Журнал физической химии, 2021, T. 95, № 8, стр. 1200-1210

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Использовали препараты A, Ado и ADP фирмы “Serva”, В качестве неорганического фосфата (P_i) использовали соль NaH₂PO₄ ⋅ 2H₂O класса “extra pure”, остальные реактивы – класса “х.ч.”. Для приготовления растворов применяли воду, очищенную на установке Millipore. Эксперименты выполняли в слабокислой среде (pH 6.6), доведение pH растворов до этой величины производили добавлением HCl и NaOH. В исследованных растворах [AX] = 2 × 10^–4 M, [NaCl] 0, 0.05 и 0.1 М.

Обpазцы замоpаживали в тефлоновыx контейнерах быстрым погpужением в жидкий азот (77 К) и оcвобождали непоcpедcтвенно пеpед оcвещением. Облучение пpоизводили pтутной лампой cвеpxвыcокого давления ДPШ-1000 cо cветофильтpами УФC-5 (стандартное значение 40%-го пpопуcкания в диапазоне 260–400 нм) и ФС-6 (стандартное значение 40%-го пpопуcкания в диапазоне 290–470 нм). Интенcивноcть оcвещения I_hν ограничивалась до ~0.6 от максимальной интенсивности источника облучения пpи помощи pешеток, калибpованныx на cпектpофотометpе, аналогично [3–5]. Это было связано с тем, что эффективность фотопродукции H₂O₂ (α), определяемая как отношение количества образующегося пероксида [H₂O₂] к Int_S, существенно снижается при увеличении I_hν [3, 4].

Образцы облучали при 77 К в кварцевом дьюаре. Время облучения составляло 16 мин. Спектры ЭПР регистрировали при 77 К на ЭПP-cпектpометpе Bruker EMX-8 и, в ряде случаев, – на изготовленном в лаборатории ЭПР-спектрометре (частота 9.5 ГГц), использовавшемся в работах [1–7]. Мощность СВЧ-излучения составляла W = 200 мкВт, амплитуда модуляции – 2 Гс. Результаты, полученные на различных приборах, приведены с учетом пересчета на соответствующие параллельные измерения в идентичных образцах, приводившиеся в наших предыдущих работах. Регистрация спектров ЭПР на спектрометре Bruker EMX-8, обладающем более высокой чувствительностью, чем лабораторный ЭПР-спектрометр, позволила приблизительно оценить соотношение интегральных интенсивностей довольно слабых сигналов фотосенсибилизируемых атомов ${{{\text{H}}}^{ \bullet }}$ (дублет c pаcщеплением ~507 Гc, обычно не накладывающийcя на cигналы S) и сигналов S. Соответствующие измерения выполняли при W = 10 мкВт и пересчитывали с учетом соответствующих коэффициентов (табл. 1).

Методика оценки вклада различных компонент в сигналы S, выполнявшаяся на основании построения модельного сигнала, идентична описанной в [7] и применявшейся во всех цитированных выше работах. Основными составляющими (“базисными сигналами”), вносящими вклад в регистрируемые спектры облученных растворов AX, являются сигналы пероксильных радикалов – ${\text{O}}_{2}^{{ - {\kern 1pt} \bullet }}$ и ${\text{HO}}_{2}^{ \bullet }$, электрондефицитных радикалов аденина ${{{\text{A}}}^{ \bullet }}$; радикалов рибозы ${\text{R}}{{{\text{i}}}^{ \bullet }}$ в Ado и ADP, (локализованных преимущественно на C5'); C8OH-аддуктов аденина – ${\text{AO}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}$; сигналы ${\text{Cl}}_{2}^{{ - {\kern 1pt} \bullet }}$; (наблюдаемые в присутствии NaCl в замораживаемых растворах), сигналы стабилизированных в матрице электронов e^– и радикалов ${\text{NO}}_{2}^{ \bullet }$ (пpиcутcтвие которых в cпектpаx обуcловлено, по-видимому, вероятными пpимеcями нитpатов в компонентаx pаcтвоpов). В присутствии в растворах добавок P_i попытка внесения в базисную систему сигналов фосфатных радикалов и радикалов ${\text{O}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}$, вносящих существенный вклад в анализируемые спектры при более высоких концентрациях реагентов [8], при используемых концентрациях оказалась безуспешной.

