Цитология, 2022, T. 64, № 5, стр. 427-447

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Самок травяной лягушки Rana temporaria L. в возрасте 2–3 г отбирали из естественной среды обитания в окрестностях Санкт-Петербурга в апреле месяце. Лягушек декапитировали и немедленно разрушали спинной мозг. Яичники и ооциты изолировали в среде OR2 (Wallace et al., 1973), содержащей 82.5 мM NaCl, 2.5 мM KCl, 1.0 мM CaCl₂, 1.0 мM MgCl₂, 1.0 мM Na₂HPO₄, 5.0 мM HEPES, pH ~7.8. ЗП изолировали в растворе “5 : 1 + PO₄” (Gall et al., 1981), содержащем 83.0 мM KCl, 17.0 мM NaCl, 6.5 мM Na₂HPO₄, 3.5 мM KH₂PO₄, 1.0 мM MgCl₂, 1.0 мM DTT, pH 7.2. Яичники насекомого Tribolium castaneum (Herbst) изолировали в растворе для Drosophila (128.3 мM NaCl, 4.7 мM KCl, 1.9 мM CaCl₂).

Для выявления F-актина образцы, фиксированные в 2%-ном формальдегиде на PBS, окрашивали фаллоидин-родамином (2 мкг/мл) в течение 1 ч во влажной камере при комнатной температуре, отмывали в PBS и заключали в среду Vectashield (Vector Laboratories), содержащую 1 мкг/мл DAPI для выявления ДНК. Препараты просматривали в конфокальном микроскопе Leica TCS SP5.

Для стандартной трансмиссионной ЭМ образцы фиксировали 2.5%-ным глутаральдегидом, затем 1.0%-ным OsO₄ и заключали в Epon–Araldite. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Для ИЭМ образцы префиксировали в течение 2 ч в 4%-ном формальдегиде, свежеприготовленном из параформальдегида, и 0.5%-ном глутаральдегиде на PBS, затем фиксировали в 2%‑ном формальдегиде при 4°C в течение ночи. После промывки в PBS, содержащем 0.05 M NH₄Cl, и дегидратации в серии спиртов возрастающей концентрации образцы заключали в смолу LR White. Ультратонкие срезы инкубировали в течение 10 мин в блокирующем буферном растворе (PBS с добавлением 0.5% желатина из кожи холодноводных рыб (Sigma) и 0.02% Tween-20, pH 7.4). После этого срезы инкубировали в растворе первичных антител во влажной камере в течение ночи при 4°C. Использованные первичные антитела: мышиные моноклональные антитела к двухцепочечной ДНК (Hemicon, MAB 030, разведение от 1 : 200 до 1 : 300), козьи поликлональные антитела к Nup35 (Santa Cruz, sc-74762, разведение от 1 : 20 до 1 : 50), мышиные моноклональные антитела к Nup93 (Santa Cruz sc-374399, разведение 1 : 20)¹¹, козьи поликлональные антитела к ламину B (Santa Cruz, sc-6217, разведение от 1: 20 до 1 : 50) и кроличьи поликлональные антитела к N-концу молекулы актина (Sigma, A2103, разведение 1 : 20–1 : 50). После отмывки в PBS, содержащем 0.1% желатина и 0.02% Tween-20, срезы инкубировали в растворе вторичных антител (козьих к иммуноглобулинам кролика, ослиных к иммуноглобулинам кролика или козьих к иммуноглобулинам кролика), конъюгированных с частицами коллоидного золота размером 10 нм, во влажной камере в течение 1.5 ч при комнатной температуре. Срезы контрастировали уранилацетатом и исследовали с помощью электронного микроскопа Leica 120 при 80 кВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Данное исследование посвящено ультраструктурному анализу кариосферы в ЗП травяной лягушки Rana temporaria с особым вниманием к КК, которая, по идее, должна формироваться в поздних вителлогенных ооцитах. Несмотря на целый век, прошедший с первого подробного описания КС этого вида (Wagner, 1923), после чего последовали электронно-микроскопические (Gruzova, Parfenov, 1977; Почукалина, Парфенов, 1994), биохимические (Engelhardt et al., 1982; Podgornaya et al., 2000) и иммунофлуоресцентные исследования (Ильичева и др., 2016; Ilicheva et al., 2018, 2019), мы представляем новые данные, полученные с помощью электронной и иммуноэлектронной микроскопии, которые заставляют усомниться в существовании КК как специализированного ядерного компартмента ЗП R. temporaria (Gruzova, Parfenov, 1993). В то же время обширная КК, в высокой степени обогащенная F-актином, формируется в ЗП других организмов, например модельного насекомого Tribolium castaneum.

