Журнал физической химии, 2021, T. 95, № 5, стр. 810-817

ЭКCПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4-Этил-, 4-аллил- и 4-фенил-1,1-диметилтиосемикарбазиды (I, II и III, соответственно) были получены по методике [2] путем добавления свежеперегнанного несимметричного диметилгидразина (НДМГ) (Нефтеоргсинтез, Салават) к растворам этил-, аллил- или фенилизотиоцианатов в дихлорметане (Aldrich, США). S,N-производные 1-метил- и 1,1-метилэтил-гидразинов (Aldrich, США) получали аналогичным образом. Реакции дериватизации протекают при 20°С без доступа воздуха за 1 ч.

Анализ реакционных смесей проводили на хромато-масс-спектрометре JEOL JMS-D300 (Jeol, Япония) с газовым хроматографом НР-5890 (Hewlett-Packard, США) и кварцевой капиллярной колонкой с неподвижной фазой DB-5 (J&W Scientific Inc., США) размером 30 м × 0.35 мм. Температура инжектора повышалась до 300°C со скоростью 5°C/мин, скорость газа-носителя (гелия) – 5 мл/мин, деление потока 1:10.

Хроматографический анализ методом ВЭЖХ проводили на хроматографе Agilent 1200 (Agilent Technologies, США) с УФ диодно-матричным детектором Agilent G1315B, программным обеспечением ChemStation А.10.02. и колонками: Zorbax-С18 Eclipse XDB (Agilent Technologies, США), Zorbax-CN (DuPont Instruments, США) размерами 4.6 × 150 мм, Hypercarb (Thermo Scientific, США) размером 2.1 × 100 мм. Удельная поверхность по БЭТ силикагелей с привитыми группами –С18 и –CN, составляла 180 м²/г, размер зерна 5 мкм, диаметр пор 80 и 70 Å, соответственно. Удельная поверхность пористого графитированного углерода ПГУ – 120 м²/г, размер зерна 5 мкм, диаметр пор 250 Å. Хроматографические разделения проводили в изократическом режиме при скорости элюента 0.5 мл/мин. В качестве элюентов использовали 50% раствор метанола в воде и 30% раствор пропанола-2 в н-гексане. Все растворители от Sigma-Aldrich (США) имели квалификацию HPLC. Идентификацию соединений проводили по поглощению при 240 нм.

Расчет индексов удерживания I_r соединений проводили в соответствии с инкрементами функциональных групп их молекул [8]. Фактор липофильности $\log P$ оценивали с помощью алгоритма XLogP [9].

Масс-спектры электронной ионизации (ЭИ) получены на масс-спектрометре JEOL JMS-D300 с прямым вводом образца в режиме положительных ионов в диапазоне масс 40–450 Да. Энергия ионизирующих электронов 70 эВ, ускоряющее напряжение 3 кВ, ток ионизации 300 мкА. Идентификацию соединений осуществляли с помощью программы библиотечного поиска и на основании расшифровки масс-спектров с использованием основных закономерностей фрагментации [10].

Масс-спектрометрические эксперименты с ЛДИ выполнены на масс-спектрометре Ultraflex II TOF (Bruker Daltonics, Германия) с азотным лазером (λ = 337 нм, энергия лазера 110 мкДж, частота импульса 20 Гц, количество импульсов 25–50, время между импульсами 1 мкс) и времяпролетным масс-анализатором с рефлектроном. Ускоряющее напряжение и напряжение на рефлектроне – 25 и 26.5 кВ, соответственно. Спектры получены в режиме регистрации положительных ионов и обработаны с помощью программного обеспечения FlexControl 3.4 и FlexAnalysis 3.4. (Bruker, Германия). Калибровку масс осуществляли по методам внешнего и внутреннего стандарта, используя значения масс пиков ионов матриц. Для изучения фрагментации исходных метастабильных протонированных молекул тиосемикарбазидов применяли режим распада за пределами ионного источника. Масс-спектры ионов-продуктов регистрировали с помощью метода FAST (Bruker Daltoniсs).

Раствор матрицы DHB – 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Bruker Daltoniсs, Германия), с концентрацией 1 мг/мл готовили в 80% растворе метанола в воде. На поверхность металлической мишени AnchorChip 600 мкм (Bruker) наносили 1 мкл матрицы и после ее высушивания при комнатной температуре добавляли 1 мкл анализируемого раствора.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В газовой хроматографии разделение смесей обусловлено селективным взаимодействием между веществами и неподвижной фазой. Как видно на хроматограмме реакционной смеси (рис. 1а), молекулы тиосемикарбазидов сильнее взаимодействуют с полисилоксановой неподвижной фазой, чем более полярные молекулы изотиоцианатов, причем время удерживания t_R плоской молекулы аллилтиосемикарбазида II (sp²-гибридизация атома углерода) больше, чем t_R молекулы этилтиосемикарбазида I (sp³-гибридизация атома углерода). Обнаружена линейная зависимость между экспериментально измеренными значениями t_R тиосемикарбазидов и изотиоцианатов и теоретически рассчитанными индексами их удерживания I_r (рис. 1б), которая может быть описана уравнением y = 32.113x + 561.55 с коэффициентом корреляции r² = 0.9976. Небольшая разница между индексами удерживания тиосемикарбазидов I и II (1351 и 1439 соответственно) может затруднить полное разделение этих соединений методом газовой хроматографии.