После записи спектров ЭПР облученные образцы хранили в течение суток в жидком азоте (77 K) вплоть до определения H₂O₂. Определение Н₂О₂ проводили спектрально-иодометрическим методом [9], аналогично выполнявшемуся в цитированных выше работах [1–6]. С этой целью образцы после фотолиза размораживали при комнатной температуре, для чего каждый образец помещали в отдельную пробирку объемом 5 мл. После таяния образцов к ним добавляли 1 мл Н₂SO₄ (0.2 М), вытесняли растворенный кислород продувом углекислым газом, после чего смешивали с 2 мл деаэрированного 5%-го водного раствора иодида калия и вновь продували СО₂. Выделение иода, образующего с избытком иодид-аниона комплексный анион ${\text{I}}_{3}^{ - }$, регистрировали методом спектрофотометрии (λ_max = 351 нм, ε = = 26 400 М^–1 см^–1). Точность определения концентрации пероксида водорода <1 мкМ. Параллельно с облученными образцами в каждом из опытов выполняли определение H₂O₂ в контрольных, не облучавшихся образцах, хранившихся то же время при 77 К. Пероксид водорода в этих образцах практически отсутствовал ([H₂O₂] < < 1 мкМ).

Среднеквадратичная ошибка определения H₂O₂ в облученных образцах составляет ~24%; среднеквадратичная ошибка определения Int_S составляет ~33%. Количество параллельных образцов в различных опытах варьировало от 3 до 7.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты определения количества H₂O₂ в размороженных образцах AX, облученных при 77 К с светофильтрами УФС-5 и ФС-6, приведены в табл. 1, 2. Там же представлены результаты определения интегральных интенсивностей сигналов ЭПР в этих образцах перед размораживанием (Int_S). Во всех исследованных системах выход H₂O₂ увеличивается при добавлении 5 × 10^–4 M P_i в соответствующие растворы как в случае облучения со светофильтром УФС-5, так и при ограничении полосы возбуждения до λ_min ~ 290 нм (светофильтр ФС-6). В присутствии 0.05 M NaCl максимальное увеличение выхода H₂O₂ при внесении в растворы 5 × 10^–4 M P_i наблюдалось в растворах Ado и составляло 3.1–2.8 раза при облучении образцов с указанными светофильтрами, соответственно.

10-кратное увеличение [P_i] приводит лишь к относительно слабому возрастанию выхода H₂O₂. (При этом максимальное увеличение выхода H₂O₂ в 3.1–2.1 раза наблюдалось в растворах ADP + 0.05 M NaCl при облучении со светофильтрами УФС-5 и ФС-6, соответственно, что согласуется с высокой оценкой константы ассоциации ADP с P_i [6].)

Необходимо отметить существенное расхождение между результатами влияния P_i при его низком содержании (5 × 10^–4 M) на фоне 0.1 М NaCl на выход H₂O₂ при облучении образцов A со светофильтром УФС-5, полученными в [6] и в данной работе. Оценка выхода H₂O₂ в [6] превышает приводимое в этой работе значение в ~7 раз. Наблюдаемые в обеих работах величины Int_S сигналов ЭПР близки. В связи с этим в данных условиях было произведено два независимых эксперимента, средние значения выхода H₂O₂ в которых оказались достаточно близки (47 и 38 мкМ), так же, как и оценки Int_S сигналов ЭПР. Таким образом, результат определения выхода H₂O₂ в растворах A, приведенный в [6], по-видимому, ошибочен (в табл. 1 выделен курсивом). Следует заметить, что приготовление образцов в [6] и в данной работе осуществлялось различными операторами. Представляется вероятным, что результаты экспериментов могут существенно зависеть от процесса приготовления растворов для замораживания – времени нахождения смешанного раствора в жидком состоянии и интенсивности перемешивания как исходного раствора, так и в ходе доведения pH до требуемой величины (pH 6.6). Принципиальная возможность влияния способа приготовления растворов на результаты опытов отмечена в [10].

Наблюдавшееся в [6] снижение Int_S сигналов ЭПР в облученных со светофильтром УФС-5 растворах AX при добавлении 5 × 10^–4 M P_i на фоне 0.1 М NaCl, сопровождающееся увеличением выхода H₂O₂ в растворах при их размораживании, подтверждено в данной работе для 0.05 М NaCl (высокие Int_S). Это, по нашему мнению, может свидетельствовать об определяющей роли пути II в рассматриваемых системах [6]. Однако, данный эффект не всегда заметен при небольших величинах Int_S. Нам представляется, что описанные выше результаты могут объясняться совокупностью четырех факторов.