Кариосфера в зародышевом пузырьке травяной лягушки. В своей работе мы не обнаружили каких-то значимых структурных особенностей ЗП R. temporaria по сравнению с теми, которые были ранее описаны у зимующих и пробуждающихся лягушек этого вида (Gruzova, Parfyonov, 1973; Gruzova, Parfenov, 1977). ЗП лягушек, собранных в естественных местообитаниях в апреле месяце, содержит развитую кариосферу в виде более или менее компактного клубка хромосом, собранных вместе в ограниченном объеме ядра, что соответствуют стадии, завершающей стадию ЛЩ. Кариосфера расположена внутри большого (более 150 мкм) компактного скопления сотен амплифицированных ядрышек и занимает в нем центральное положение (рис. 1a). Область, содержащая хромосомы, выглядит на срезах прозрачной, поскольку в значительной степени лишена ядрышек. О формировании подобного рода скопления ядрышек в центре ЗП амфибий постоянно сообщали, начиная с конца XIX в.²² (Schultze, 1887; Born, 1894; Carnoy, Lebrun, 1898; Wagner, 1923; Duryee, 1950), и уже ранние цитологии наблюдали в центре этого скопления почти лишенное ядрышек пространство с расположенными в нем хромосомами (рис. 1б–д, ж).

Рис. 1.

Морфологические особенности кариосферы амфибий. a – Полутонкий срез ядра ооцита Rana temporaria на стадии компактной кариосферы (стрелка), которая локализована в центре скопления амплифицированных ядрышек; окраска метиленовым синим. б–д, ж – Исторические рисунки скоплений ядрышек с расположенными внутри хромосомами (кариосферой) в ооцитах различных амфибий по данным Шульце (Schultze, 1887 – б), Карнуа и Леблона (Carnoy, Leblond, 1898 – в–г), Дюрьи (Duryee, 1950 – д) и Вагнера (Wagner, 1923 – ж); стрелки на фрагменте д указывают капсулу Вагнера; Biodiversity Heritage Library (https://www.biodiversitylibrary.org/), в свободном доступе согласно лицензии CC0 1.0 Public Domain Dedication. е, з – Ранняя (е) и поздняя (з) кариосфера R. temporaria, соответствующие стадии 6 по Дюрьи (Duryee, 1950 – д) и хромосомному узлу (Chromosomenknäuel) по Вагнеру (Wagner, 1923 – ж); окраска DAPI. и – Кариосфера R. temporaria при малом увеличении электронного микроскопа, заметно отсутствие капсулы; хр – хромосомы, яш – ядрышко. к – Хромосома ооцита R. temporaria на стадии кариосферы после иммуноэлектронного мечения антителами к двухцепочечной ДНК (частицы размером 10 нм).

В середине XX в. американский цитолог Уильям Дюрьи предложил периодизацию стадий роста ЗП R. temporaria, уделяя особое внимание структуре диплотенных хромосом (Duryee, 1950). Наиболее поздняя стадия, представленная в этой работе (стадия 6) соответствует полностью развитой кариосфере (кариосоме), представляющей собой поздние ЛЩ, собранные в центре скопления ядрышек (рис. 1д–е) – “хромосомном каркасе” (chromosomal frame). В этой важной работе Дюрьи не проиллюстрировал более поздние стадии развития кариосферы, следующие за стадией 6, на которых хромосомы, утратившие структуру ЛЩ, представляли бы собой более или менее компактный клубок, описанный ранее Вагнером (Wagner,1923) (рис. 1ж–з)³³. В нашем материале присутствовали ЗП с обеими конфигурациями кариосферы (рис. 1е, з).

Немецкий зоолог Карл Вагнер был первым, кто предложил термин “капсула” (Kapsel) в работе, посвященной развитию ооцитов лягушек, включая R. temporaria, в которой акцент был сделан на особенностях сезона и возрастных особенностях размножения лягушек (Wagner, 1923). Он отметил, что ранней весной, во время формирования хромосомного клубка (Chromosomenknäuel), известного теперь как кариосфера, вокруг поздних ЛЩ обнаруживается фиброзная субстанция (faserigen Substanz), окрашивающаяся кислыми красителями (рис. 1ж). Согласно Вагнеру (Wagner, 1923), “фибриллы” (Fasern) этой субстанции (капсулы) наиболее хорошо заметны после фиксации по Жильсону с последующим окрашиванием железным гематоксилином Хайденгайна (Heidenhain’s iron hematoxylin), но не детектируются после окрашивания гематоксилином Делафильда.

