Цитология, 2021, T. 63, № 4, стр. 363-372

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Реагенты и клетки. Использовали реактивы фирмы Sigma-Aldrich, кроме особо оговоренных случаев. Линию клеток карциномы толстой кишки человека HCT116 с исходным р53 (American Type Culture Collection, США) и изогенную сублинию HCT116p53KO (получена в лаборатории B. Vogelstein, университет Джонса Хопкинса, Балтимор, США (Bunz et al., 1998); предоставлена авторам др-ом Б. П. Копниным), в которой рамка считывания гена р53 удалена в результате гомологической рекомбинации, культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла, содержащей 2 мМ L-глутамина (Биолот, Россия), 5% сыворотки эмбриона теленка (HyClone, США) и 50 мкг/мл гентамицина (Биолот, Россия) при 37°С, 5% CO₂. В экспериментах использовали клетки в логарифмической фазе роста, культивируемые не более 15 пассажей.

Воздействие ионизирующим излучением. Клетки рассевали во флаконы с площадью поверхности 25 см² (Eppendorf, Германия) за 24–48 ч до экспериментов и облучали γ-фотонами на аппарате РУМ-17 (Мосрентген, Россия). Разовые дозы 4 Гр и 10 Гр сопоставимы с используемыми в клинике. Параметры облучения: напряжение на трубке 180 кВ, ток 10 мА, фокусное расстояние 50 см, фильтр 1 мм Al; 0.5 мм Cu, мощность дозы 0.32 Гр/мин. Для валидации значений использовали дозиметрический контроль (дозиметр ИД-11, Россия).

Анализ экспрессии генов p53, p21, BBC3 (PUMA) и PMAIP1 (Noxa). После облучения клетки культивировали 3–24 ч при 37°С, 5% CO₂ и лизировали реагентом Extract RNA (Евроген, Россия). Экстракцию тотальной РНК и обратную транскрипцию (ревертаза MMLV) проводили согласно инструкции производителя. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в реальном времени (qPCRmix-HS SYBR; Евроген). Нуклеотидные последовательности праймеров: для Tp53 прямой 5'-GAGCTGAATGAGGCCTTGGA-3' и обратный 5'-CTGAGTCAGGCCCTTCTGTCTT-3'; для р21 прямой 5'-AGTCAGTTCCTTGTGGAGCC-3' и обратный 5'-CATTAGCGCATCACAGTCGC-3'; для PUMA прямой 5'-ACAGTATCTTACAGGCTGGG-3' и обратный 5'-CAGACTGTGAATCCTGTGCT-3'; для Noxa прямой 5'-CCAGCCGCCCAGTCTAATCA-3' и обратный 5'-GTGCCCTTGGAAACGGAAGA-3'. Для соотнесения сигналов (нормализации) использовали кДНК GAPDH; праймеры для GAPDH: прямой 5'-CCATCACCATCTTCCAGGAGCG-3' и обратный 5'-AGAGATGATGACCCTTTTGGC-3'.

Иммуноблотинг. Необлученные (контроль) и облученные клетки лизировали в буфере, содержащем 150 мM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 50 мM Tris pH 8.0 с добавлением фенилметилсульфонилфторида и смеси ингибиторов протеиназ. Концентрацию общего белка в лизатах определяли методом Брэдфорда (Bradford, 1976). Электрофоретическое разделение белков проводили в 12%-ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия при напряжении 120–140 мВ. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (GE Healthcare Amersham, США; 250 мА, 1.5 ч). Использовали первичные антитела (Cell Signaling, США) к p53, p21, PUMA и Noxa (разведения 1 : 1000). В качестве контроля использовались антитела к β-актину в разведении 1 : 2000. Для хемилюминесцентной визуализации белков использовали вторичные антитела к IgG мыши или кролика (Amersham, США), конъюгированные с пероксидазой хрена (1 : 5000–1 : 10 000). Визуализацию проводили в растворе ECL и документировали с помощью системы ChemiDoc Touch (BioRad, США). Денситометрию проводили в программе ImageJ, инструментом Grey Mean Value Calculation.

