Цитология, 2021, T. 63, № 6, стр. 548-556

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Объекты исследования. Животные. Для экспериментов in vivo использовали мышей-самцов линии C57BL/6 в возрасте 4 мес. Животным с экспериментальной БА вводили бета-амилоид (Aβ) в CA1 зону гиппокампа. Контрольную группу составляли ложно-оперированные животные после введения в гиппокамп растворителя для Aβ – фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Всего использовали 20 животных (n = 20). В экспериментах in vitro для получения первичных культур клеток использовали крыс линии Wistar. Общее число животных n = 14.

Животных содержали в клетках со свободным доступом к воде и корму при постоянной температуре 21 ± 1°С и регулярном световом цикле 12 ч день и 12 ч ночь. Исследования на животных проводили в соответствии с соблюдением принципов гуманности, изложенных в Директиве Европейского сообщества (2010/63/ЕС).

Клетки. Использовали первично-выделенные культуры клеток церебрального эндотелия, астроцитов и нейросфер (НСФ). Из НСФ путем направленной дифференцировки получали сокультуру астроцитов и нейронов. Контрольную группу составляли интактные клетки, экспериментальную – клетки, культивируемые в течение 1 сут в присутствии Аβ в конечной концентрации 100 нМ.

Моделирование нейродегенерации in vivo. Моделирование БА осуществляли интрагиппокампальным введением Aβ билатерально по 1 мкл в зону СА1 по стереотаксическим координатам ML = ±1.3 мм, AP = 2.0 мм, DV = –1.9 мм (Epelbaum et al., 2015). Aβ (Sigma-Aldrich, США) перед введением животным растворяли в PBS до концентрации 50 мкM с последующей агрегацией в термостате при 37°С в течение 7 сут. Оценку признаков БА проводили, начиная с 10-х сут (Sipos et al., 2007) после оперативного вмешательства. Модель БА верифицировали с помощью окрашивания тиофлавином S. После введения амилоида в ткани головного мозга наблюдали флуоресцирующие амилоидные бляшки зеленого цвета.

Приготовление срезов и иммуногистохимия. Для фиксации тканей осуществляли транскардиальную перфузию 4%-ным параформальдегидом с последующим забором головного мозга. Далее изолированный мозг фиксировали в 10%-ном нейтральном забуференном формалине, после чего погружали в 20%-ный раствор сахарозы.

С помощью микротома Microm HM 650 (Thermo Scientific, США) изготавливали срезы толщиной 50 мкм. Наличие в образцах исследуемых маркеров определяли методом непрямой иммуногистохимии для свободно плавающих срезов (Encinas, Enikolopov, 2008).

После промывки в PBS срезы блокировали 3%-ным козьим сывороточным альбумином в PBS и 1%-ном Тритоне X-100 в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим инкубированием в течение ночи с первичными антителами в разведении 1 : 1000 в 3%-ном BSA в PBS и 0.2%-ном Тритоне X-100 при 4°С. Использовали первичные моноклональные крысиные антитела к CD31 (MBS532307; MyBioSource.com, США), куриные поликлональные антитела к нейронспецифической енолазе (NSE) (GTX85462; GeneTex, США), мышиные моноклональные антитела к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) (MBS8241552; MyBioSource.com, США), кроличьи поликлональные антитела к Cx43 (MBS9600634; MyBioSource.com, США) и кроличьи поликлональные антитела к CD38 (GTX37752; GeneTex, США). После инкубации с первичными антителами срезы промывали и инкубировали со вторичными антителами в разведении 1 : 1000 в течение 2 ч при комнатной температуре. Использовали вторичные поликлональные антитела (все от Abcam, Великобритания): ослиные, специфичные к кролику, Alexa Fluor 555 (ab150074); козьи, специфичные к курице, Alexa Fluor 647 (ab150171); козьи, специфичные к мыши, Alexa Fluor 647 (ab150115); козьи, специфичные к крысе, Alexa Fluor 647 (ab150159. Изображения получали с помощью конфокального микроскопа Olympus FV 10i (Япония). В срезах головного мозга в НВЕ считали абсолютное число клеток в поле зрения нейрональной (NSE-позитивные), астроглиальной (GFAP-позитивные) и эндотелиальной (CD31-позитивные) природы, имеющих целевые молекулы (Cx43, CD38) на различных уровнях в гиппокампе. Каждый эксперимент проводили в 10 повторностях. Оценивали не менее пяти полей зрения в каждом срезе гиппокампа.