Рис. 1.

Хроматограмма реакционной смеси (а) и корреляционная зависимость времени и индексов хроматографического удерживания (б) этил- и аллилизотиоцианатов (1 и 2) и тиосемикарбазидов I, II (3 и 4 соответственно).

Алкильный заместитель обеспечивает более высокую летучесть этилтиосемикарбазида I. Фенильный заместитель фенилтиосемикарбазида III вносит большой вклад в его значение I_r = 1824 на полисилоксановой неподвижной фазе, однако это мало летучее и термолабильное соединение полностью разлагается в хроматографической системе на диметилгидразин и фенилизотиоцианат.

В масс-спектре ЭИ тиосемикарбазида I (табл. 1) присутствуют интенсивный пик молекулярного иона с m/z 147 и пики характеристических ионов с m/z 59 и 60, образовавшихся, предположительно, в результате элиминирования иона диметилгидразина с m/z 60 и его фрагмента c m/z 59.

В масс-спектре II помимо мало интенсивного пика молекулярного иона с m/z 159 присутствует две пары интенсивных пиков характеристических ионов с m/z 59, 60 и 115, 116, которые удобно использовать при идентификации микроколичеств II. Их образование, вероятно, можно объяснить внутримолекулярной циклизацией молекулярного иона в 2‑имидазолидинтионовый цикл с последующим элиминированием из молекулярного иона диметиламиногруппы и метилимина формальдегида (схема 1). Предполагается, что структуры фрагментных ионов стабилизированы за счет внутримолекулярной водородной связи либо таутомерных переходов.

Схема 1.

Фрагментация молекулярного иона аллилтиосемикарбазида II с m/z 159.

Дополнительным критерием идентификации соединений I и II может служить время их удерживания или индексы удерживания.

Таким образом, метод газовой хроматографии позволяет эффективно разделить тиосемикарбазиды I, II и отделить их от избытка исходных реагентов. Однако этот метод не применим для анализа мало летучих и термолабильных соединений типа фенилтиосемикарбазида III. Более перспективным для исследования всех синтезированных тиосемикарбазидов является метод жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической идентификацией соединений в режиме off-line.

На рис. 2 приведены результаты разделения смесей трех тиосемикарбазидов на ПГУ и модифицированных силикагелях с полярным элюентом (50 об. % метанола в воде). Тиосемикарбазиды I–III имеют одинаковый набор функциональных групп и отличаются только углеводородным радикалом, поэтому их факторы хроматографического удерживания при одинаковом составе элюента преимущественно будут определяться гидрофобными взаимодействиями с сорбентом. Во всех случаях эти взаимодействия усиливаются с увеличением количества атомов углерода в гидрофобном радикале тиосемикарбазидов: Et–All–Ph (рис. 2). В той же последовательности увеличиваются факторы липофильности тиосемикарбазидов $\lg P$: 1.11–1.30–2.35, которые характеризуют способность вещества к переходу из неполярной фазы в полярную; и времена удерживания тиосемикарбазидов на Zorbax-CN из неполярного элюента (30% раствор пропанола-2 в н-гексане) при разделении смесей в режиме НФ ВЭЖХ. В условиях ОФ ВЭЖХ на колонках Hypercarb и Zorbax-С18, а также в условиях НФ ВЭЖХ на колонке Zorbax-CN достигается хорошее разделение компонентов реакционных смесей и выделение целевых соединений.

Рис. 2.

Хроматограммы разделения смеси тиосемикарбазидов I (1), II (2) и III (3) на колонках Hypercarb (а), Zorbax-С18 (б) и Zorbax-CN (в). Элюент: 50 об. % метанола в воде.

При увеличении температуры удерживание соединений I–III закономерно снижается, но изменения порядка выхода веществ не происходит. В интервале температур 298–318 К для всех использованных сорбентов зависимости факторов удерживания тиосемикарбазидов $\ln k{\kern 1pt} '$ от обратной температуры близки к линейным (коэффициенты корреляции r² = 0.9874–0.9993). Приведенный в табл. 2 температурный коэффициент сорбции V = [($k_{1}^{'}$ – $k_{2}^{'}$) – 1]/(T₂ – T₁) позволяет определить изменение фактора удерживания вещества при изменении температуры на 1 К. Минимальное влияние температура оказывает на удерживание тиосемикарбазидов I и II на колонке Zorbax-C18.