Капсула Вагнера (капсула кариосферы, КК), окружающая поздние ЛЩ, собранные в кариосферу, была также изображена в работе Дюрьи (Duryee, 1950) (рис. 1д, стрелки). Он отмечал, что кариосфера “окружена более плотной субстанцией”, так что хромосомы, расположенные в “центральном облаке ядрышек”, встроены в “гель”, физически изолирующий их “внутри хромосомного каркаса”. Однако фотографии нефиксированных ЗП, представленные в работе, включая “изолированные центральные ядрышки и хромосомный каркас”, не позволяют различить какие-либо детали структуры КК.

Хромосомы ооцитов травяной лягушки, собранные в кариосферу, демонстрируют довольно рыхлую ультраструктуру даже на финальных этапах диплотены, в поздних вителлогенных ооцитах (рис. 1и–к). Использование антител к ДНК (рис. 1к) позволяет отличить хромосомы от, например, структур, возникающих в результате слияния ядрышек (не показано). Кроме того, на ультраструктурном уровне вокруг хромосом мы не наблюдали заметного “каркаса” или фиброзной структуры, которую можно было бы трактовать как капсулу Вагнера. Особенно убедительно это видно при малом увеличении электронного микроскопа (рис. 1и). Эти данные противоречат более ранним наблюдениям Почукалиной и Парфенова (1994), которые на полутонких срезах показывали присутствие грубых тяжей, интерпретированных как филаментозная КК R. temporaria.

О так называемых “псевдомембранах”. Согласно ранним ЭМ-наблюдениям (Gruzova, Parfenov, 1977), собранные в кариосферу хромосомы ооцитов R. temporaria ассоциированы с филаментозным материалом, главные морфологические элементы которого названы псевдомембранами⁴⁴. Эти характерные образования представляют ряды структур (annuli), морфологически напоминающие “автономные” поровые комплексы (ЯПК), связанные фибриллярным материалом; в результате формируются электронно-плотные тяжи⁵⁵. Авторы считали, что они наблюдают на ультраструктурном уровне капсулу Вагнера. Подобные тяжи были также описаны в составе КК комаров (Fiil, Moens 1973; Fiil, 1974, 1976).

В нашем материале мы наблюдали все эти экстрахромосомные образования ЗП R. temporaria (тяжи и annuli), описанные ранее (Gruzova, Parfenov, 1977), включая расположенные в непосредственной близости от хромосом и ядрышек (рис. 2а–б). Кроме того, мы наблюдали внутриядерные мембранные структуры, такие как внутриядерные пузырьки, трубчатые конструкции и внутриядерные пористые пластинки (intranuclear annulata lamellae) (Парфенов, 1995), в том числе на периферии участков ЗП R. temporaria, содержащих кариосферу (не показано). Обнаружено, что вышеупомянутые электронно-плотные искривленные тяжи занимают весьма ограниченные участки в ЗП. Как показал анализ серийных срезов, этот материал никогда не формирует что-либо напоминающее капсулу⁶⁶.

Рис. 2.

Ультраструктурные особенности кариосферы Rana temporaria. a – Грубофибриллярный материал (стрелки), локализованный в области, содержащей хромосомы (хр). б – Электронно-плотные тяжи (стрелки), ассоциированные с тонкофибриллярным материалом; яш – фрагмент ядрышка. в – Срез, проходящий через тяжи, на котором видны “колечки” (annuli) (головки стрелок). г – Продольный срез через ядерную оболочку (ЯО), демонстрирующий морфологическое сходство между ядерными поровыми комплексами (головки стрелок) и “колечками”, показанными на (в); Я и Ц – соответственно ядерная и цитоплазматическая стороны.

Характерные annuli в этом материале (рис. 2в), по нашему мнению, хотя они морфологически напоминают ЯПК (Gruzova, Parfenov, 1977) (рис. 2г), нельзя считать аналогами ЯПК, поскольку большинство их них не содержит нуклеопорина Nup35 – ключевого белка ЯПК, что отчетливо видно при помощи ИЭМ (рис. 3, головки стрелок; рис. 4a). ИЭМ-мечение ядерной оболочки (ЯО) служило в качестве позитивного контроля (рис. 4б).

Рис. 3.

Фибриллярные тяжи кариосферы Rana temporaria после ультраструктурного иммуномечения антителами к нуклеопорину Nup35. Подавляющее большинство annuli (головки стрелок) не мечены и, следовательно, не могут рассматриваться в качестве “автономных поровых комплексов”.

Рис. 4.

Особенности распределения Nup35 в ядре ооцита Rana temporaria по данным иммуноэлектронной микроскопии. (a) Нуклеопорин Nup35 накапливается в заметных биомолекулярных конденсатах (стрелки), но не в тяжах (тя). (б) Срез через ядерную оболочку (ЯО), использованный в качестве контроля мечения антителами к Nup35; Я и Ц – соответственно ядерная и цитоплазматическая стороны.