Биоинформатический анализ. Исследовали предполагаемые нуклеотидные последовательности, содержащие мотивы связывания транскрипционного фактора р53 с промоторными областями генов BBC3/PUMA и PMAIP1/Noxa. В качестве входных данных программы принимали нуклеотидные последовательности генов: BBC3 (ENSG00000105327) и PMAIP1 (уникальный идентификатор ENSG00000141682) из раздела Sequence сайта ensembl. Размер промоторов (600 нуклеотидов) соответствовал стандарту. Достоверность нуклеотидных последовательностей промоторных областей подтверждали проверкой соответствующих областей в базе GenomeBrowser (https://www.ensembl.org/index.html).

Поиск мотивов осуществляли с помощью программы FIMO (find individual motif occurrences) из набора инструментов MEME (Grant et al., 2011) с опорой на базу данных HOCOMOCOv11_full_HUMAN_mono_meme_format. На начальном этапе в качестве исходных были заданы последовательности только промоторных областей генов BBC3 и PMAIP1. Затем поиск мотивов осуществляли по всему гену, включая экзоны и интроны. Полученные мотивы дополнительно проанализированы инструментами MATCH (Kel et al., 2003) и PROMO (Farré et al., 2003). У мотивов, предсказанных PROMO, вероятность несовпадения 5%. Мотивы, идентифицированные программой MATCH, обнаружены при следующих параметрах анализа: поиск по базам данных мотивов, обладающих специфичностью для клеточного цикла позвоночных. Из предсказанных последовательностей отобраны мотивы, имеющие сходство не менее 0.95 с мотивами из баз. Далее использовали программы FIMO MEME для идентификации мотивов потенциальных транскрипционных факторов, связывающихся с промоторными областями генов. Дополнительно предсказаны мотивы связывания р53 с полноразмерными генами BBC3 и PMAIP1.

Статистическая обработка. Данные ПЦР (3 повтора экспериментов) обрабатывали с помощью программы Microsoft Excel 2016. Результаты представлены в виде средних значений и стандартных отклонений. Достоверность различий определялась однофакторным тестом ANOVA при p ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экспрессия генов Tp53, CDK1NA, BBC3 и PMAIP1 в зависимости от дозы облучения и статуса p53. Анализ мРНК с помощью ПЦР в реальном времени показал, что активация Tp53 в клетках НСТ116 происходит в первые часы после облучения и достигает максимума через 12 ч (усиление приблизительно в 9 раз при облучении 4 Гр и в 13 раз в ответ на 10 Гр по сравнению с необлученными клетками). Через 24 ч после облучения экспрессия Tp53 несколько снижалась: приблизительно в 7 (4 Гр) и 9 раз (10 Гр) (рис. 1а). В сублинии НСТ116р53КО (с нокаутированным р53) незначительный специфический сигнал определялся на 32−34 циклах (данные не представлены).

Рис. 1.

Изменения во времени экспрессии генов Tp53, CDKN1A, BBC3 и PMAIP1 в ответ на облучение в дозе 4 Гр (белые столбцы) и 10 Гр (черные столбцы) в клетках исходной линии HCT116 (а) и сублинии HCT116p53KO с инактивированным p53 (б). По горизонтали – время, ч. Контроль – необлученные клетки (экспрессия принята за 1). Представлены средние значения из 3-х экспериментов и доверительные интервалы (вертикальные отрезки). Для нормализации использовали транскрипты гена GAPDH. Во всех группах отличия от контроля достоверны при p ≤ 0.05 (однофакторный ANOVA).

Ген CDK1NA, кодирующий белок p21, играет важнейшую роль в ответе клеток на повреждения ДНК, в том числе при ионизирующем излучении (Huerta et al., 2013). Этот ген – транскрипционная мишень p53. Характер активации CDK1NA в облученных клетках схож с таковым для Tp53: максимум достигается к 12 ч (рис. 1а). В это время увеличение мРНК CDK1NA достигает 4–6 раз. К 24 ч мРНК CDK1NA снижалась на ~20% от контрольных значений. Напротив, в сублиниии с нефункционирующим p53 CDKN1A слабо отвечал на облучение (рис. 1б).

Регуляция экспрессии генов семейства Bcl-2 – BBC3 (PUMA) и PMAIP1 (Noxa) – опосредована фактором р53 (Kim et al., 2019). В ответ на облучение клеток НСТ116 относительное количество мРНК BBC3 увеличивалось одновременно с повышением мРНК Tp53, достигая 3–4-кратного подъeма к 12 ч. К 24 ч мРНК BBC3 снижалась, однако превышала контрольные значения в ~2–3 раза (рис. 1а). Ген BBC3 практически не экспрессируется в сублинии НСТ116р53КО; в облученных клетках уровень мРНК BBC3 превышал контрольный не более, чем в 1.5 раза (рис. 1б). Низкий базальный уровень экспрессии BBC3 в сублинии НСТ116р53КО можно объяснить р53-независимыми механизмами (Fernandez-Zapico et al., 2011; Valentino, 2013).

