Электрохимия, 2022, T. 58, № 4, стр. 179-187

ВВЕДЕНИЕ

Модификация биологических объектов с помощью наночастиц является одной из наиболее горячих тем на стыке физики с биологией и медициной. Управляемое введение наночастиц в клетки позволяет контролировать их нагрев, химические реакции в них, является ключом к адресной доставке лекарств, а также помогает развивать немеханические методы избирательного перемещения клеток, например с помощью магнитных пинцетов. Липидные мембраны являются защитной оболочкой клеток и поэтому механизмы проникновения наночастиц через мембрану находятся в фокусе внимания исследователей. Подробно исследовано влияние размера частиц [1, 2] и их формы [3, 4], кривизны изгиба мембран [5], полярных групп липидов и их взаимодействий с наночастицами [6] на проникновение наночастиц через липидные мембраны. Ранее сообщалось о том, что электрически заряженные золотые [1] или полимерные [2] наночастицы вызывают образование обширных (до 100 нм диаметром) дефектных областей фосфолипидной мембраны, окружающих сравнительно небольшие наночастицы диаметром 20 нм. Электрическая проводимость в мембранах без наночастиц осуществляется благодаря флуктуационному возникновению в них пор, которые образуются на короткое время и затем затягиваются липидами, диффундирующими в сторону таких короткоживущих дефектов.

В настоящей работе изучено влияние наночастиц феррита кобальта (CoFe₂O₄) на электрические свойства фосфолипидных мембран. Нами были выбраны частицы феррита кобальта CoFe₂O₄ потому, что именно эти частицы, обладая хорошей биосовместимостью, считаются перспективными для противораковых и других медицинских применений [7]. Низкая растворимость CoFe₂O₄ в воде ~1 мкл/л [8], обеспечивает биосовместимость и позволяет пренебрегать появлением частиц в растворе, окружающем мембрану. В [9] наночастицы CoFe₂O₄ были диспергированы в воде без потери их свойств. Фотовольтаическая активность [10], ширина запрещенной зоны 1.57–2.03 эВ и ферромагнитные свойства делают частицы CoFe₂O₄ функциональными в магниторезонансной томографии и гипертермии [11, 12].

Наночастицы и их кластеры способны вызывать в липидной мембране структурную реорганизацию, формирование пор, изменение кривизны мембран [1–6]. Электрическая ионная проводимость мембран – весьма чувствительный отклик на нарушение их структурной целостности, появление дефектов и растяжения, вызванные внешними факторами. Мы использовали частицы кубической формы (рис. 1), так как они концентрируют магнитное поле рассеяния частиц, необходимое для их обнаружения в мембране методом магнитной силовой микроскопии (МСМ) [13]. Методом МСМ измеряют локальную намагниченность наночастиц (их поля рассеяния) по значению сдвига фазы колебаний кантилевера, которая прямо пропорциональна градиенту магнитной дипольной силы, возникающей между частицей и магнитным кантилевером. Поскольку липидная мембрана диамагнитная, то лишь поле рассеяния магнитных наночастиц будет давать контраст на магнитно-силовом изображении. Кроме того, кубическая форма обеспечивает концентрацию электрического поля для заряженных частиц и механических напряжений в вершинах куба, увеличивая эффективность возникновения дефектов в мембране под действием наночастиц.

В нашей работе проведен анализ электрической проводимости азолектиновой бислойной мембраны, в которой находятся наночастицы феррита кобальта. Отметим, что увеличение проницаемости мембран является ключевым при адресной доставке лекарств с помощью наночастиц, используемых в качестве диагностических и терапевтических агентов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Наночастицы CoFe₂O₄ были синтезированы в НИТУ МИСИС (рис. 1). Химическая стратегия приготовления наночастиц показана на рис. S1 в дополнительных материалах. После приготовления наночастицы (НЧ) были центрифугированы в течение 30 мин при 6000 об/мин и растворены в чистом толуоле (концентрация 5 мг/мл). Для визуализации частиц 10 мл коллоидального раствора НЧ в толуоле были помещены на карбоновую подложку и покрыты углеродной пленкой Agar Scientific, 300 mesh. После выдержки в течение суток анализ формы производили с помощью микроскопа JEOL JEM-1400 при ускоряющем напряжении 120 кВ. Средняя диагональ двух изученных образцов наночастиц составляла 27 нм (МНЧ-27) (рис. 1) или 14 нм (см. рис. S2 в дополнительных материалах) (МНЧ-14).