В то же самое время довольно много метки обнаруживается над материалом экстрахромосомных тяжей, расположенных в центральной, кариосферосодержащей области ЗП. Кроме того, посреди этого материала обнаруживаются заметные биомолекулярные конденсаты, интенсивно меченные антителами к Nup35 (рис. 4a, стрелки). Известно, что внутренне неупорядоченные (intrinsically disordered) нуклеопорины, богатые остатками фенилаланина и глицина (FG-Nups), способны к фазовому разделению (Nag et al., 2022), что является фундаментальным процессом, лежащим в основе формирования биомолекулярных конденсатов (Banani et al., 2017). Nup35 не является FG-нуклеопорином, но некоторые такие нуклеопорины (non-FG-Nups), включая Nup35, взаимодействуют с определенным набором FG-Nups и усиливают взаимодействия с другими FG-Nups в ходе самосборки нуклеопориновых частиц (Konishi, Yoshimura, 2020). Это может приводить к формированию крупных биомолекулярных конденсатов, принимая во внимание возможный избыток нуклеопоринов в ЗП.

Наши наблюдения показывают, что Nup35 и, возможно, другие нуклеопорины, несомненно, присутствуют в кариосферосодержащем участке ЗП R. temporaria, что ранее было показано с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (Ilicheva et al., 2018). Однако пока остается неясным вопрос, имеют ли annuli и ЯПК какие-либо общие признаки, кроме морфологических.

В соматических клетках Nup35 необходим для сборки ЯО, но напрямую не участвует в ее ассоциации с хромосомами. Однако он взаимодействует с другими нуклеопоринами, включая хроматинсвязывающий Nup93, с которым образует стабильные комплексы (Ródenas et al., 2009). В свою очередь Nup93, участвуя в связывании хроматина с ЯО, вовлечен в эпигенетическое подавление некоторых генов (Labade et al., 2016). В частности, взаимодействия Nup93 с хроматином влияют на экспрессию генов, связанных с ремоделированием актинового цитоскелета (Bersini et al., 2020). К сожалению, пока мы не можем установить, является ли Nup93 компонентом тяжей и (или) annuli, поскольку антитела к нему продемонстрировали низкую эффективность на ультраструктурном уровне, несмотря на то, что Nup93 был выявлен в центральной части ЗП R. temporaria с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (Ilicheva et al., 2018).

Принимая во внимание, что Nup35 взаимодействует с ламинами типа B (Ródenas et al., 2009), что ламин III (ламин B3 амфибий) в большом количестве присутствует в кариосферосодержащей части ЗП R. temporaria (Парфенов, 1995) и что антитела к ламинам A/C и B на иммунофлуоресцентном уровне метят участки ЗП в области кариосферы (Ильичева и др., 2016; Ilicheva et al., 2018), мы проверили, являются ли ламины компонентами тяжей, связанных с annu-li.

К сожалению, имевшиеся в нашем распоряжения антитела к ламинам A/C млекопитающих не метили ЯО на ЭМ-уровне (не показано) и в дальнейшем не использовались. Однако антитела к ламину B, ранее успешно протестированные на материале эволюционно далеких друг от друга организмов, например насекомых (Bogolyubov et al., 2013), метили фибриллярный материал в ЗП лягушки (Fig. 5), но не тяжи, связывающие annuli (рис. 6a). В ЗП, в том числе вблизи тяжей, часто наблюдали заметные биомолекулярные конденсаты, интенсивно меченные антителами к ламину B (рис. 6б).

Рис. 5.

Ультраструктурное иммуномечение антителами к ламину B, демонстрирующее присутствие ламинсодержащего фибриллярного материала (стрелки) в ядре ооцита Rana temporaria.

Рис. 6.

Особенности распределения ламина B в ядре ооцита Rana temporaria. a – Характерные тяжи (тя) в кариосферосодержащей части ядра полностью лишены меток, в то время как белок, выявляемый антителами к ламину B, выявляется в аморфных локальных областях (стрелка). б – Срез через ядерную оболочку (ЯО), использованный в качестве контроля мечения антителами к ламину B; Я и Ц – соответственно ядерная и цитоплазматическая стороны.

F-актин – ключевой структурный белок зародышевого пузырька. Наконец мы проверили, связан ли ядерный актин с филаментозным материалом ЗП R. temporaria и можно ли считать F-актин главным компонентом КК. Давно известно, что актин – наиболее распространенный белок ЗП амфибий, количество которого составляет примерно 6% от общего количества белков в ЗП Xenopus в концентрации более чем 2 мг/мл (Clark, Merriam, 1977; Clark, Rosenbaum, 1979). Такое высокое значение превышает критическую концентрацию, необходимую для полимеризации актина, что приводит к быстрому гелеобразованию при нарушениях целостности ЗП (Gall, 2006).