Выделение и культивирование церебральных эндотелиоцитов. Использовали модифицированный протокол (Liu et al., 2013). Выделение мозга с удалением мозговых оболочек и крупных церебральных сосудов осуществляли c помощью роллинга на фильтровальной бумаге. Выделяли кору головного мозга и удаляли крупные сосуды в холодном растворе Хенкса (ПанЭко, Россия). Мелконарезанную кору головного мозга центрифугировали в пробирке объемом 15 мл в течение 3 мин при 150 g и комнатной температуре. Последующие этапы включали:

1) добавление к осадку в двукратном объеме 25%-ной FBS (HyClone, США), тритурирование 25 раз пипеткой 5 мл с последующим центрифугированием гомогената в течение 10 мин при 600 g при комнатной температуре;

2) забор самого нижнего слоя и перенос в новую коническую пробирку 15 мл;

3) повторение этапов тритурирования и центрифугирования три раза, после чего проводили ферментативную обработку пеллета в растворе 0.1%-ной коллагеназы II (ПанЭко, Россия) в течение 35 мин при 37°С с периодическим перемешиванием и дальнейшим центрифугированием в течение 5 мин при 200 g;

4) умеренное ресуспензирование осадка в питательной среде и посев в культуральные флаконы.

Культивирование эндотелиальных клеток осуществляли при 37°С, 5% CO₂ в культуральных флаконах, предварительно покрытых 0.1%-ным раствором желатина (Biological Industries, США) в культуральной среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 20% FBS (HyClone, США), а также 0.58 мг/мл глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия). Смену среды проводили каждые 3 сут.

Выделение и культивирование нейросфер. Животных декапитировали после охлаждения на льду и производили забор головного мозга. Мозг помещали в ледяной раствор 2%-ной глюкозы в PBS (ПанЭко, Россия). Выделяли интересующие регионы (гиппокамп, стенки боковых желудочков) и иссекали до размеров 1 мм³. После окончания диссекции выделенную ткань переносили в свежий раствор 2%-ной глюкозы в PBS (в конической пробирке 14 мл) на 1 мин. После осаждения ткани удаляли супернатант. Оставшуюся ткань ресуспензировали в 1 мл среды NeuroCult NS-A Proliferation (StemCell, США). Проводили тритурацию ткани (25–30 раз) стерильным пластиковым наконечником до получения однородной суспензии клеток. К полученной суспензии добаляли 1 мл свежей среды NeuroCult NS-A Proliferation. Через 2 мин после осаждения неразделенных кусочков ткани под силой тяжести собирали супернатант и переносили его в новую стерильную пробирку объемом 14 мл. Собранный супернатант центрифугировали при 150 g в течение 5 мин, после чего удаляли супернатант и добавляли 1 мл свежей среды NeuroCult NS-A Proliferation с последующей тритурацией. Полученную клеточную суспензию переносили в культуральные флаконы T-75 см² с 25 мл среды NeuroCult NS-A Proliferation. Культивирование осуществляли в условиях инкубатора при 5% CO₂ и 37°C. Через 24–48 ч после выделения наблюдали образование нейросфер.

Получение культуры астроцитов. Использовали направленную дифференцировку нейросфер в среде Astrocyte Medium (ScienCell, США) следующего состава: базальная средa (Basal Medium, ScienCell, США), 10% FBS (HyClone, США), AGS (ScienCell, США), раствор пенициллина-стрептомицина (ScienCell, США) в конечной концентрации 50 ед./мл (Хилажева и др., 2015). Через 7–9 сут наблюдали образование монослоя астроцитов.

