Генетика, 2022, T. 58, № 1, стр. 76-85

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Были исследованы пациенты с расстройствами, отличающимися выраженными симптомами депрессии (N = 357). Выборка пациентов была разделена на три группы в соответствии с диагнозом по МКБ-10: 1) F 32.1, депрессивный эпизод (N = 106, 58.5% женщин, 41.5% мужчин; средний возраст 31.8 ± 8.5 лет); 2) F 33.1, рекуррентная депрессия (N = 149, 67.8% женщин, 32.2% мужчин; средний возраст 34.2 ± 7.3 лет); 3) F 42.1, смешанное тревожное и депрессивное расстройство (N = 97, 50.5% женщин, 49.5% мужчин; средний возраст 33.9 ± 7.2 лет). Обследование пациентов и получение образцов крови проводились в Научно-практическом психоневрологическом центре департамента здравоохранения г. Москвы. Симптомы заболевания проявились у пациентов в возрасте 18–45 лет. В выборку были включены пациенты, соответствующие следующим критериям: восточнославянское происхождение, отсутствие в анамнезе шизофрении, алкоголизма, злоупотребления наркотиками, онкологических заболеваний и неврологических расстройств (деменция, болезнь Паркинсона, инсульт, эпилепсия и др.). У всех пациентов была проведена оценка тяжести симптомов депрессии (опросник Гамильтона), ситуационной и личностной тревоги (опросник Спилбергера). В контрольную группу было включено 163 человека из восточнославянской популяции Москвы и регионов Центральной России (62% женщин, 38% мужчин; средний возраст 61.9 ± 9.3 лет). Подробные данные о пациентах и контрольной группе и результаты генотипирования представлены в Приложении (табл. П.1).

Геномная ДНК была выделена из 250 мкл антикоагулированной венозной крови с использованием набора innuPREP Blood DNA Mini (Analytik Jena AG, Германия), в соответствии с рекомендациями производителя. Генотипирование проводилось с использованием локус-специфичной ПЦР и рестрикции специфичными эндонуклеазами рестрикции по методикам, описанным ранее [23–25].

Соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди–Вайнберга было рассчитано с помощью онлайн-калькулятора (https://wpcalc.com/ en/equilibrium-hardy-weinberg/). Оценка ассоциации между генотипом и наличием заболевания проводилась методом логистической регрессии.

Были протестированы следующие модели наследования:

1. Кодоминантная. Эта модель предполагает, что каждый генотип ассоциирован с риском заболевания независимо от других.

2. Доминантная. Гомозиготы по распространенному аллелю тестируются против гомо- и гетерозигот по редкому аллелю.

3. Рецессивная. Гомозиготы по редкому аллелю тестируются против гомо- и гетерозигот по распространенному аллелю.

4. Сверхдоминантная. Гетерозиготы противопоставляются всем гомозиготам.

5. Аддитивная. Эта модель предполагает, что наличие двух ассоциированных с заболеванием аллелей увеличивает риск заболевания в 2 раза больше, чем наличие одного такого аллеля. Тест был проведен с использованием логистической регрессионной модели, а генотипы были закодированы как 0, 1 и 2 в зависимости от количества минорного аллеля.

Логистическая регрессия проводилась отдельно для каждой модели наследования. Для анализа ассоциации генотипа с такими количественными переменными, как тяжесть симптомов тревоги и депрессии, использовался метод отрицательной биномиальной регрессии. Значимость ассоциаций между генотипами и зависимыми переменными оценивалась с помощью теста отношения правдоподобий (likelihood-ratio test, LRT). Подбор наиболее подходящего варианта модели логистической регрессии для каждой модели наследования, как и подбор модели отрицательной биномиальной регрессии для количественных переменных, осуществлялся с помощью информационного критерия Акаике (Akaike information criterion, AIC). Локусы исключались из модели по одному, в порядке от наибольшего значения p-value к наименьшему, затем все варианты моделей сравнивались с помощью AIC и финальной считалась та модель, для которой коэффициент AIC минимален. Таким образом, из каждой статистической модели удалялись все локусы, исключение которых повышало ее качество. В табл. 1–4 приведены все локусы, которые остались в финальных вариантах статистических моделей. Анализ методами логистической и отрицательной биномиальной регрессии проводился с помощью инструментов R‑статистики (программа RStudio).