В ЗП Xenopus полимерный актин составляет примерно 37% или даже больше от общего количества ядерного актина (Clark, Merriam, 1979); таким образом, F-актин – превалирующая форма актина в ЗП (Bohnsack et al., 2006). Установлено (Bohnsack et al., 2006), что столь значительное накопление F-актина в ЗП X. laevis достигается за счет отсутствия экспортина-6 – специфического фактора экспорта ядерного актина (Stüven et al., 2003). В ЗП амфибий и птиц F-актин легко выявляется с помощью обычного окрашивания флуоресцентно меченым фаллоидином (Морозова, Киселева, 2008; Maslova, Krasikova, 2012; Ilicheva et al., 2019).

В ЗП X. laevis на ультраструктурном уровне ядерный F-актин формирует сеть, состоящую из пучков и разветвленных филаментов толщиной примерно 12–100 нм (в среднем примерно 40 нм), которая простирается от ЯПК через всe ядро. Это отчетливо показано с помощью сканирующей ЭМ с использованием эмиссии под действием электрического поля (полевой эмиссии) – field emission scanning EM (Kiseleva et al., 2004). Считают, что сеть F-актина играет архитектурную роль и заякоривает органеллы, такие как тельца гистоновых локусов⁷⁷, спеклы (кластеры интерхроматиновых гранул) и ядрышки, а также, возможно, участвует в координации ядерно-цитоплазматических взаимоотношений и транспорте ядерных компонентов (Kiseleva et al., 2004).

Советско-российский клеточный биолог и эмбриолог Владимир Николаевич Парфенов и его коллеги были одними из первых, кто подтвердил наличие микрофиламентов и пучков полимерного актина в ЗП R. temporaria, в том числе на ультраструктурном уровне (Parfenov et al., 1995). Ими показано, что в поздних ооцитах короткие фрагменты пучков F-актина обнаруживаются в центральной части ЗП, в основном в ассоциации с ядрышками. Хотя в этой работе не упоминаются ни кариосфера, ни КК, с этого времени утвердилась точка зрения о том, что F-актин является одним из главных компонентов КК R. temporaria (Ильичева и др., 2016; Bogolyubov, 2018; Ilicheva et al., 2018, 2019).

С помощью стандартной ЭМ мы подтвердили, что ЗП R. temporaria заполнен обширной сетью филаментов, некоторые из которых тесно ассоциированы с хромосомами (рис. 7a) и ядрышками (рис. 7б). ЗП R. temporaria интенсивно окрашивается фаллоидин-родамином, однако это окрашивание довольно равномерное, в том числе в перинуклеолярных областях и участке, содержащем кариосферу (рис. 8). Мы пока не можем объяснить грубое окрашивание фаллоидин-родамином области, содержащей кариосферу, и выявление заметных F-актиновых “колец” вокруг ядрышек, о чем сообщалось ранее в результате иммунофлуоресцентных исследований (Ilicheva et al., 2018, 2019) и что было интерпретировано как выявление КК R. temporaria. В нашем материале мы никогда не наблюдали подобных картин. После окрашивания фаллоидин-родамином и обработки антителами к актину заметные тяжи F-актина не выявляются на световом уровне, что напоминает характер окрашивания ЗП X. laevis (Морозова, Киселева, 2008; Maslova, Krasikova, 2012). По нашему мнению, распределение F-актина в ЗП R. temporaria существенно не отличается от такового в ЗП шпорцевой лягушки, у которой слабо выражена кариосфера.

Рис. 7.

Ядерные филаменты (стрелки) в ассоциации с хромосомой (a) и ядрышком (б), выявляемые с помощью стандартной трансмиссионной электронной микроскопии. хр – хроматин, яш – ядрышко.

Рис. 8.

Окрашивание ядра ооцита Rana temporaria родамин-фаллоидином для выявления F-актина (красный цвет) и DAPI (синий цвет); конфокальная микроскопия, максимальная проекция.

Ультраструктурное (ИЭМ) исследование показало, что антитела к актину действительно выявляют филаментозную сеть в ЗП R. temporaria, подтверждая присутствие в нем филаментов актина (рис. 9a). Эти филаменты заполняют нуклеоплазму, но не концентрируются ни в кариосферосодержащей области, ни вокруг ядрышек. Во всяком случае, вышеупомянутые тяжи, “претендующие” на роль элементов КК, не содержат актина, а антитела к актину маркируют ассоциированный фибриллярный материал, но не сами тяжи (рис. 9б). В то же время некоторое количество актинсодержащего материала находится в физической ассоциации с этими тяжами (рис. 9в).