Азолектин (Avanti Polar Lipids, Alabaster) был использован для формирования плоских бислойных мембран в растворе 0.1 M KCl. Азолектиновые мембраны были сформированы на круглом отверстии площадью 0.64 мм² в перегородке тефлоновой кюветы при температуре 21 ± 1°C. Мембранный раствор содержал азолектин в “х. ч.” декане в концентрации 30 мг/мл. Наночастицы, диспергированные в толуоле, были добавлены в мембранный раствор в концентрациях 50–450 мкг/мл. Ток через мембрану измеряли с помощью электродов Ag–AgCl, подключенных к усилителю VA-10X (NPI Electronics GmbH, Germany) с сопротивлением обратной связи 5 ГОм и постоянной времени 20 мс. Флуктуации тока через мембрану записывали в компьютер с частотой 1 кГц с помощью 16-разрядного АЦП (L-Card, Russia).

Полученные в экспериментах при постоянном напряжении на мембране токовые треки содержали импульсы. Мы полагаем, что эти импульсы обусловлены сквозными порами. Если рассматривать эти поры как цилиндры и считать, что удельная проводимость в поре равна проводимости в растворе, то радиус пор R определяется известной формулой (см., например, [14]):

где h = 5 нм – толщина мембраны, G – проводимость поры, g = 1.04 См/м – удельная проводимость 0.1 М раствора KCl при комнатной температуре.

Образцы мультиламелярных везикул были приготовлены диспергированием азолектина в дистиллированной воде (pH 6.9) в ультразвуковой ванне, работающей на частоте 37 кГц, в течение 15 мин. Концентрация липидов составила 1 мг/мл. Наночастицы, диспергированные в толуоле, добавляли в суспензию липосом, чтобы получить концентрацию 50 мкг/мл. Данную смесь снова помещали в ультразвуковую ванну в течение 5 мин.

Полевые зависимости магнитного момента М наночастиц CoFe₂O₄, нормированного на намагниченность насыщения М_S частиц, до и после их помещения в суспензию липосом были измерены на магнитометре MPMS 5XL Quantum Design при комнатной температуре в диапазоне полей ±1 кЭ. Наночастицы в толуоле и суспензия липосом с наночастицами наносились на диамагнитную подложку и высушивались, после чего измеряли их магнитный момент при одинаковых условиях.

Топография поверхности и распределение градиента магнитного поля рассеяния наночастиц были записаны с помощью атомного силового микроскопа (АСМ) Integra-Aura (NT MDT) и магнитного силового микроскопа (МСМ), оснащенного приставкой для создания магнитного поля. Мы прикладывали поле 1 кЭ во время записи распределения градиента магнитного поля, чтобы увеличить магнитный контраст, соответствующий наночастицам в мембране. Образцы для АСМ- и МСМ-сканирования были приготовлены по одному и тому же протоколу, при котором в контрольном опыте наночастицы, диспергированные в толуоле, были высушены на графитовой подложке, а в опыте с липосомами тот же объем наночастиц в толуоле был добавлен в суспензию липосом с последующей сушкой на графитовой подложке. Поскольку частицы были погружены в мембрану, их вклад в рельеф поверхности не обнаруживался в режиме АСМ, в то время как в режиме МСМ дальнодействующие поля рассеяния частиц позволяли судить об их наличии и концентрации. В режиме МСМ был использован стандартный кантилевер MFM-LM, покрытый слоем CoCr с коэрцитивной силой 400 Э, меньшей, чем коэрцитивная сила наночастиц 800 Э. Силовая константа 5 Н/м и резонансная частота кантилевера 63 кГц были определены в опытах с контрольным образцом.

При сканировании липидного раствора с наночастицами двухпроходной методикой в полуконтактном режиме, которую мы использовали, происходит сбор информации не только о морфологии поверхности, но и локальном распределении намагниченности [13]. Колеблющийся кантилевер при первом проходе испытывает влияние сил Ван-дер-Ваальса. В результате взаимодействия зонда и образца изменяются амплитудно-фазовые характеристики зонда, по которым в дальнейшем строится изображение поверхности. При втором проходе кантилевер направляют по тому же маршруту, при этом он не касается поверхности (движется на выбранной высоте 50 нм) и испытывает лишь влияние полей рассеяния наночастиц. В этом случае, по результату изменения сдвига фазы колебаний кантилевера строится картина магнитных свойств поверхности – распределение градиента магнитного поля. Формирование темных и светлых пятен на МСМ-изображении соответствует притяжению или отталкиванию магнитного кантилевера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Были получены зависимости намагниченности наночастиц от величины поля, имеющие форму гистерезиса, до и после их помещения в диамагнитную мембрану (рис. 2). Исходные наночастицы, нанесенные на диамагнитную графитовую подложку, демонстрируют узкую петлю гистерезиса, характерную для суперпарамагнитного поведения. Неизменность магнитного момента насыщения наночастиц (рис. 2) свидетельствует о том, что растворением частиц в воде можно пренебречь. В образце высушенной мембраны с наночастицами наблюдается небольшое увеличение коэрцитивной силы, вызванное фиксацией частиц в высушенной мембране и предотвращением их механического вращения при изменении знака внешнего магнитного поля.