Наибольшие значения энтальпии сорбции соединений I–III наблюдаются на ПГУ (колонка Hypercarb). Сравнительный анализ влияния сорбентов на изменение термодинамических функций аллил- и фенилтиосемикарбазидов II и III относительно этилтиосемикарбазида I (выбранного стандартом) позволил обнаружить, что значение δ(ΔS°) при переходе от соединения II к тиосемикарбазиду III на ПГУ увеличивается в 28 раз, тогда как на других сорбентах значение δ(ΔS°) уменьшается (табл. 3). Эта аномалия указывает на существенные различия в механизмах сорбции тиосемикарбазидов на ПГУ и модифицированных силикагелях.

Основной вклад в удерживание соединений на ПГУ и модифицированном силикагеле вносят неспецифические межмолекулярные взаимодействия молекул сорбатов с поверхностью. Вместе с тем на поверхности ПГУ реализуются специфические межмолекулярные взаимодействия сорбатов с базисной гранью графита и остаточными функциональными группами [11]. Поверхность ПГУ характеризуется высокой чувствительностью к особенностям электронного строения молекул тиосемикарбазидов с различной стереохимией, что значительно увеличивает диапазон его селективности в отношении различных органических соединений. Селективность сорбента ПГУ по отношению к тиосемикарбазидам почти в 1.5 раза выше, чем селективность SiO₂ с привитыми группами –С18 и –CN: α = 1.9, 1.4 и 1.3 соответственно.

Время нахождения сорбата в неподвижной фазе зависит не только от природы сорбента, но и от используемого элюента. Изучение влияния состава подвижной фазы позволило обнаружить, что удерживание тиосемикарбазидов на всех сорбентах закономерно увеличивается по мере снижения объемной доли φ органического модификатора (метанола) в воде. Соединение III с метанолом взаимодействует слабее I и II. Для него уравнения зависимости 1/k' = f(φ) на колонках Hypercarb, Zorbax-С18 и Zorbax-CN выглядят следующим образом:

Состав полярного элюента влияет на удерживание III на сорбенте ПГУ значительно слабее, чем на модифицированных силикагелях. Вероятно, это следствие того, что поверхность ПГУ нельзя рассматривать как полностью гидрофобную неполярную, а основным механизмом адсорбции не являются гидрофобные взаимодействия.

Идентификацию тиосемикарбазидов при их исследовании методом ВЭЖХ проводили спектрофотометрически по интенсивной полосе поглощения в области 240 нм. Относительно поглощения изотиоцианатов она сдвинута в длинноволновую область, поэтому даже большой избыток реагентов не мешает определению целевых компонентов. Однако в присутствии буферов, примесей и других соединений в хроматографической системе возможно наложение полос поглощения компонентов смесей. В этом случае, а также при хроматографическом исследовании малолетучих и термолабильных соединений для их идентификации применяли метод МАЛДИ-МС в режиме off-line, т.е. после полного завершения процесса разделения [7]. Поскольку тиосемикарбазиды практически не поглощают излучение азотного лазера с λ = 337 нм, к ним добавляли матрицу DHB, которая способна поглощать лазерное излучение масс-спектрометра, переносить протоны в ходе процесса ионизации, обладает низкой летучестью в условиях вакуума, инертна по отношению к тиосемикарбазидам и способна к сокристаллизации с ними. В МАЛДИ масс-спектре тиосемикарбазида I с этой матрицей помимо пиков протонированных и катионированных молекул I ([М + Н]⁺, [М + Na]⁺, [М + К]⁺ с m/z 148, 171, 183, соответственно), присутствуют пики их молекулярных ассоциатов с матрицей и кластерных ионов матрицы с m/z 155, 177 и 193 (рис. 3).

Рис. 3.

Масс-спектр МАЛДИ тиосемикарбазида I (m/z 148) с матрицей DHB.

Максимальная интенсивность пиков протонированной молекулы тиосемикарбазида I достигается при соотношении матрица/аналит Mt/A = 100, тиосемикарбазида II – при Mt/A = 1, фенилтиосемикарбазида III при Mt/A = 1000. Причиной влияния концентрации матрицы (органической кислоты) на эффективность ионизации молекул I–III, отличающихся только природой заместителя, по данным [7], является различие в их основности в газовой фазе.

Надежно идентифицировать тиосемикарбазиды методом масс-спектрометрии ЭИ позволяет присутствие в их масс-спектрах не только молекулярных, но и характеристических ионов (табл. 1). В связи с этим были исследованы процессы фрагментации метастабильных протонированных молекул тиосемикарбазидов, ускоренных в ионном источнике, в условиях МАЛДИ (табл. 4). Необходимо отметить, что распаду за пределами ионного источника подвергаются также и кластерные ионы матрицы DHB, что несколько осложняет проведение масс-спектрометрического анализа в диапазоне масс 20–200 Да.