1. Влияние процесса замораживания растворов. Известно, что замораживание водных растворов ароматических органических молекул приводит к их агрегации [11, 12]. Очевидно, что степень агрегации молекул AX в замораживаемых растворах должна существенно зависеть от их исходного состояния – состава раствора (содержания относительно “нейтральных” составляющих, в данных экспериментах – присутствия солей NaCl, P_i) и степени возможной самоассоциации основных (фоточувствительных) компонентов. Показано, что в присутствии неорганических солей происходит дезагрегация этих соединений ([11, 12] и ссылки в этих работах). Принципиальное влияние процесса замораживания водных растворов тимина на выход свободных радикалов в случае γ- облучения при 77 K продемонстрировано в [13].

2. Самоассоциация AX. Абсолютные значения констант самоассоциации AX ($K_{{{\text{sa}}}}^{{{\text{AX}}}}$) в жидких водных растворах, получаемые различными методами и, следовательно, в различных диапазонах [AX], могут различаться на порядки [14]. Тем не менее, их последовательность для рассматриваемых нами соединений, в достаточной степени согласуется, по крайней мере, в случае образования димерных ассоциатов ($K_{{{\text{sa2}}}}^{{{\text{AX}}}}$). Эта последовательность, по литературным данным, по-видимому, такова: $K_{{{\text{sa}}}}^{{{\text{Ado}}}}$ > $K_{{{\text{sa}}}}^{{{\text{ADP}}}}$ [15] и $K_{{{\text{sa2}}}}^{{{\text{Ado}}}}$ > $K_{{{\text{sa2}}}}^{{\text{A}}}$ [16]. (Дополнительные ссылки на литературные данные приведены в [3].)

Последовательность изменения фотопродукции H₂O₂ в растворах AX при одинаковых условиях облучения (в отсутствие P_i) в целом совпадает с последовательностью изменения констант самоассоциации AX. Для [AX] = 2 × 10^–4 M в присутствии 0.1 М NaCl выход H₂O₂ снижается в ряду Ado > ADP > A: 0.7–1.3/0.3/0.2 при облучении со светофильтром УФС-5 и 0.4–0.8/0.3/0.2 при облучении с ФС-6 (Результаты нормированы на среднее значение выхода H₂O₂ в растворах Ado + + 0.1 М NaCl, облученных со светофильтром УФС-5, полученное по измерениям в [4–6] и в данной работе (147 мкМ).) При этой же нормировке в отсутствие NaCl выход H₂O₂ в растворах Ado/ADP/A составляет: 0.4/0.3/0.1 и 0.1–0.6/0.4/ 0.1–0.2 при облучении образцов со светофильтрами УФС-5 и ФС-6, соответственно.

3. Дезагрегирующее действие солей. Дезагрегирующее действие ряда солей в замораживаемых водных растворах AX продемонстрировано в [11, 12] и ссылках в этих работах. Показано, что в качестве дезагрегирующих агентов соли P_i менее эффективны, чем NaCl [11]. Из AX наиболее “стойким” по отношению к дезагрегирующим агентам показан нуклеотид (AMP).

4. Комплексообразование AX с P_i. В условиях проведенных в данной работе экспериментов (pH 6.6) в растворах присутствуют преимущественно две ионных формы P_i – H₂PO$_{4}^{ - }$ и HPO$_{4}^{{2 - }}$ (pK₁ ~ 2.1, pK₂ ~ 7.2 [17]) в соотношении ~ 4 : 1. Результаты расчета соотношения различных ионных форм P_i в зависимости от кислотности раствора приведены в [18].

При pH 6.6 в водных растворах преимущественно содержатся только нейтральные формы A и Ado (${\text{p}}K_{1}^{{{\text{A}}{\text{.Ado}}}}$ ~ 4.2–3.5 и ${\text{p}}K_{2}^{{{\text{A}}{\text{.Ado}}}}$ ~ 9.8–12.5, соответственно [19]). В случае ADP значение ${\text{p}}K_{2}^{{{\text{ADP}}}}$ (депротонирование гетероцикла) лежит в тех же пределах, что и ${\text{p}}K_{1}^{{{\text{A}}{\text{.Ado}}}}$; величина ${\text{p}}K_{1}^{{{\text{ADP}}}}$ (первичное депротонирование фосфатного фрагмента) лежит в более кислой области. При pH 6.6 в водном растворе преимущественно содержатся формы ADP^2– и ADP^3– (${\text{p}}K_{3}^{{{\text{ADP}}}}$ = 7.2, депротонированные по фосфатным группам [17, 20]). (Дальнейшее депротонирование ADP происходит по рибозной группе (${\text{p}}K_{4}^{{{\text{ADP}}}}$ > 12.5), что согласуется с ${\text{p}}K_{2}^{{{\text{Ado}}}}$ ~ 12.5 [19, 20]).