Результаты АСМ- и МСМ-сканирования образца с липидами и без, с наночастицами и без них представлены на рис. 3. В контрольном опыте был записан профиль АСМ поверхности графита с диспергированными на нем наночастицами (без мембраны) (рис. 3а). Этот профиль содержал узкие пики шириной ~0.05 мкм (рис. 3г). Плавный рельеф АСМ (рис. 3б) и соответствующий профиль (рис. 3д) высушенной мембраны c частицами на графитовой подложке с шириной пиков на полувысоте ~0.5 мкм соответствуют рельефу липидной мембраны, обычно демонстрируемой в литературе [13]. Мембрана с наночастицами не дает острых пиков в режиме АСМ, поскольку наночастицы погружены в нее. Обратный ход кантилевера по той же траектории в режиме МСМ выявил частицы на МСМ-изображении (показаны стрелками на рис. 3в) и острые пики на профиле мембраны с наночастицами (рис. 3е). Дальнодействующее магнитное поле рассеяния частиц эффективно притягивало кантилевер даже в условиях, когда они находились внутри мембраны. Острые пики на МСМ-профиле имеют полуширину ~0.05 мкм и разделены расстоянием 0.2–0.3 мкм. Мы ассоциировали эти пики с наночастицами и/или их кластерами в мембране.

Оценим число наночастиц, находящихся в бислойной липидной мембране. Если предположить, что соотношение числа наночастиц к числу молекул липида, характерное для мембранного раствора, сохранилось и в бислое, то при концентрации МНЧ-14 в мембранном растворе 50 мкг/мл концентрация наночастиц на поверхности мембраны составляет 1.74 1/мкм², а характерное расстояние между ними 0.76 мкм. При увеличении концентрации наночастиц в мембранном растворе в 9 раз, характерное расстояние между частицами уменьшается до 0.25 мкм (расчеты представлены в дополнительных материалах). Отметим, что эти оценки одного порядка с величинами, полученными с помощью МСМ.

Эксперименты с плоскими бислойными липидными мембранами показали, что проводимость мембраны с наночастицами увеличивалась по сравнению с проводимостью без наночастиц (с фоновой проводимостью). Исследовали 21 мембрану с МНЧ-14 и 11 мембран с МНЧ-27. Зависимость удельной проводимости мембраны от концентрации МНЧ-14 показана на рис. 4. Горизонтальной линией показана фоновая проводимость мембраны 67 ± 13 пСм/мм². При малых концентрациях наночастиц (менее 250 мкг/мл) крутизна кривой невелика (около 5 × 10^–4 (нСм/мм²)/(мкг/мл)). При концентрациях, больших 250 мкг/мл, крутизна кривой увеличивается приблизительно в 8 раз. Аналогичный рост проводимости от ~0.2 to ~3 нСм/мм² наблюдался и в мембране с добавленными наночастицами размером 27 нм (см. рис. S3 в дополнительных материалах). На рис. 4 также показана линия, аппроксимирующая экспериментальные данные функцией вида σ = σ₀ + aс^b, где σ₀ – проводимость контрольных мембран, c – концентрация МНЧ-14, a = 3.9 × 10^–5 и b = 2.75 – подгоночные параметры. Если связать увеличение интегральной проводимости мембраны с появлением сквозных проводящих пор, то полученный показатель степени свидетельствует о том, что для формирования поры необходимо наличие двух-трех наночастиц.

Помимо увеличения интегральной проводимости под действием наночастиц были обнаружены токовые импульсы длительностью ~0.1 с, обусловленные, как мы предполагаем, формированием сквозных пор, возникающих при превышении концентрации 250 мкг/мл для МНЧ-14 и при меньшем значении концентрации 50 мкг/мл для МНЧ-27 (рис. 5). Проводимость импульсов составляет ~100–150 пСм при напряжениях 25 и 50 мВ.

Дискретность токовых импульсов (рис. 5б) обусловлена возникновением проводящих пор. Три максимума с отношением проводимостей 1 : 2.1 : 3 можно видеть на гистограмме на рис. 5б. Это можно интерпретировать, как открытие 1, 2 или 3 пор одновременно. Однако, момент открытия поры с фоновой проводимостью 100 пСм не был зарегистрирован, потому рассмотрим три состояния мембраны: “нет пор” – фоновая проводимость ~100 пСм, “одна пора” – проводимость ~210 пСм, “две поры” – проводимость ~300 пСм. Если предположить, что эти состояния удовлетворяют пуассоновскому распределению, то соотношение вероятностей этих состояний должно определяется как exp(–λ) : λexp(–λ) : 0.5λ²exp(–λ), где λ – среднее число пор, существующих на мембране одновременно. Экспериментальное соотношение вероятностей для трека, показанного на рис. 5б, равно 0.87 : 0.09 : 0.04, что позволяет рассчитать параметр λ = 0.17. Соотношение вероятностей, рассчитанное исходя из пуассоновского распределения, равно 0.845 : 0.142 : 0.012. Различия в экспериментальных и расчетных вероятностях для состояний “нет пор” и “одна пора” незначительны: различия составляют 3 и 33% соответственно. Вероятности состояния “две поры” различаются в три раза, что говорит о зависимости состояния “две поры” от двух других состояний мембраны.