Рис. 9.

Иммуноэлектронное мечение ядра ооцита Rana temporaria антителами к N-концу молекулы актина. a – Актиновые филаменты (стрелки) в участке ядра, содержащем кариосферу. б – Тяжи (тя) не содержат актина. в – Фрагмент актинового пучка (стрелка), находящегося в физической ассоциации с тяжом (тя).

Следует подчеркнуть, что за пределами амфибий, а именно у насекомых, ядерный F-актин действительно может рассматриваться в качестве маркерного белка КК (Bogolyubov, 2018) – конечно, у тех видов, у которых развивается надструктурный комплекс “кариосфера–КК”. Наиболее впечатляющим примером служит ЗП некоторых сетчатокрылых (Rübsam, Büning, 2001) и некоторых жуков (Świątek, 1999; Bogolyubov, 2018), у которых КК интенсивно и избирательно окрашивается с помощью флуоресцентно меченого фаллоидина. В ЗП булавоусого мучного хрущака Tribolium castaneum F-актин формирует обширный “кожух” (рис. 10a), который также хорошо виден на ультраструктурном уровне как электронно-плотная оболочка (shell) кариосферы (рис. 10б). У T. castaneum эта “оболочка” часто ассоциирована с тяжами, которые, в отличие от тяжей в кариосферосодержащей области ЗП R. temporaria, содержат ламин B (Bogolyubov et al., 2013).

Рис. 10.

Кариосфера в ядре ооцита булавоусого мучного хрущака Tribolium castaneum, представленная здесь для демонстрации существенных различий в ее строении по сравнению с кариосферой лягушки. a – Окраска родамин-фаллоидином (красный цвет), демонстрирующая присутствие типичной капсулы кариосферы, богатой F-актином (стрелка), ДНК (собственно кариосфера) окрашена DAPI (синий цвет); конфокальная микроскопия, максимальная проекция. б – Ультраструктура капсулы кариосферы T. castaneum; стрелки указывают актиновые филаменты (Bogolyubov et al., 2013), ассоциированные с мощно развитой стенкой (shell) капсулы, окружающей хроматин (хр), иммуноэлектронное мечение антителами к ДНК; ят – ядерное тельце (кластер интерхроматиновых гранул), впп – внутриядерные пористые пластинки (intranuclear annulata lamella).

Что актин, особенно F-актин, делает в ядре? Времена, когда само существование актина в ядре вызывало изрядную долю скептицизма, закончились более чем 20 лет тому назад, породив бурно развивающуюся область исследований (Pederson, Aebi, 2002, 2005; Pederson, 2008). Теперь нет уже никаких сомнений, что актин в ядре выполняет множество функций и, помимо всего прочего, широко вовлечен в регуляцию экспрессии генов и поддержание целостности генома (Visa, Percipalle, 2010; Kyheröinen, Vartiainen, 2020), что напрямую связано с оогенезом и формированием кариосферы. Ядерный актин также важен в процессах определения судьбы клеток в ходе дифференцировки тканей, а также эмбрионального развития (Kloc et al., 2021).

Актин в ядре входит в состав хроматинремоделирующих комплексов и связан со всеми тремя РНК-полимеразами, а также РНП-комплексами процессинга и экспорта мРНК; при этом ядерный F-актин также обладает специфическими функциями (Gieni, Hendzel, 2009), участвуя, например, в репарации разрывов двухцепочечной ДНК и в ответе на репликационный стресс (Lamm et al., 2020). Нарушения функций ядерного актина, в том числе в результате нарушений его полимеризации/деполимеризации, имеют отношение к этиологии многих заболеваний человека, включая рак (Hyrskyluoto, Vartiainen, 2020) и ламинопатии (Bera, Sengupta, 2020). В последнем случае нарушения взаимодействия ядерного актина (и миозина) с ламиновой сетью, поврежденной в результате мутаций LMNA, но в норме обеспечивающей механическую жесткость хромосом, нарушают хромосомный ландшафт и экспрессию генов.

Специфические ядерные функции полимеров актина особенно важны для ооцитов, в которых полимеризация актина играет ключевую роль в сегрегации хромосом (Dunkley et al., 2022). Однако фундаментальные механизмы функционирования мономерного актина и актиновых филаментов в ядре все еще недостаточно изучены и служат предметом дискуссий (Ulferts et al., 2021).

