров управляет активностью своих, со-локализованных с ними, SK- или BK-каналов.

Альтернативная гипотеза – присутствие канальных кластеров, состоящих из функционально солокализованных каналов трех типов – SAC + BK + SK. Наши результаты свидетельствуют в пользу альтернативной гипотезы – совместной локализации 3-х типов каналов в плазматической мембране клеток Raji. Этот вывод может быть сделан нами на основании записей токов с активностью трех типов ионных каналов: во всех 5 экспериментах после снятия механического стимула (и постепенного снижения активности SAC-каналов) вначале мы наблюдали инактивацию каналов BK, а только затем – каналов SK. Учитывая известную разницу в чувствительности каналов BK и SK к уровню внутриклеточного кальция (см. раздел Результаты и Fakler, Adelman, 2008), при прекращении локального входа кальция через каналы SAC каналы BK должны инактивироваться раньше, чем SK. В случае первой гипотезы (присутствия независимых кластеров каналов SAC/BK и SAC/SK) феномен последовательного снижения активности KCa каналов не наблюдали, а временные рамки процессов инактивации BK- и SK-каналов имели бы случайный характер. В совокупности, наши данные в очередной раз демонстрируют уникальность метода патч-кламп для анализа и оценки взаимодействий одиночных канальных белков в плазматической мембране живых клеток, в частности анализа механизмов передачи локального кальциевого сигнала.

Связь функций калий-селективных ионных каналов с различными патофизиологическими процессами и реакциями в трансформированных клетках различного происхождения являются актуальным и перспективным направлением исследований. Калиевые каналы предлагаются как терапевтическая мишень в персонифицированной онкотерапии (Huang, Jan, 2014). Мы впервые идентифицировали функциональную активность КСа-каналов BK и SK в клетках лимфомы Беркитта линии Raji. С учетом наличия высокоселективных ингибиторов для данных каналов, в дальнейших исследованиях может быть оценена перспектива использования BK- и SK-каналов как молекулярных мишеней для снижения агрессивных патофизиологических свойств лимфом.