Индукция гена PMAIP1 в клетках выражена слабее, чем индукция BBC3. В линии НСТ116 PMAIP1 практически не отвечает на облучение в дозе 4 Гр; даже при действии дозы 10 Гр активация этого гена не превышает 2-кратный уровень. В сублинии HCT116p53KO зависимости относительного содержания мРНК PMAIP1 от времени и дозы не наблюдается (рис. 1а, б). Таким образом, гены Tp53, CDK1NA и BBC3 следует считать р53-зависимыми сенсорами ответа клеток на ионизирующее излучение, тогда как ген PMAIP1 рефрактерен даже для “сверхсильного” (10 Гр) стимула.

Влияние облучения и статуса гена Tp53 на индукцию белков p53, p21, PUMA и Noxa. Как соотносятся уровни мРНК исследуемых генов с количествами соответствующих белков в ответ на облучение клеток с различным статусом р53? Результаты иммуноблотинга через 3–24 ч после облучения клеток НСТ116 и НСТ116р53КО (4 Гр и 10 Гр) показаны на рис. 2. Белок p53 активируется дозозависимым образом в первые 3–6 ч, достигает максимума, превышающего контроль в ~3 и ~6 раз для дозы 4 и 10 Гр соответственно, после чего снижается до 3-часовых значений (по результатам денситометрии полос иммуноблота). Изменения p21 схожи с таковыми для p53; выраженность прироста р21 значительно ниже (в ~2–3 раза даже для дозы 10 Гр), однако и через 24 ч количество р21 остается повышенным. В сублинии HCT116p53KO p53 не определяется; уровень p21 в ответ на облучение практически не изменяется.

Рис. 2.

Количество белков p53, p21, PUMA и Noxa в клетках НСТ116 и НСТ116р53КО после облучения в дозе 4 и 10 Гр. Иммуноблотинг. Вверху указано время после облучения, ч. В качестве контроля нанесения белков на гель использовали β-актин.

Количество белка PUMA в облученных клетках HCT116 изменяется в соответствии с нарастанием p53; важно, что PUMA нарастает уже в первые часы после облучения. В сублинии HCT116р53КО выявлены лишь следовые количества PUMA. Наконец, количество Noxa не зависело от доз облучения и статуса р53 (рис. 2).

Биоинформатический анализ регуляции BBC3 и PMAIP1. В начале поиска нуклеотидных последовательностей, несущих мотивы узнавания р53, мы предположили, что этот транскрипционный фактор связывается с промоторными областями генов PUMA и Noxa. Поэтому на первом этапе анализа рассмотрены только последовательности этих промоторов.

Оценка вхождений мотивов связывания р53. Поиск вхождений мотивов связывания р53 с PMAIP1 и BBC3 (с помощью FIMO) предсказал пять последовательностей P53_HUMAN.H11MO.1.A в промоторной области PMAIP1 (табл. 1) и отсутствие таковых в промоторе BBC3. Согласно принятым стандартам, достоверными можно считать мотивы с p-value ≤ 0.05 и q-value ≤ 0.05, т.е. вероятность ложноположительного вхождение мотива справедлива для 5% случаев. Чем меньше величины p-value и q-value, тем выше достоверность предсказанного мотива. Обнаружено 3 мотива, удовлетворяющих статистическим оценкам вероятности (обозначены символами А, Б, В; табл. 1). Анализ MATCH выявил один мотив узнавания р53 в промоторе PMAIP1 и отсутствие мотивов в промоторе BBC3. Обнаруженный мотив ggGCAGGtcg гена PMAIP1 совпадает с мотивом CGACCTGCCCGGACACGCTC, предсказанным программой FIMO, с учетом направления цепи ДНК.