Кроме того, ассоциация между генотипами по изученным локусам и риском расстройства с депрессивной симптоматикой оценивалась с использованием отношений шансов (ОШ) с 95%-ным доверительными интервалами (ДИ) с помощью онлайн-калькулятора (https://www.medcalc.org/calc/ odds_ratio.php). Результаты считались статистически значимыми при р < 0.05.

Аллели с полиморфизмом вариабельного числа тандемных повторов (VNTR) были классифицированы в соответствии с данными об их транскрипционной активности. Аллели локуса SLC6A3 40 пн VNTR были разделены на короткий аллель S (<10 повторов) и длинный аллель L (≥10 повторов), соответственно было изучено распределение генотипов LL, LS и SS. Аллели DRD4 48 пн VNTR также были классифицированы как длинные L (≥7 повторов) и короткие S (<7 повторов). При исследовании полиморфизма гена SLC6A4 учитывались два локуса, 5-HTTLPR и rs25531. Аллели были разделены на low (низкий уровень экспрессии, аллели S и L_G) и high (высокий уровень экспрессии, аллель L_A). Аллели локуса SLC6A4 16–17 пн VNTR были классифицированы как high (12 повторов) и low (9, 10 повторов) в соответствии с уровнем экспрессии.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Нами были изучены следующие гены дофаминергической, серотонинергической и эндокринной систем: SLC6A3/DAT1 (локус 40 пн VNTR), DRD2 (локус rs1800497), DRD4 (локусы 120 пн VNTR и 48 пн VNTR), COMT (локус rs4680), SLC6A4/5HTT (локусы 5-HTTLPR + rs25531 и Stin2), HTR1A (локус rs6295), HTR2A (локус rs6311), HTR1B (локус rs6296), OXTR (локус rs53576). Распределение аллелей и генотипов всех изученных локусов в наших выборках соответствует равновесию Харди–Вайнберга.

Депрессивный эпизод ассоциирован с полиморфными вариантами генов SLC6A3/DAT1 и HTR2A (табл. 1). Остальные локусы были исключены при подборе моделей логистической регрессии. Ассоциация локуса 40 пн VNTR гена SLC6A3 с ДЭ оказалась значимой в кодоминантной (p = 0.024), доминантной (p = 0.015), сверхдоминантной (p = = 0.035) и рецессивной (p = 0.011) моделях. Генотипы SS и LS встречаются значительно чаще у пациентов с ДЭ, а для носителей генотипа LL риск развития заболевания оказался ниже, чем для носителей других генотипов (ОШ = 0.57, 0.35–0.95, p = 0.032). Локус rs6311 гена HTR2A статистически значимо ассоциирован с ДЭ только в кодоминантной модели (p = 0.022). Генотип AA более распространен в контрольной группе, и было показано, что он может играть защитную роль (ОШ = 0.33, 0.14–0.79, p = 0.013).

Генетическими факторами риска для рекуррентной депрессии являются полиморфные варианты генов SLC6A3 (40 пн VNTR), DRD4 (120 пн VNTR) и OXTR (rs53576) (табл. 2). Ассоциация между РД и локусом VNTR 40 пн гена SLC6A3 значима в доминантной (p = 0.01) и аддитивной (p = 0.015) моделях. Носители генотипа LL имеют низкий риск развития заболевания (ОШ = 0.59, 0.37–0.94, p = 0.025). Для локуса 120 пн VNTR гена DRD4 была показана ассоциация с РД в кодоминантной (p = 0.015) и рецессивной (p = 0.004) моделях. Гомозиготный по минорному аллелю генотип SS отсутствует в выборке пациентов с РД, в контрольной группе частота генотипа SS составила 3.7%. Локус rs53576 гена OXTR статистически значимо ассоциирован с риском РД по результатам тестирования кодоминантной, рецессивной и аддитивной моделей (p < 0.001). Несмотря на то что генотип AA встречается с достаточно высокой частотой в контрольной группе (17.2%), только один пациент с РД является носителем этого генотипа, и поэтому он сильно коррелирует с низким риском заболевания (ОШ = 0.03, 0.004–0.24, p = 0.0008). При подборе модели логистической регрессии для тестирования кодоминантой и рецессивной моделей наследования локус rs6295 гена HTR1A был оставлен в финальной версии, однако корреляция между распределением генотипов этого локуса и РД не была статистически значимой (табл. 2).