Возможное комплексование AX с P_i показано в [6] для A и ADP. Однако, этот эффект наблюдался в 0.05 М цитратном буфере (pH 5.6). В отсутствие достаточного количества противоионов (в отсутствие буфера либо NaCl) в растворах ADP, даже при доведении pH растворов ADP + P_i  до использовавшейся в предыдущих работах величины (pH 6.6) количества ионов Na⁺, по-видимому, не вполне достаточно для предотвращения отталкивания отрицательно заряженных фосфатных групп ADP и P_i при [P_i] = 5 × 10^–4 M. На фоне 0.05 М NaCl увеличение выхода H₂O₂ при [P_i] = = 5 × 10^–4 M в ряду A : Ado : ADP составляет 2.6–2.2 : 3.1–2.8 : 1.3–1.4 (светофильтры УФС-5–ФС-6). Десятикратное увеличение [P_i] приводит в этих же условиях к заметному изменению этого соотношения: 0.9–0.7 : 1.3–1.5 : 3.1–2.1 (табл. 1, 2).

Влияние полосы облучения неоднозначно и, по-видимому, зависит как от AX, так и от соотношения [NaCl] и [P_i] (табл. 1, 2). Показано, что в жидких водных растворах в условиях преимущественного стэкинг-взаимодействия AX наблюдаются гипохромный эффект в области λ ≈ 260 нм и некоторое возрастание оптического поглощения при λ > 290 нм [21, 22] (Большее количество ссылок приведено в [4].) Хотя приводимые в цитируемых работах результаты получены на аналогах динуклеотидов [18] и олигомере дезоксиаденозина (dA)₂₀ [22], они, по-видимому, вполне применимы к нашим системам, особенно в случае возможного преимущественного образования димерных ассоциатов [16, 23]. Константы самоассоциации ароматических органических молекул заметно возрастают при снижении температуры растворов. В [24] для растворов пурина показано увеличение K_sa в ~2.7 раза при снижении температуры раствора от 26 до 5°С. Нами наблюдалось в [25] увеличение оптического поглощения в области λ ~ 300–325 нм в водном растворе ADP при его охлаждении до ~4^○С.

В отсутствие P_i в случае Ado на фоне 0.1 М NaCl падение выхода H₂O₂ при облучении образцов со светофильтром ФС-6 по сравнению с результатами облучения со светофильтром УФС-5 практически совпадает с данными [4] (~40% от выхода при облучении с УФС-5). Падение выхода H₂O₂ при облучении со светофильтрами ФС-6/УФС-5 в присутствии P_i несколько меньше и соизмеримо при [P_i] = 5 × 10^–4 и 5 × 10^–3 M (12–24% от выхода при облучении с УФС-5) вплоть до использования максимальных [NaCl] и [P_i] (табл. 1, 2).

В случае ADP как в отсутствие P_i, так и при низкой концентрации P_i наблюдается превышение выхода H₂O₂ при облучении со светофильтром ФС-6 по сравнению с результатами облучения со светофильтром УФС-5. Это качественно совпадает с результатами [4]. Однако при [P_i] = = 5 × 10^–3 M в присутствии NaCl наблюдается, наоборот, значительное падение выхода H₂O₂ при облучении со светофильтром ФС-6 по сравнению с результатами облучения со светофильтром УФС-5 (табл. 1, 2), достигающее 39% при максимальной величине [NaCl]. Таким образом, в этом случае, по-видимому, могут играть существенную роль вторичные взаимодействия между фотоинициируемыми интермедиатами.

Результаты оценки относительного содержания различных компонент сигналов S в растворах Ado и ADP (одинаковые компоненты, используемые при моделировании спектров ЭПР) приведены в табл. 3, 4. Во всех доступных для сравнения в данной работе случаях отношение содержания компонент ${{{\text{A}}}^{ \bullet }}$ к ${\text{R}}{{{\text{i}}}^{ \bullet }}$ при облучении образцов со светофильтром УФС-5 оказывается существенно ниже в растворах ADP, чем в соответствующих растворах Ado. Этот эффект, по-видимому, отсутствует в растворах, облученных со светофильтром ФС-6.