Получение сокультуры астроцитов и нейронов. Нейросферы направленно дифференцировали в астроциты и нейроны. Нейросферы ресуспендировали в культуральной среде NeuroCult NS-A Differentiation Kit (StemCell, США) и засевали в культуральные флаконы T-75 см². Через 5–7 сут наблюдали образование сокультуры астроцитов и нейронов.

Получение модели ГЭБ in vitro. Для получения модели ГЭБ сокультуру астроцитов и нейронов засевали на дно лунок культурального планшета, затем в лунки устанавливали культуральные вставки (Corning-Costar, США), на которые помещали эндотелиоциты. Соотношение количества эндотелиоцитов, астроцитов и нейронов составляло 1 : 2 : 1 соответственно. Смесь клеток культивировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 20% FBS (HyClone, США), а также 0.58 мг/мл глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (все от ПанЭко, Россия) в условиях инкубатора при 37°C и 5% CO₂.

Оценка Cx43-опосредованного транспорта в астроцитах в присутствии и в отсутствие Аβ. Астроциты засевали в 12-луночный культуральный планшет по 2.5 × 10⁵ клеток на 1 лунку. После достижения 95% конфлюентности производили замену культуральной среды на среду с Аβ в конечной концентрации 100 нМ. Через 1 сут культивирования в среде с Aβ оценивали Cx43-опосредованный транспорт в астроцитах с использованием красителя Lucifer Yellow (LY), а также иммуноцитохимически с использованием Cx43-антител.

Для оценки Cx43-опосредованной проницаемости астроциты культивировали в среде, содержащей флуоресцентный краситель LY в конечной концентрации 50 мкМ. Через 24 ч среду с LY убирали, клетки промывали раствором PBS и оценивали интенсивность флуоресценции красителя в астроцитах с помощью флуоресцентного микроскопа ZOE (Bio-Rad, США).

Иммуногистохимическое выявление белков CD38 и Cx43 в культурах in vitro. Клетки фиксировали в 4%-ном параформальдегиде в течение 15 мин, после чего отмывали раствором PBS. Наличие в клетках исследуемых маркеров определяли методом непрямой иммуногистохимии. Использовали первичные поликлональные антитела: к белкам плотных контактов ZO1 (козлиные sc-8147; Santa Cruz, США и кроличьи orb11587; Biorbyt, Великобритания); куриные к GFAP (LS-B6299; LSBio, США); мышиные к нейрон-специфичному ядерному белку NeuN (MAB377; Merck Millipore, США); кроличьи к CD38 (LS-C331640; LSBio, США), кроличьи к Cx43 (ab11370; Abcam, США). Первичные антитела использовали в рабочем разведении 1 : 300. Время инкубации составляло 18 ч при 4°С. После инкубации производили 2-х кратную отмывку клеток раствором PBS.

Вторичные поликлональные антитела от Abcam, Великобритания: ослиные, специфичные к мыши, Alexa Fluor 488 (ab150117); ослиные, специфичные к кролику, Alexa Fluor 555 (ab150077) и козьи, специфичные к курице Alexa Fluor 647 (ab150171), а также ослиные, специфичные к козе, Alexa Fluor 488 (A11055; Life Technologies, США). Антитела использовали в разведении 1 : 500, время инкубации составляло 2 ч при 37°С.

Микроскопию клеток осуществляли на флуоресцентном микроскопе ZOE (Bio-Rad, США). Наличие изучаемых маркеров изучали в клетках эндотелия (ZO1-позитивные), нейронах (NeuN-позитивные) и астроцитах (GFAP-позитивные). Каждый эксперимент проводили в 6 повторностях. В каждой экспериментальной лунке не менее, чем в пяти полях зрения, считали долю клеток (%) нейрональной, астроглиальной и эндотелиальной природы, несущих целевые молекулы .