Наиболее сильная ассоциация со смешанным тревожным и депрессивным расстройством была показана для локуса 40 пн VNTR гена SLC6A3, результат оставался статистически значимым при тестировании любых моделей наследования (табл. 3). Генотип SS ассоциирован с высоким риском развития заболевания (ОШ = 3.93, 1.18–13.13, p = 0.026), а LL-генотип играет защитную роль (ОШ = 0.48, 0.29–0.8, p = 0.005). Полиморфный вариант rs6311 в гене HTR2A ассоциирован с СТДР при тестировании рецессивной (p = 0.019), а локус 120 пн VNTR гена DRD4 – доминантной (p = 0.04) моделей наследования.

Чтобы проверить связаны ли изученные локусы с тяжестью течения заболевания, мы объединили всех пациентов в одну выборку и проанализировали ассоциации между генотипами и тяжестью симптомов депрессии и тревоги (табл. 4). Локусы rs6295 гена HTR1A и 120 пн VNTR гена DRD4 ассоциированы с ситуационной (p = 0.009 и 0.045) и личностной (p = 0.019 и 0.038) тревогой (рис. 1 и 2). С тяжестью симптомов ситуационной тревоги также ассоциированы локусы rs53576 гена OXTR (p = 0.046) и Stin2 гена SLC6A4 (p = 0.01) (рис. 3). Не было обнаружено ассоциаций между изученными генами и тяжестью симптомов депрессии.

Рис. 1.

Ассоциация локуса rs6295 гена HTR1A с симптомами личностной и ситуационной тревоги. Для рис. 1–3: по шкале Y отложены баллы, полученные в результате тестирования пациентов на тяжесть симптомов тревоги. На шкале Х отмечены генотипы по изученным локусам.

Рис. 2.

Ассоциация локуса 120 пн VNTR гена DRD4 с симптомами личностной и ситуационной тревоги.

Рис. 3.

Ассоциация локусов rs53576 гена OXTR и Stin2 гена SLC6A4 с симптомами ситуационной тревоги.

ОБСУЖДЕНИЕ

Наше исследование было направлено на поиск генетических факторов риска, общих для разных расстройств с депрессивной симптоматикой и специфичных для определенного заболевания. Мы объединили пациентов в выборки, максимально однородные по диагнозу и этническому происхождению. В настоящем исследовании показано, что полиморфный локус 40 пн VNTR гена SLC6A3 ассоциирован со всеми изученными заболеваниями. Ранее была показана ассоциация между аллелем 9R и тяжестью симптомов депрессии [14]. В наших выборках генотип SS, представляющий собой любые сочетания аллелей 6R, 8R и 9R, ассоциирован с высоким риском депрессивных заболеваний, но не с тяжестью симптомов депрессии и тревоги. Частота генотипа LL (аллели 10R и 11R) выше в контрольной группе, чем у пациентов. Результат тестирования доминантной модели наследования, противопоставляющей генотип LL остальным, значим во всех выборках. Анализ ОШ подтверждает, что носители генотипа LL имеют сниженный риск развития всех изученных расстройств. Кроме того, для всех заболеваний значим результат тестирования аддитивной модели наследования, что указывает на более высокий риск заболевания у носителей генотипа SS по сравнению с носителями только одного аллеля S. Аллельный вариант 10R ассоциирован с более высокой активностью транскрипции по сравнению с аллелем 9R [1], поэтому наши результаты позволяют предположить, что низкая активность экспрессии гена дофаминового транспортера ассоциирована с риском развития всех изученных расстройств депрессивного спектра. В выборках с РД и СТДР статистически значимые отличия наблюдались в распределении генотипов локуса 120 пн VNTR гена DRD4. В опубликованном ранее исследовании, проведенном на выборке пациентов с общим диагнозом “большое депрессивное расстройство”, была обнаружена ассоциация генотипа LL с заболеванием [15]. В настоящем исследовании у пациентов с РД генотип LL, отличающийся более высокой транскрипционной активностью [4], также встречается чаще, чем в контрольной группе, и ни один пациент не является носителем генотипа SS. Самые значимые результаты получены при тестировании рецессивной модели наследования, противопоставляющей редкий генотип SS остальным генотипам. Кроме того, анализ ОШ позволяет предположить, что у носителей генотипа SS, ассоциированного с низким уровнем экспрессии, ниже риск развития РД. В группе СТДР ассоциация значима только при тестировании доминантной модели наследования, при этом самый распространенный генотип LL встречается у пациентов реже, чем в контрольной группе, и не ассоциирован с повышенным риском заболевания. С ДЭ в нашей выборке данный локус не ассоциирован. Кроме того, нами было показано, что этот полиморфный локус коррелирует с тяжестью симптомов ситуационной тревоги. Ввиду низкой встречаемости аллеля S эти результаты требуют проверки на больших выборках.