В растворах ADP (но не Ado) в ряде случаев наблюдается увеличение выхода H₂O₂ при облучении со светофильтром ФС-6 по сравнению с результатами облучения образцов со светофильтром УФС-5 (табл. 3, 4, системы II, IV, V, VI, VII). Хотя причины наблюдаемого различия не выяснялись, можно предполагать определяющую роль в нем фотоиндуцируемого поглощения первичных интермедиатов наблюдаемых фотопроцессов.

Оценки коэффициентов экстинкции свободных радикалов, фиксируемых методом ЭПР при 77 K и их возможных предшественников (по литературным данным), приведены в [4]. В присутствии NaCl наибольшими коэффициентами экстинкции (ε) в области 280 ≥ λ ≤ 300 нм обладают свободные радикалы ${\text{C}}{{{\text{l}}}^{ \bullet }}$ и ${\text{Cl}}_{2}^{{ - {\kern 1pt} \bullet }}$, фиксируемые при 77 K методом ЭПР в наших работах (ε ~ 3000 и ~1200 М^–1 см^–1, соответственно, при λ = 280 нм). Оптическое поглощение радикалов ${\text{Cl}}_{2}^{{ - {\kern 1pt} \bullet }}$ увеличивается при λ > 300 нм, поглощение ${\text{C}}{{{\text{l}}}^{ \bullet }}$ падает. Следует отметить также возможность поглощения света в области λ ∼ 280 нм в замороженных водных растворах первоначально образующимися свободными радикалами ${\text{O}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}$, не связанными или слабо связанными водородными связями с молекулами воды [26].

Оптическое поглощение других свободных радикалов, обусловленных образованием ${\text{C}}{{{\text{l}}}^{ \bullet }}$ и ${\text{Cl}}_{2}^{{ - {\kern 1pt} \bullet }}$, и возможных интермедиатных радикалов ${\text{ClO}}{{{\text{H}}}^{{ - {\kern 1pt} \bullet }}}$ [27] увеличивается при λ > 310 нм (ссылки в [4]). Максимальное поглощение этих радикалов наблюдается в области λ ~ 350 нм, включающей интенсивную линию излучения ртутной лампы при λ ~ 366 нм и пропускаемой обоими использовавшимися светофильтрами. В доступных для сравнения случаях при облучении со светофильтром УФС-5 относительное содержание радикалов ${\text{Cl}}_{2}^{{ - {\kern 1pt} \bullet }}$ в растворах ADP несколько выше, чем в растворах Ado, за исключением системы с максимальным содержанием P_i и NaCl (табл. 3).

Ряд реакций, провоцируемых образованием радикалов ${\text{C}}{{{\text{l}}}^{ \bullet }}$ в водных растворах при комнатных температурах (по литературным данным), а также, вероятно, при отжиге облученных при 77 K образцов (использованном в [1]), приведен в цитируемой работе. В частности, распад возможных интермедиатных радикалов ${\text{ClO}}{{{\text{H}}}^{{ - {\kern 1pt} \bullet }}}$ может приводить к образованию радикалов ${\text{O}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}$ и тем самым влиять на выход H₂O₂. Неизвестно, однако, в какой мере приведенные в [1] реакции, тем более под действием дополнительного облучения, могут осуществляться при 77 K.

Столь же направленные различия в выходах H₂O₂ в растворах Ado и ADP при облучении со светофильтрами УФС-5 и ФС-6, по-видимому, существуют и в растворах, не содержащих NaCl (системы IV, VII). Можно предположить, что эти различия связаны с отмеченным выше возможным оптическим поглощением свободных радикалов ${\text{O}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}$, не связанных или слабо связанных с молекулами H₂O, в области λ ~ 280 нм [26].

Следует отметить, что образование H₂O₂, как под действием видимого света, так и под действием инфракрасного облучения в полосах поглощения растворенного в воде O₂ наблюдалось в отсутствие фотосенсибилизаторов в воде при комнатной температуре [28]. Использовавшиеся в наших работах светофильтры (УФС-5, ФС-6) пропускают свет с λ > 700 нм, что не позволяет полностью исключать из рассмотрения возможность предполагаемых в этой работе процессов, обусловленных образованием ¹O₂. Однако, выход H₂O₂ в отсутствие фотосенсибилизаторов в этой работе при лазерном облучении с λ ≈ 633 нм и даже с λ ≈ ≈ 1260 нм не превышает 20 нМ, что вообще значительно ниже чувствительности использовавшегося нами метода определения [H₂O₂].