Статистический анализ. Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью программ GraphPad Prizm 8.0.1 (версия 8.0, США) и Stаtplus Professional (AnalystSoft Inc, США), сборка 5.9.8.5/Core v.5.9.33 и GraphPad 6.0 (США). Для оценки нормальности распределения использовали критерий Колмoгорова−Смирнова. При отсутствии условий нормальности распределения для сравнения выборок применяли U-критерий Манна–Уитни. Различия принимали значимыми при P ≤ 0.05. Результаты представлены в виде средних значений M и их стандартных отклонений SD.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Мы обнаружили, что у животных с экспериментальной БА регистрируется значимое (Р < 0.05) увеличение числа Cx43-позитивных клеток нейрональной, астроглиальной и эндотелиальной природы по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Так, абсолютное число нейронов гиппокампа, несущих Cx43, у мышей с моделью БА оказалось выше почти в 2 раза, чем у контрольных животных, а число Cx43-позитивных астроцитов – выше в 2.5 раза. Также зарегистрировано значимое увеличение числа эндотелиоцитов, несущих Cx43, у животных с БА (табл. 1).

Выявленное однонаправленное увеличение числа Cx43-позитивных клеток может являться результатом подавления метаболической активности клеток нейроваскулярной единицы (гликолиза, митохондриальной дисфункции), а также быть проявлением нейровоспаления в участках аккумуляции Аβ, вызванного активированными астроцитами.

Далее мы провели иммуноцитохимическое исследование содержания Cx43 в астроцитах и изучение проницаемости коннексиновых полуканалов в астроцитах в условиях in vitro с использованием красителя LY. При исследовании содержания Cx43 в астроцитах нами установлено, что число коннексиновых полуканалов в астроцитах при культивировании в присутствии Aβ статистически значимо возрастает по сравнению с контрольной группой (Р ≤ 0.05, рис. 1а). При этом средняя площадь коннексиновых полуканалов в астроцитах экспериментальной группы оказалась в 1.5 раза меньше, чем в интактных астроцитах (Р ≤ 0.05, рис. 1б).

Рис. 1.

Содержание Cx43 в астроцитах in vitro в физиологических условиях в контроле и в присутствии Aβ (100 нМ). а – Число коннексиновых полуканалов, б – средняя площадь сигнала флуоресценции.

Для оценки Cx43-опосредованной проницаемости астроцитов в культуральную среду вносили флуоресцентный краситель LY и через 24 ч оценивали интенсивность флуоресценции красителя в астроцитах. Известно, что захват этого флуоресцентного красителя из внеклеточного пространства в Cx43⁺-клетках опосредуется именно активностью Cx43-полуканалов (Lagos-Cabré et al., 2018). В результате исследования нами было выявлено, что в астроцитах, культивированных в присутствии Aβ, интенсивность флуоресценции красителя LY была в 1.5 раза выше, чем в интактных астроцитах (Р ≤ 0.05, рис. 2).

Рис. 2.

Интенсивность захвата красителя Lucifer Yellow астроцитами из среды культивирования in vitro в контрольных условиях и в присутствии 100 нМ Aβ. ИФ – интенсивность флуоресценции.

Таким образом, астроциты гиппокампа демонстрируют увеличение числа Cx43 в ответ на токсическое действие Aβ in vitro, причем проницаемость этих полуканалов значимо увеличивается. С учетом данных о том, что метаболическое повреждение астроцитов вызывает активацию Cx43-полуканалов, эти данные могут быть интерпретированы и как доказательство нарушения процессов продукции энергии в аффектированных астроцитах в результате развития митохондриальной дисфункции, и как свидетельство их активации, необходимой для развития нейровоспаления.