Распределения радиусов и времени жизни пор и длительности межимпульсных интервалов для МНЧ-14 и МНЧ-27 показаны на рис. 6. В случае с МНЧ-14 поры возникали только при концентрации наночастиц, большей 250 мкг/мл. При этим условии было исследовано 11 мембран, в восьми из которых зарегистрировано 77 пор. В случае с МНЧ-27 поры возникли уже при минимальной использованной концентрации наночастиц 50 мкг/мл: в восьми из одиннадцати мембран зарегистрирована 171 пора. Статистически значимых отличий в распределениях для МНЧ-14 и МНЧ-27 не обнаружено. Средние значения и стандартные отклонения параметров представлены в табл. 1. То, что средние значения и стандартные отклонения для времени жизни и для МНЧ‑14, и для МНЧ-27, и для межимпульсного интервала для МНЧ-14 практически совпадают, говорит об экспоненциальном характере распределений. То, что стандартное отклонение для межимпульсного интервала для МНЧ-27 больше среднего значения, говорит о наличии нескольких стадий в процессе формирования пор в этом случае. Например, это может свидетельствовать о медленном процессе, в результате которого в интактной мембране возникает и исчезает область, где могут формироваться поры. Второй, более быстрый процесс связан с открытием и закрытием пор в этой области мембраны.

Магнитные наночастицы (как и любые инородные структуры) вызывают возникновение в мембране дефектов, что приводит к росту проводимости мембраны. Однако предположение, что гидрофобные наночастицы непосредственно образуют стенки поры, представляется маловероятным. Мы предполагаем, что гидрофобные наночастицы полностью погружены в гидрофобную часть бислоя и образуют как бы микролинзы на его поверхности. Подобные структуры ограничивают латеральное перемещение липидов. Возможно, для формирования подобных кластеров необходимо наличие двух-трех наночастиц (см. показатель степени при аппроксимации зависимости проводимости мембран от концентрации МНЧ-14). Нам представляется, что такие структуры можно сравнить с зародышами гель-фазы при фазовом переходе липидов из жидкокристаллического в гель-состояние [15]. Эти образования препятствуют свободному затеканию проводящих дефектов, которые возникают при появлении в мембране наночастиц, что приводит к дополнительному росту проводимости.

Отметим, что одновременно с измерением электрической проводимости мы измеряли удельную емкость мембраны, которая практически не изменялась при вариациях концентрации наночастиц (рис. S5 в доп. материалах). Поэтому уменьшение толщины мембраны можно исключить из списка причин роста проводимости.

Для проверки гипотезы об ограничении свободного латерального движения липидов были проведены измерения жесткости азолектиновых мембран при добавлении в них МНЧ-14. Как известно, при подаче на мембрану напряжения емкость мембраны увеличивается. В частности, это связывается с тем, что остатки растворителя (декана) в результате электрострикции уходят из мембраны в торус [16], и толщина мембраны уменьшается. В более пластичных мембранах это движение растворителя проявляется в сильных изменениях мембранного емкостного тока. В более жестких мембранах изменения тока не столь существенны. На рис. 7 приведены изменения мембранного тока при подаче на мембрану пилообразного напряжения. При росте напряжения мембранный ток положителен за счет положительной емкостной составляющей, при снижении напряжения – отрицательный. Для более жесткой мембраны, емкость которой меняется незначительно, емкостный ток в течение полупериода приложенного напряжения будет практически постоянным. Для пластичной мембраны емкостный ток будет выглядеть как парабола с экстремумом при нулевом напряжении. Из рис. 7 видно, что при добавлении наночастиц мембрана становится, по сравнению с контролем, более жесткой, т.е. транспорт растворителя внутри мембраны к торусу ограничен. Это косвенно говорит в пользу гипотезы об ограничении свободного движения липида в мембране с наночастицами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обнаружено влияние наночастиц феррита кобальта на проводимость бислойных азолектиновых мембран. Добавление наночастиц CoFe₂O₄ кубической формы размерами 14 или 27 нм вызывает увеличение электрической проводимости азолектиновых мембран в ~10–40 раз относительно фоновой проводимости 67 ± 13 пСм/мм². При этом в мембране возникают проводящие липидные поры.