Приведенные результаты, полученные в отсутствие в замораживаемых растворах P_i либо при низкой концентрации P_i, подтверждают ранее сделанный вывод о существенности пути II в рассматриваемых процессах. Введение небольших количеств P_i (до 5 × 10^–5 M в случае Ado [6]), таким образом, существенно влияет на состояние растворов AX перед замораживанием, и микроструктура водных растворов, по-видимому, – основной фактор, влияющий на фотопродукцию H₂O₂ в наших системах.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Хотя основным механимом ассоциации AX предполагается стэкинг-взаимодействие мономеров [14–16, 21, 22], отмечается существенность физико-химических факторов среды (pH, состав растворов, присутствие ионов металлов, диапазоны исследуемых концентраций AX и добавок) [15, 23]. Перечисленные факторы влияют на конформацию мономеров, связывание их (в том числе, посредством водородных связей) с соседними молекулами, включая, безусловно, и молекулы растворителя. В случае полимеров эта конфигурация “оказывает решающее влияние на конформацию, которую принимает макромолекула при заданных физических условиях и которая, в свою очередь, связана с надмолекулярной структурой” [29].

Известно существование в водных растворах кластеров (наноассоциатов [30]). Ссылки на существование различных типов кластерных структур (от димерных до октамерных и более высоких порядков) приведены в [31, 32]. В замороженных водных растворах доминируют гексамерные кластеры в различных конформациях.

Размеры наноассоциатов воды в жидких водных растворах варьируются от 1–10 нм до 200 [33] и даже тысяч нм [30] в зависимости от состава растворов. Их структура существенно зависит от растворенных веществ, в том числе – NaCl [30, 33]. Возможное влияние биомолекул на структуру водных кластеров отмечалось ранее (например, в [34]). В образовании водных кластеров определяющую роль, по-видимому, играет способность молекул воды образовывать водородные связи с соседними молекулами [33]. Протоны, участвующие в образовании водородных связей, расположены между двумя атомами O (собственной и соседней молекул H₂O). Водородная связь между атомами H и O носит отчасти ковалентный характер (10%, [35]). Состояние, когда протон оказывается приближенным к соседнему атому кислорода, типично для границ раздела (вода–газ, вода–твердое тело) [32]. Представляется вероятным, что поверхность ассоциатов AX также можно рассматривать как некую поверхность раздела.

В [36] (и ссылках в этой работе) продемонстрировано, что поверхность льда может быть как источником, так и стоком ориентационных дефектов Бьеррума [37]. Кроме того, она способна аккумулировать возможные ионные дефекты структуры льда – как гидрониум-, так и гидроксид-ионы [36]. В [38] сделано заключение, что, несмотря на расхождение экспериментальных результатов с теоретическими оценками, при pH > 3 суммарный заряд поверхности воды на границе с воздухом отрицателен. Предполагается, что структура поверхностного слоя воды / льда оказывает существенное влияние на протекание в них химических реакций вследствие зависимости от нее энергетических характеристик идентичных молекул, находящихся в этом слое [36].

Необходимо заметить, что все указанные в [36] особенности поверхностного слоя льда проявляются при температурах в диапазоне ~ 110–150 K. Однако, как при приготовлении исследовавшихся образцов, так и при их размораживании после облучения, данный температурный интервал неизбежно проходится.

Особенность поверхностного слоя воды и ассоциатов AX, по-видимому, может играть важную роль в фотопродукции H₂O₂ в замороженных водных растворах. Расстояние между стэкинг-ассоциированными молекулами AX (~3.4 Å [20]) позволяет, в принципе, внедрение в них одномолекулярного слоя H₂O (размер молекулы H₂O ~ 3 Å), а также – молекул O₂ (размер ~3 Å [39]). В присутствии NaCl это допускает возможность внедрения в ассоциаты ионов Na⁺ (размер ионного радиуса ~1 Å) однако не позволяет внедрения ионов Cl^– (размер ионного радиуса ~1.8 Å) [40]. В то же время в [36] показано, что ионы Na⁺ имеют тенденцию к проникновению внутрь замораживаемого раствора, тогда как ионы Cl^–, напротив, склонны оставаться на границе. Таким образом, в присутствии NaCl возможность зарядового различия между пограничным слоем AX и внешней водной средой достаточно неопределенна.