Механизмы, посредством которых F-актин вовлечен в формирование кариосферы и ее капсулы, также еще предстоит расшифровать. Не вызывает, однако, сомнений тот факт, что актинсодержащие филаменты являются важнейшими компонентами ЗП (Морозова, Киселева, 2008). Эксперименты с агентами, деполимеризующими актин, такими как латрункулин и цитохалазин D, убедительно доказывают ключевую роль F-актина в поддержании структурной целостности надмолекулярных комплексов ЗП. У шпорцевой лягушки X. laevis, у которой хромосомы не формируют выраженную кариосферу, разрушение актиновых филаментов приводит к коллапсу хромосом и их “слипанию” в компактную кариосомоподобную массу (Maslova, Krasikova, 2012).

В качестве необходимого уточнения стоит отметить, что в конце диплотены хромосомы ооцита X. laevis “короткие и ретрагированные” (short and retracted) и вместе с амплифицированными ядрышками “формируют массу в центре ядра” (Dumont, 1972). С формальной точки зрения это описание соответствует описанию кариосферы, однако, как показано на рис. 16 в статье Дюмона (Dumont, 1972), на этой стадии хромосомы ооцита Xenopus не образуют компактного клубка. Вокруг хромосом не наблюдается филаментозного материла, который мог бы рассматриваться в качестве КК. Довольно странно, что заключительные стадии роста ооцита у такого распространенного модельного организма, которым является X. laevis, до сих пор исследованы недостаточно, а подавляющее большинство исследований касается предшествующих стадий хромосом-ЛЩ.

В ЗП R. temporaria, в котором уже сформирована более или менее компактная кариосфера, воздействие цитохалазином D существенно не влияет на хромосомы и транскрипцию, приводя лишь к некоторому сжатию кариосферы (Ilicheva et al., 2019). При этом цитохалазин D полностью разрушает окружающее скопление ядрышек, что приводит к их слиянию в единую гигантскую каплю. Авторы полагают, что в этом случае цитохалазин D разрушает КК. Однако на самом деле мы имеем дело с разрушением всей сети актиновых филаментов в ЗП.

Заключающие уточнения. Считают, что кариосфера и ее капсула – специализированные ядерные структуры ооцитов, участвующие в создании специфической структурно-функциональной компартментализации ЗП (Gruzova, Parfenov, 1993; Bogolyubov, 2018). Наши наблюдения над ЗП R. temporaria показали, что кариосфера (хромосомный аппарат вителлогенных ооцитов) травяной лягушки представляет собой простой клубок хромосом, что полностью соответствует оригинальному определению кариосомы (Blackman, 1903). В то же время мы не подтвердили присутствия вокруг этого “хромосомного клубка” заметной фиброзной капсулы Вагнера (Wagner, 1923), в то время как в ЗП других организмов, особенно насекомых, подобного рода КК действительно существует. Центральные скопления ядрышек, характерные для ЗП различных амфибий, по нашему мнению, не могут считаться настоящими КК, поскольку они образованы отдельными жидкими каплями (ядрышками), которые отделены друг от друга и в нормальных условиях не сливаются в единую массу, хотя картины слияния отдельных ядрышек в ЗП R. temporaria наблюдаются довольно часто.

Присутствие экстрахромосомного материала, который иногда охватывает хромосомы, собранные в кариосому, продемонстрировано, например, в ЗП большого мучного хрущака Tenebrio molitor. Этот фиброгранулярный материал, в частности, содержит избыток РНК-полимеразы II, факторов сплайсинга пре-мРНК и другие молекулярные компоненты, не участвующие в синтезе/процессинге РНК в транскрипционно инертных поздних ооцитах (Bogolyubov, Parfenov, 2008) (рис. 11). Однако этот материал, по-видимому, лишен структурных белков, таких как F-актин, и потому не может считаться КК.

Рис. 11.

Кариосфера в ядре ооцита большого мучного хрущака Tenebrio molitor. a – Иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью антител к фактору сплайсинга пре-мРНК SRSF2 (зеленый цвет), которые локализован в фиброгранулярном материале (фгм), окружающем хроматин (хр), ДНК (красный цвет) окрашена TO-PRO-3. б – Фиброгранулярный материал окружает хроматин, но оболочка (shell) или филаментозные тяжи, напоминающие капсулу кариосферы у другого жука-тенебриониды Tribolium castaneum (рис. 10), отсутствуют (Боголюбов и др., 2012, с изменениями).

КК насекомых не является полностью замкнутым барьером, изолирующим кариосферу, и отдельные фрагменты конденсированного хроматина могут находиться за ее пределами, по крайней мере, на некоторых стадиях роста ооцита сетчатокрылого насекомого – златоглазки Chrysopa carnea (Rübsam, Büning, 2001). КК насекомых аккумулирует значительные количества F-актина, который можно считать маркерным (signature) компонентом КК (Bogolyubov, 2018).