Далее нами исследовано число CD38-позитивных клеток в гиппокампе животных с экспериментальной БА, т.е. клеток, несущих молекулу, потенциально сопряженную (в функциональном аспекте) с Cx43. В результате, было выявлено статистически значимое снижение CD38⁺-нейронов в гиппокампе головного мозга животных после интрагиппокампального введения Аβ по сравнению с ложно-оперированными животными (Р ≤ 0.05, табл. 2). В клетках эндотелиальной природы, напротив, отмечали двукратное увеличение числа CD38⁺-клеток в группе с экспериментальной БА относительно группы контроля (Р ≤ 0.05, табл. 1). Однако не было выявлено статистически значимых отличий при сравнении количества CD38⁺-астроцитов в гиппокампе животных контрольной и экспериментальной групп.

Причиной увеличения числа CD38-позитивных клеток может быть их повреждение, а также дисфункция митохондрий, косвенным подтверждением чего является увеличение содержания Cx43 как маркера метаболического ингибирования. Ранее было показано, что повреждение митохондрий вызывает открытие мегаканалов (MPT) в местах контакта их внутренней и внешней мембран, что вызывает высвобождение в цитозоль НАД⁺ (выступающего в качестве субстрата для CD38) и белков с проапоптотической активностью (Alano et al., 2007). В этом контексте вполне объяснимо, почему астроциты не демонстрируют значимого увеличения содержания CD38 in vivo:

1) астроциты являются более устойчивыми к повреждению в силу того, что максимально экипированы ферментами гликолиза и могут продуцировать АТФ даже при значимом подавлении активности митохондрий; 2) они имеют минимальное количество митохондрий по сравнению с нейронами и эндотелиоцитами, что позволяет им избегать выраженного окислительного стресса; 3) они имеют высокую концентрацию НАД⁺, причем преимущественно в цитозоле, тогда как нейроны и эндотелиоциты имеют меньшие уровни НАД⁺, который, в основном, аккумулируется в митохондриях; 4) они имеют высокий уровень содержания Cx43 и могут благодаря этому регулировать биодоступность НАД⁺ для других астроцитов в составе астроглиального синцития (Alano et al., 2007).

Далее мы проверили, насколько это справедливо для клеток НВЕ головного мозга при токсическом действии Aβ in vitro. Мы оценили количество Cx43-позитивных и CD38-позитивных клеток эндотелия, нейронов и астроцитов, культивируемых совместно в течение 24 и 48 ч в статической модели ГЭБ in vitro в присутствии и в отсутствие Аβ.

Так, при культивировании клеток ГЭБ в присутствии Aβ через 24 ч было выявлено статистически значимое увеличение количества CD38-позитивных эндотелиоцитов, которое сохранялось в течение 48 ч культивирования (Р ≤ 0.05, рис. 3а). К этому же времени (48 ч) было зафиксировано и статистически значимое увеличение в присутствии Aβ количества астроцитов и нейронов, несущих CD38 (Р ≤ 0.05, рис. 3б, в).

Рис. 3.

Количество CD38-позитивных клеток в модели ГЭБ in vitro при культивировании в контрольных условиях и в присутствии 100 нМ Aβ. а – Эндотелиоциты, б – астроциты, в – нейроны.

При анализе количества Cx43-позитивных клеток в составе ГЭБ при культивировании в присутствии Aβ было выявлено статистически значимое увеличение числа Cx43⁺-астроцитов (Р ≤ 0.05, рис. 4б), которое сохранялось на протяжении всего времени наблюдения (24 и 48 ч). Также было зафиксировано увеличение количества Cx43⁺-эндотелиоцитов и нейронов (48 ч культивирования с Aβ) (Р ≤ 0.05, рис. 4а, в).

Рис. 4.

Количество Cx43-позитивных клеток в модели ГЭБ in vitro при культивировании в контрольных условиях и в присутствии 100 нМ Aβ. а – Эндотелиоциты, б – астроциты, в – нейроны.

Таким образом, нами выявлено, что токсическое действие Aβ in vitro приводит к значительному увеличению количества Cx43-позитивных и CD38-позитивных клеток в составе модели ГЭБ. Это соответствует изменениям, зарегистрированным нами при исследовании действия Aβ in vivo.