В [41] приведены результаты анализа изменения редокс-потенциала жидкой воды под действием УФ-облучения, влияния растворенных в воде газов и влияния длительного времени хранения образцов после облучения. Показано, что пpиcутcтвие pаcтвоpенныx газов в воде и cильно pазбавленныx водныx cpедаx может cущеcтвенно влиять на cвойcтва растворов, а cтpуктуpная и динамичеcкая упоpядоченноcть cиcтемы pаcтет cо вpеменем, прошедшим после облучения жидких образцов.

Первоначальный продукт реакций, образующийся под действием УФ-облучения – атомы ${{{\text{H}}}^{ \bullet }}$ [41], наблюдался методом ЭПР при 77 K в присутствии P_i (0.5 М, pH 4.5) [42]. Значительно большая интенсивность сигналов ${{{\text{H}}}^{ \bullet }}$ показана в присутствии фотоиндуцируемого донора электрона (e^–) триптофана (Trp), λ > 240 нм и возможных “промежуточных” акцепторов e^–, включая ионы фосфата [43, 44]. При pH 5.0, [Trp] = 5 × 10^–4 M, и [KNO₃] (конечный акцептор e^–) = 0.01 M показана практически линейная зависимость увеличения выхода ${{{\text{H}}}^{ \bullet }}$ и продукта восстановления конечного акцептора – радикалов ${\text{NO}}_{2}^{ \bullet }$ от [P_i] [42]. Конcтанта cкоpоcти взаимодейcтвия e^– с ионами ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в жидких водных растворах составляет k > 9 × × 10⁹ М^–1 c^–1 [45]. Взаимодействие e^– с ионами ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ приводит к разнообразным процессам, однако, преимущественно не приводящим к образованию ${{{\text{H}}}^{ \bullet }}$ [46].

Таким образом, вероятно, что увеличение выхода ${{{\text{H}}}^{ \bullet }}$ в рассматриваемой системе обусловлено, в основном, взаимодействием фотоиндуцируемого электрона с ионами P_i:

Для взаимодейcтвия e^– с ионами PO$_{4}^{ - }$ k = 2.8 × × 10⁶ М^–1 c^–1 [47]. Ориентируясь на возможное состояние реагентов в жидких водных растворах, можно предполагать, что при [P_i] = 0.5 M скорость взаимодействия e^– с ионами ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ превышает скорость его взаимодействия с ионами Н₂РО$_{4}^{ - }$ (реакция (1)) в ~64 раза.

Среднее расстояние между фотоактивируемым донором e^– (Trp) и молекулами акцептора Н₂РО$_{4}^{ - }$ при его концентрациях 0.05–0.5 М составляет от ~16 до 7.5 Å, что значительно меньше возможных средних расстояний между фотоиндуцируемым донором e^– AX и этим акцептором в наших работах. При [P_i] = 5 × 10^–4 M среднее расстояние между молекулами AX и молекулами P_i составляет ~75 Å. В данной работе при такой концентрации P_i показано увеличение фотопродукции H₂O₂ в 2.7 раза в растворах A и в 4.7 раза в растворах Ado по сравнению с растворами, не содержавшими добавок P_i (при облучении со светофильтром УФС-5, табл. 1).

В присутствии более слабого конкурирующего реагента, взаимодействующего с фотоиндуцируемым e^– (0.1 M NaCl; k < 10⁶ М^–1 c^–1 [48]) увеличение выхода H₂O₂ при включении в растворы P_i снижается. В этой работе при добавлении в растворы 5 × 10^–4 M P_i наблюдаемое увеличение выхода H₂O₂ составляет для A – в 1.4 раза, для Ado – в 2.6 раза. В [6] для Ado показано увеличение выхода H₂O₂ на фоне 0.1 M NaCl в присутствии 5 × 10^–5 M P_i (в 2.3 раза). В этом случае среднее расстояние между молекулами Ado и P_i может составлять уже ~160 Å.

Таким образом, существуют основания для предположения о том, что наблюдаемое нами увеличение выхода H₂O₂ при внесении в замораживаемые растворы AX неорганического фосфата в умеренных концентрациях ([P_i] = 5 × 10^–4 M и ниже) связано в значительной степени с изменением структуры замораживаемых водных растворов. Изменение кластерной структуры водных растворов в присутствии P_i и, вероятно, возможное изменение состояния поверхностного слоя как на границах растворителя с агрегатами AX, так и, возможно, с “внутриагрегатными” слоями растворителя, предположенное в [6], по-видимому, могут играть значительную роль в увеличении фотопродукции H₂O₂ в наших системах в присутствии различных добавок.