ЗП лягушек также содержит невероятные количества распределенного по нуклеоплазме F-актина независимо от того, формируется ли компактная кариосфера или нет. У травяной лягушки структурную стабильность комплексу “кариосфера–ядрышки” также в первую очередь придает обширная сеть F‑актиновых филаментов и их пучков, которая заполняет ЗП. Ключевая структурная роль F-актина в поддержании стабильности структур ЗП неоспоримо доказана в экспериментах с соединениями, деполимеризующими актин (Maslova, Krasikova, 2012), в том числе на ЗП травяной лягушки (Ilicheva et al., 2019). Однако в этом случае мы говорим о ядерной сети F-актина в целом, а не о специализированной ее части, которая могла бы представлять КК. В этом отношении структура ЗП R. temporaria принципиально не отличается от структуры ЗП X. laevis.

В то время как фундаментальные принципы формирования кариосферы (кариосомы) в основном расшифрованы, по крайней мере в отношении Drosophila melanogaster (Cullen et al., 2005; Ivanovska et al., 2005; Lancaster et al., 2007, 2010; Singh et al., 2018; Kenny et al., 2021), меньше известно о биологическом значении КК.

Формирование кариосомы в ЗП дрозофилы, по-видимому, не зависит от белков синаптонемных комплексов (СК), а мутанты с нарушениями формирования СК не имеют дефектов формирования кариосомы (Takeo et al., 2011). С другой стороны, мутации различных генов, которые необходимы для правильного завершения мейоза и оогенеза, приводят к аномалиям кариосомы, включая такие, когда хромосомы неправильно конденсируются и остаются связанными с ЯО (Morris et al., 2003).

Главными “участниками” формирования кариосомы Drosophila являются ферменты, модифицирующие гистоны (Flora et al., 2017), такие как консервативная нуклеосомная киназа гистонов 1 (nucleosomal histone kinase-1, NHK-1, она же Vrk-1 дрозофилы) (Cullen et al., 2005; Ivanovska et al., 2005; Lancaster et al., 2007, 2010). Согласно предложенной схеме, фосфорилирование BAF киназой NHK-1 позволяет хромосомам отсоединиться от ЯО, что приводит к формированию нормальной кариосомы. Однако при нарушении фосфорилирования BAF – хорошо известного связующего звена между хроматином и ЯО благодаря его взаимодействиям с ДНК и LEM-D-белками ядерной оболочки (Jamin, Wiebe, 2015) – хромосомы остаются связанными с ЯО (Lancaster et al., 2007). Весьма вероятно, что это эволюционно консервативный механизм, принимая во внимание консерватизм BAF и NHK-1.

“Сгустки” электронно-плотных тяжей – единственные структуры, которые потенциально могли бы претендовать на роль элементов КК. Эти тяжи связывают “колечки” (annuli), демонстрирующие большое морфологическое сходство с “автономными” поровыми комплексами (Gruzova, Parfenov, 1977), и ассоциированы с тонкофибриллярным актинсодержащим материалом. По-видимому, annuli в действительности не являются аналогами ЯПК, поскольку они не содержат по крайней мере одного необходимого нуклеопорина – Nup35. Более того, тяжи не содержит ни актина, ни ламина B и потому не могут считаться КК-подобными структурами, в особенности потому, что они формируют только “сгустки”, но не протяженные образования. Интересно, что у озерной лягушки Pelophylax ridibundus (ранее R. ridibunda) хромосомы в составе кариосферы присоединены к наружной стороне центрального тела, которое состоит из материала, морфологически сходного с тяжами и annuli ЗП R. temporaria (Parfenov, 1979).

Резонно предполагалось, что тяжи являются производными СК, прежде всего их центральных элементов (Gruzova, Parfenov, 1993). В ЗП некоторых двукрылых насекомых, таких как малярийный комар Aedes aegypti, формируется сложная КК, которая, как считают, образована несколькими слоями множественных аномальных СК, называемых поликомплексами. Кроме того, на ультраструктурном уровне в КК комаров подробно охарактеризованы внутриядерные пористые пластинки (intranuclear annulata lamellae), которые содержат annuli, напоминающие по своей структуре автономные ЯПК (Fiil, Moens, 1973; Fiil, 1974, 1976). Природу всех типов этого специфического экстрахромосомного материала еще предстоит установить.

В заключение, наши знания о клеточном ядре, особенно ЗП, несомненно, еще далеко не полные даже на уровне морфологии клетки. Приведенные здесь данные следует обязательно учитывать как основу для дальнейших исследований ЗП амфибий, широко используемого в качестве экспериментальной модели.