Поскольку мотивы связывания р53 с промотором BBC3 не выявлены, на следующем этапе нами учтены полноразмерные последовательности генов: промоторные области, все интроны и экзоны. В табл. 2 приведены мотивы, статистические показатели вхождения которых удовлетворяют диапазонам q-value ≤ 0.05 и p-value ≤ 0.05. Из табл. 1 и 2 видно, что некоторые мотивы, предсказанные для промоторной области PMAIP1, оказались ложноположительными и повысили значение q-value на более длинном протяжении гена. Таким образом, достоверно предсказано наличие только одного мотива (А) связывания р53 в гене PMAIP1, и этот мотив А локализуется в промоторе (табл. 2).

Для гена BBC3 связывание р53 с промотором не предсказано, но найдены два мотива в экзоне 1 (табл. 2, мотивы Б и В) и по одному в интронах 1 (табл. 2, мотив Г) и 2 (табл. 2, мотив Д). Результаты анализа MATCH выявили мотив узнавания р53 aggCATGTcc в области экзона 1 гена BBC3 и совпадение этого мотива с последовательностью GGGTCTGCCCAGGCATGTCC, указанной FIMO. Также MATCH выявил мотив tgaCTTGTcc, совпадающий с CTGCAAGTCCTGACTTGTCC в интроне 1 и мотив gggCGTGTct в интроне 2, не совпадающий с результатами FIMO.

Таким образом, программы FIMO и MATCH подтвердили вхождение двух мотивов р53 в экзоне 1 и одного мотива в интроне 1 гена BBC3. Поскольку эти мотивы найдены в противоположных цепях ДНК, при конвертировании GGACATGCCTGGG в (+)-направление обнаруживается полное совпадение со 2-м найденным мотивом GGGTCTGCCCAGGCATGTCC в экзоне 1. Следовательно, интрон 1 – место предпочтительного связывания р53 с геном BBC3.

Итак, в гене BBC3 (PUMA) сайт связывания р53 находится в экзоне 1. Напротив, р53 предположительно связывается с промотором PMAIP1 (Noxa). Различия в предсказанных сайтах связывания р53 не объясняют различий ответа каждого гена: при облучении в дозе 4 Гр активируется только ген BBC3 и накапливается белок PUMA (рис. 1, 2), а ген PMAIP1 индуцируется слабо и лишь при интенсивном воздействии (10 Гр). Требуется расширить анализ структуры обоих генов для выявления мотивов связывания других транскрипционных факторов.

Для предсказания мотивов связывания транскрипционных факторов с исследуемыми генами взяты последовательности их промоторов и экзона 1. Причина выбора таких районов – предсказанные мотивы связывания р53 в промоторе гена PMAIP1 и в экзоне 1 гена BBC3 (см. выше). Учитывались мотивы всех факторов с достоверностью предсказания (p‑value и q-value) выше, чем для р53. При обнаружении нескольких мотивов одного фактора в таблицу вносили мотив с наименьшими значениями p-value и q-value. (табл. 3).

Предыдущие исследования (Ploner et al., 2008; Kuribayashi et al., 2011) и наши результаты указывают на второстепенную (в отличие от PUMA) роль Noxa в ответе клеток на ионизирующее излучение. Действительно, ген PMAIP1 активируется только при сильном (10 Гр) р53-активирующем воздействии; уровень активации невелик по сравнению с таковым у гена BBC3. Биоинформатический анализ указал на особенности, важные для интерпретации экспериментальных данных о дифференциальной роли р53 в регуляции BBC3 и PMAIP1. Требуется иммунопреципитация хроматина для суждения о функциональной значимости того или иного предсказанного мотива для транскрипционных ответов при облучении. Отметим, что возможных сайтов связывания р53 в гене BBC3 в 4 раза больше, чем в гене PMAIP1 (табл.2); можно предположить более высокую значимость р53-опосредованной регуляции BBC3. Выявлены различия в локализации сайтов связывания р53: у BBC3 экзоны, у PMAIP1 – промотор.

Исходя из предсказанных мотивов (табл. 3), количество транскрипционных факторов, связывающихся с промотором гена PMAIP1, намного превышает число таковых для промотора и экзона 1 гена BBC3. Это может означать, что регуляция экспрессии PMAIP1 и, следовательно, содержание белка Noxa осуществляются многочисленными механизмами, зависимыми и независимыми от р53. На рис. 3 представлены предсказанные мотивы связывания транскрипционных факторов в области промотора и экзона 1 гена PMAIP1.

Рис. 3.

Сайты связывания транскрипционных регуляторов с промоторной областью и экзоном 1 гена PMAIP1 (Noxa). Указаны индивидуальные белки или семейства, а также положения предсказанных мотивов их связывания с ДНК. Стрелка – сайт инициации транскрипции. Размеры последовательностей взяты из раздела Sequence базы данных Ensembl.