Ранее отмечалось, что в ряде случаев выход пероксида водорода в рассматривавшихся системах может заметно превосходить растворимость O₂ в водных и водно-солевых системах [6] и ссылки в этой работе. Это может, в частности, объясняться адсорбцией O₂ на поверхности образцов в процессе их приготовления к облучению. Однако, оценка количества спинов в спектрах ЭПР образцов Ado + 0.05 M NaCl + 5 × 10^–3 M P_i (система VIII), облученных со светофильтром УФС-5, дает содержание в них ~2.8 × 10¹⁴ спинов. Это означает, что определяемое количество молекул H₂O₂ в тех же образцах превышает количество свободных радикалов в них, регистрируемое перед их размораживанием в ~300 раз. Таким образом, возникает вопрос о возможном участии H₂O в наблюдаемых процессах.

Возможные свободнорадикальные механизмы, предполагавшиеся нами для фотоиндуцируемого увеличения выхода H₂O₂ в присутствии различных добавок, приведены в цитируемых работах. В частности, в условиях, когда основным путем образования H₂O₂ может быть путь II, предполагаются реакции:

и Реакция (2) представляется более вероятной, чем реакция (3) [5, 6], поскольку следовые количества атомов ${{{\text{H}}}^{ \bullet }}$ обнаруживаются в спектрах ЭПР (рис. 1, табл. 1, 2). Возможные способы фотоиндуцируемого образования радикалов ${\text{HO}}_{2}^{ \bullet }$ рассмотрены в [1, 2, 5–7].

Не исключено, что определенную роль в образовании H₂O₂ в рассматриваемых системах могут играть процессы, связанные с переносом энергии. Обращает на себя внимание близость оптических характеристик AX и воды (полос возбуждения флуоресценции и спектров флуоресценции).

При облучении водных растворов AX при 77 K светом с λ ~ 260 нм наблюдается флуоресценция с λ_max ≈ 348–362 нм, отнесенная на счет эксимеров AX [11], что в целом соответствует результатам, полученным в жидких растворах (dA)₂₀ (λ_max ≈ ≈ 362 нм) [21]. Положение максимума коротковолновой флуоресценции воды, возбуждаемой светом в области λ ~ 260 нм, варьирует в пределах 345–360 нм [49, 50].

При облучении растворов (dA)₂₀ в UVA-диапазоне (возбуждение при λ ~ 330 нм) максимум флуоресценции наблюдается при 420 нм [21]. Максимум длинноволновой флуоресценции воды, возбуждаемой светом с λ ~ 310 нм, расположен при 410–425 нм [49, 50]. Вследствие большой ширины полос регистрируемые спектры флуоресценции (dA)₂₀ и воды хорошо перекрываются (ширина их на полувысоте максимума составляет ~100 нм [21, 50]).

В [50] показано, что интенсивность эмиссионных спектров воды существенно зависит от присутствия в ней O₂. Предположено, что наблюдаемые отличия в эмиссионных спектрах, регистрируемых в присутствии O₂, обусловлены образованием нанопузырьков газа и адсорбцией содержащихся в следовых количествах примесей на водно-пузырьковых границах растворов.

В [51] продемонстрировано существенное влияние микрогетерогенности среды, обусловленной, в частности, образованием микропузырьков растворенного O₂ на наблюдаемые спектры флуоресценции. При этом наблюдалось отсутствие однозначного соответствия между степенью очистки воды и параметрами ее флуоресценции; причем как интенсивность длинноволновой флуоресценции воды, так и положение ее максимума существенно зависело от условий приготовления растворов. Таким образом, несмотря на принципиальную возможность процессов переноса энергии в рассматриваемых системах, предсказать их направленность без проведения специальных исследований не представляется возможным.

Системы, содержащие микро/нанопузырьки O₂, безусловно, можно отнести к разряду “организованных сред” [52, 53]. “Организованные среды – это прозрачные, оптически однородные растворы, в которых в основной массе растворителя присутствуют наноразмерные системы, образующие собственную нанофазу”. Эти среды во многом подобны мицеллярным растворам, они гомогенны и однофазны в макромасштабе, но микрогетерогенны и двухфазны на наноуровне [52]. Соответствующие микровключения могут считаться микро / нанореакторами [53] (и ссылки в цитируемых работах).

Приведенные в данной работе исследования выполнены с использованием ЭПP-cпектpометpа Bruker EMX-8 ЦКП “Новые материалы и технологии” ИБХФ РАН.