В масс-спектрах фрагментации исходных ионов тиосемикарбазидов I–III присутствуют пики их протонированных молекул [M + Н]⁺ и пики характеристических ионов с m/z 46, 61, 78, 103. Анализ обнаруженных фрагментов позволяет предположить, что распад метастабильных протонированных молекул тиосемикарбазидов происходит в результате разрыва химических связей, ближайших к атому азота, после присоединения к нему протона (схема 2). Распад молекул I–III приводит к элиминированию нейтральных аминосоединений (этиламина, аллиламина, анилина и диметилгидразина), а также молекулы сероводорода. Это соответствует данным [12] об основных схемах фрагментации аминов в процессе ЛДИ в растворах и газовой фазе.

Схема 2.

Фрагментация метастабильных протонированных молекул тиосемикарбазидов I–III.

Особое значение в идентификации методом МАЛДИ-МС 1,1-диметилгидразина в виде S,N-производного имеет фрагментный ион c m/z 78, образование которого не зависит от природы заместителя R в тиосемикарбазидах I–III и связано только с наличием в их структуре остатка 1,1-диметилгидразина. В масс-спектрах ЭИ ион c m/z 77 наблюдается только у соединения III (табл. 1). Обнаружено сходство фрагментации тиосемикарбазида III в режимах ЭИ и МАЛДИ. В режиме ЭИ (табл. 1) наблюдается элиминирование молекулы сероводорода и образование иона с m/z 161, соответствующего 1-диметиламино-4-фенилкарбодиимиду, элиминирование фрагментов 1,1-диметилгидразина с m/z 60, анилина с m/z 93 и расщепление связи N–N с образованием иона диметиламина с m/z 45. В условиях ионизации МАЛДИ (табл. 4) осколочные ионы детектируются в соответствующей протонированной форме.

Кроме вышеуказанных ионов в масс-спектрах МАЛДИ тиосемикарбазидов, полученных в режиме распада после ионного источника, присутствуют пики ионов [M + H–2]⁺ и [M + H–4]⁺ (табл. 4). Их образование, вероятно, обусловлено протекающими в условиях ионизации МАЛДИ процессами дегидрирования протонированных молекул аминов, которые наблюдались в [11]. Доля дегидрированных ионов [M + H–4]⁺ увеличивается на 40% при увеличении энергии лазера с 35 до 40%.

Масс-спектры МАЛДИ фрагментации метастабильных протонированных аллил- и фенил-S, N-производных 1,1-метилэтилгидразина близки масс-спектрам S,N-производных 1,1-диметилгидразина I–III и отличаются на гомологическую разность 14 Да (табл. 5). Масс-спектры фрагментации ионов [M + H]⁺ аллил- и фенил-S,N-производных 1-метилгидразина содержат пики ионов метилгидразиния с m/z 47, протонированного N-метиламиноизотиоцианата с m/z 89 и аллиламмония с m/z 58 (схема 3). Распад всех аллилсодержащих тиосемикарбазидов сопровождается образованием ионов аллиламмония с m/z 58; фрагментация всех фенилсодержащих тиосемикарбазидов строго индивидуальна и зависит от состава исходных алкилгидразинов.

Схема 3.

Фрагментация метастабильных протонированных аллил- и фенил- S,N-производных 1-метилгидразина.

Таким образом, проведенные исследования продуктов дериватизации алкилгидразинов с помощью изотиоцианатов позволяют эффективно разделять компоненты реакционных смесей и надежно идентифицировать S,N-производные алкилгидразинов на основе хроматографических параметров удерживания и масс-фрагментации в режимах ЭИ и МАЛДИ.

Таким образом, методами масс-спектрометрии в режимах ЭИ и МАЛДИ в сочетании с методами газовой и жидкостной хроматографии изучены продукты взаимодействия алкилгидразинов с этил-, аллил- и фенилизотиоцианатами. Оптимизированы условия разделения реакционных смесей методами газовой и жидкостной хроматографии, а также идентификации целевых соединений в on-line и off-line режимах. Определены физико-химические характеристики сорбции тиосемикарбазидов. Изучены процессы распада и фрагментации их метастабильных протонированных молекул, ускоренных в ионном источнике. Предложены схемы образования фрагментных и характеристических ионов тиосемикарбазидов в различных режимах ионизации.

Работа выполнена в рамках Государственного задания ИФХЭ РАН и при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 18-08-01224а).

Авторы благодарят Центр коллективного пользования ИФХЭ РАН за предоставленное для исследований оборудование.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.