На клетках линии эмбриональных фибробластов мыши MEF и в модели in vivo показано, что белок PATZ1, имеющий сайт связывания с PMAIP1, способен конкурировать с р53 за связывание с ДНК и ингибировать функции р53 при повреждении ДНК (Fedele et al., 2005). Представители семейства транскрипционных белков SP/KLF, в частности KLF4, ингибируют р53-зависимую регуляцию гена р53 (Rowland et al., 2014). KLF5 связывается с р53, отменяя р53-зависимое подавление гена сурвивина; это способствует выживанию клеток острого лимфобластного лейкоза (Zhu et al., 2006). Таким образом, неэффективность р53-активирующего стимула может быть обусловлена взаимодействием p53 с белком (белками) семейства KLF. Рефрактерность гена PMAIP1 к р53-активирующим стимулам (например, ионизирующему излучению) может быть обусловлена тем, что среди белков семейства KLF немало репрессоров транскрипции, а промотор PMAIP1 богат сайтами связывания KLF/SP (табл. 3). Предположение о механизме трансрепрессии в регуляции р53-зависимых ответов согласуется со следующими данными: в линии эпителия молочной железы MCF10A Мyc-ассоциированный белок MAZ (из семейства “цинковых пальцев”) связывался с регуляторной областью р53 и ингибировал этот ген (Lee et al., 2016). Протеинкиназа Akt отменяла ингибирующий эффект MAZ, что указывает на возможности эпигенетической реактивации p53.

Можно ли активировать экспрессию PMAIP1 для усиления гибели р53-положительных клеток в ответ на стресс, в частности при комбинации с терапевтическими дозами ионизирующего излучения? В экспериментах с тепловым шоком в клетках меланомы (Davis et al., 2015) производное хинона – аурин – ингибировало белок теплового шока Hsp90α. Это сопровождалось падением мембранного потенциала митохондрий, индукцией массивного окислительного стресса, истощением глутатиона и активацией Noxa с последующей апоптотической гибелью. Такой подход не представляется перспективным для практического использования из-за отсутствия специфичности к PMAIP1/Noxa как внутриклеточной мишени.

Эярестатин I (Eeyarestatin I; EerI) блокирует деградацию белков при стрессе эндоплазматического ретикулума. В ответ на действие EerI в клетках накапливаются транскрипционные факторы семейства CREB/ATF, связывающиеся с промотором PMAIP1. Наряду с этим блокируется убиквитинирование гистона H2A – репрессора PMAIP1. В результате дерепрессия PMAIP1 и накопление Noxa обусловливают апоптоз (Wang et al., 2009). Однако для гибели клеток при стрессе эндоплазматического ретикулума р53 не обязателен (Nikiforov et al., 2007). Комбинирование такого вида стресса с облучением предусматривает вовлечение р53-независимых механизмов, что терапевтически оправдано. Вместе с тем, для гибели р53-позитивных клеток целесообразно использовать активацию этого важнейшего проапоптотического механизма (а при лучевом воздействии такая активация – одно из главных событий) и уменьшение р53-зависимых ответов, позволяющих клеткам пережить воздействие. К таким ограничивающим механизмам относится р53/р21-зависимая задержка клеточного цикла. Правомерно предположить, что селективная инактивация р21 (препятствие транскрипции гена CDKN1A или прицельная деградация белка с применением технологии PROTAC (Paiva, Crews, 2019)) позволят сохранять проапоптотические эффекты р53 и предотвращать блокирование клеточного цикла, что повысит чувствительность р53-положительных клеток к лучевым воздействиям.

На рис. 4 представлены возможности использования р53-зависимой регуляции для повышения эффективности облучения опухолевых клеток.

Рис. 4.

Р53-зависимые ответы на лучевое воздействие: возможности усиления гибели клеток. Слева: активация р53 в ответ на облучение индуцирует разнонаправленные р53-зависимые механизмы (примеры: PUMA и р21). Гибель клеток лимитирована невысокой активацией других проапоптотических механизмов (пример: Noxa) и задержкой клеточного цикла. Справа: стратегия интенсификации апоптоза облученных клеток: реактивация проапоптотических генов (Noxa) и (или) предотвращение активации ингибитора клеточного цикла р21.