Полиморфный локус rs6311 гена HTR2A в изученных выборках ассоциирован с ДЭ и СТДР, но не с РД. Ранее было показано, что аллель A ассоциирован с повышенным уровнем экспрессии [13]. В обеих наших выборках генотип AA встречается реже, чем в контрольной группе, и, возможно, играет защитную роль. Вклад гена HTR2A в риск развития депрессивных расстройств был изучен ранее и, несмотря на результаты отдельных работ, метаанализ не выявил значимых ассоциаций [16]. Возможно, дальнейшие исследования, проведенные на однородных по диагнозу выборках большего размера, позволят уточнить эти результаты. Мы также показали возможную ассоциацию локуса rs6295 гена HTR1A с РД. Ранее были получены результаты, подтверждающие ассоциацию депрессивных и тревожных расстройств с аллелем G локуса rs6295 гена HTR1A [17, 18]. В нашем исследовании у пациентов чаще встречается генотип CG, но не GG, и ассоциация этого локуса с РД не является статистически значимой. Однако этот полиморфный локус оказался ассоциирован с тяжестью симптомов как ситуационной, так и личностной тревоги. Специфический генетический фактор риска был выявлен для РД. В предыдущем исследовании генотип GG локуса rs53576 гена OXTR был ассоциирован с униполярной депрессией [21], к которой относится в том числе рекуррентная депрессия, изученная нами отдельно. В наших выборках распределение генотипов локуса rs53576 гена OXTR не отличается у пациентов с ДЭ и СТДР по сравнению с контрольной группой. Отличия оказались значимыми только у пациентов с РД. Тестирование рецессивной модели наследования, в которой редкий генотип AA противопоставлен остальным, и анализ ОШ подтверждают, что риск РД для носителей генотипа AA статистически значимо ниже, чем для носителей других генотипов. Кроме того, этот локус ассоциирован с тяжестью симптомов ситуационной тревоги. Распределение генотипов локуса Stin2 гена SLC6A4 не ассоциированно в наших выборках с риском изученных заболеваний, но значимо коррелирует с тяжестью симптомов ситуационной тревоги. Исследование трехаллельного комбинированного локуса (5-HTTLPR + rs25531) гена серотонинового транспортера SLC6A4 с использованием классификации генотипов согласно их транскрипционной активности не подтвердило предположения об ассоциации уровня экспрессии этого гена с риском депрессивных расстройств.

Нами были показаны как общие для всех или некоторых из изученных заболеваний ассоциации, так и специфический генетический фактор риска для РД. Кроме того, были выявлены локусы, которые, возможно, не ассоциированы с риском заболевания у здоровых людей, но коррелируют с тяжестью симптомов у пациентов, уже страдающих от депрессивного или тревожного расстройства. Таким образом, разделение пациентов на группы с одинаковыми диагнозами может быть полезно для понимания того, с каким именно заболеванием ассоциирован тот или иной локус.

Данное исследование имеет ряд ограничений. Оно проведено на небольшой выборке, поэтому некоторые редкие генотипы отсутствуют или мало представлены в отдельных группах пациентов. Кроме того, в данной работе проводится анализ ассоциации между риском развития депрессивных расстройств и генотипами без учета каких-либо других факторов. Средний возраст пациентов при этом оказался ниже среднего возраста контрольной группы, однако в данной работе этот критерий не влияет на результат. Дальнейшие исследования, проведенные на гомогенных по диагнозу и этническому происхождению выборках, но при этом с большим числом пациентов и с учетом большего числа факторов, требуются для проверки полученных результатов.

Работа была выполнена на базе Центра коллективного пользования Института биологии гена Российской академии наук при поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) № 19-04-00383, 17-29-02203-ofi-m, 19-015-00380.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.