Между тем известно, что выраженное увеличение экспрессии CD38 в клетках может приводить к значительному истощению уровня НАД⁺ (Camacho-Pereira et al., 2016), поэтому увеличение количества CD38-иммунопозитивных нейронов и эндотелиоцитов способно усугублять последствия митохондриальной дисфункции и активировать механизмы клеточной гибели. Снижение уровня НАД⁺ может быть одной из причин возрастных дисфункций, оказывающих влияние на процесс развития болезни Альцгеймера (Lautrup et al., 2019). Отмечается, что процесс старения сопровождается увеличением экспрессии в клетках CD38, контролирующего уровень НАД⁺ (Chini, 2009). Известно, что у мышей экспрессия и активность CD38 увеличиваются во время старения, а CD38 вносит значительный вклад в связанное с возрастом истощение НАД⁺ и митохондриальную дисфункцию, по крайней мере частично за счет ингибирования активности НАД⁺-зависимых сиртуинов (гистоновых деацетилаз) (Camacho-Pereira et al, 2016). Нокдаун CD38 у мышей линии APP/PS1 уменьшает аккумуляцию Aβ и уровни растворимого Aβ, а также восстанавливает пространственное обучение, возможно, за счет повышения уровня НАД⁺ в мозге (Blacher et al., 2015). Выявлено (Camacho-Pereira et al., 2016), что экспрессия и активность CD38 при нейродегенеративных заболеваниях возрастают, что является первым косвенным доказательством участия CD38 в нейродегенерации и нейровоспалении.

С другой стороны, в экспериментальной модели гипоксии на клеточных культурах доказано, что CD38 участвует в переносе митохондрий от астроцитов к нейронам после инсульта (Hayakawa et al., 2016), что позволяет рассматривать CD38-экспрессирующие астроциты в качестве клеток-доноров митохондрий для нейронов и эндотелиоцитов при нейродегенерации, индуцированной токсическим действием Aβ.

Также известно, что содержание Cx43 увеличивается в астроцитах, окружающих амилоидные бляшки, как в головном мозге пациентов с БА (Nagy et al., 1996), так и в головном мозге мышей с генетической моделью БА линии APP/PS1 (Yi et al., 2016), тем самым способствуя снижению жизнеспособности нейронов и развитию синаптической дисфункции. В культуре клеток Aβ не только запускает активацию Cx43-полуканалов, но и глиальных глутаматных и пуринергических рецепторов; последние, в свою очередь, высвобождают АТФ и глутамат, что способствует повреждению и гибели нейронов (Koulakoff et al., 2012). Кроме того, Cx43-опосредованное высвобождение АТФ, зарегистрированное у мышей линии APP/PS1, провоцирует дальнейшее прогрессирование нейродегенерации (Delekate et al., 2014). Интересно, что уменьшение уровня содержания Cx43 или его фармакологическое ингибирование у мышей линии APP/PS1 приводит к выраженному снижению дистрофических изменений нейритов, уменьшению митохондриального окислительного стресса, а также препятствует прогрессированию когнитивных нарушений на фоне отсутствия видимого уменьшения отложения Аβ в головном мозге (Ren et al., 2018).

С другой стороны, ряд исследований показывает, что Cx43 обладает нейропротекторным эффектом (Kozoriz et al., 2010a; Le et al., 2013). Согласно недавно полученным данным (Kajiwara et al., 2018), экспрессия Cx43 при аккумуляции Аβ в ткани головного мозга защищает клетки от альтерации. В этом контексте важно отметить, что Cx43 экспрессируется и на мембранах митохондрий, что было убедительно показано для клеток миокарда (Rodríguez-Sinovas et al., 2018), жировой ткани (Kim et al., 2017) и астроцитов (Kozoriz et al., 2010b). Выяснение, насколько митохондриальная локализация Cx43 актуальна для клеток НВЕ при экспериментальной БА, требует дальнейшего экспериментального исследования.

Таким образом, белки CD38 и Cx43 можно рассматривать в качестве перспективных мишеней для фармакологической модуляции при нейродегенерации, в том числе альцгеймеровского типа.