Генетика, 2022, T. 58, № 12, стр. 1367-1385

ТЕОРИИ СТАРЕНИЯ

На продолжительность жизни и старение организмов оказывают влияние множество различных факторов. Для человека вклад генетических факторов оценивается до 30% [3]. Однако эта оценка не учитывает индивидуальности ответа индивида на факторы внешней среды, а также его социального поведения и личностных характеристик, которые в некоторой степени также определяются генетическими детерминантами. Например, было показано, что братья и сестры долгожителей, преодолевших 105-летний барьер, имеют в 35 раз больше шансов дожить до 100 лет, чем в среднем по популяции [4]. Роль генетических факторов в продолжительности жизни также хорошо иллюстрируют таксоны-экстремумы по этому показателю. Для океанического моллюска Arctica islandica характерно исключительное долголетие (507 лет в дикой природе) [5] и наоборот продолжительность жизни у насекомых подёнок (Ephemeroptera) – не более 48 ч [6]. Но почему одни живые организмы живут десятилетиями, а другие считанные дни? В попытке ответить на этот вопрос сформулировано множество гипотез [7].

Молекулярно-генетическая гипотеза, согласно которой причиной старения являются изменения генетического аппарата клетки, – одна из наиболее признанных в современной науке о старении. В свете этого современные молекулярно-генетические теории предполагают два подхода к изучению проблемы старения. Один подход рассматривает возрастные изменения генома как наследственно запрограммированные, другой предполагает, что старение – это результат накопления случайных мутаций. Отсюда следует, что процесс старения может являться или закономерным результатом роста и развития организма (гипотеза запрограммированного старения), или следствием накопления случайных ошибок в системе хранения и передачи генетической информации (стохастическая гипотеза или “теория накопления мутаций”). Так, гипотеза запрограммированного старения предполагает, что с возрастом происходит преднамеренное ухудшение показателей организма, поскольку ограничение продолжительности жизни приводит к эволюционным преимуществам таксона, устраняя из конкуренции за пищевые и пространственные ресурсы особей, выполнивших свою репродуктивную функцию. Антагонистическая плейотропия на сегодняшний день является наиболее общепринятой теорией эволюционного происхождения старения [8].

Теория антагонистической плейотропии предполагает, что существует эволюционно закрепленный генетически детерминированный баланс между продолжительностью жизни и фертильностью. Поддержание баланса между уровнями рождаемости и смертности необходимо для предотвращения истощения пищевых ресурсов. Антагонистическая плейотропия рассматривается как эволюционная адаптация, которая защищает долгосрочные преимущества популяции/вида от потерь в результате индивидуального отбора. Долгосрочная выгода достается только группе за счет индивидуума, что привело к отбору группы генов, которые обеспечивают преимущества при воспроизводстве потомства в молодом возрасте и ускоряют процессы, ведущие к гибели организма [9]. К примеру, у млекопитающих активность сигнальных систем mTOR и инсулин/IGF1 крайне важна на начальных этапах развития организма, но в дальнейшем приводит к ускоренному старению [10].

Эволюционная теория старения П. Медавара (“теория накопления мутаций”) объясняет старение как случайное неадаптивное явление, которое выступает побочным продуктом естественного эволюционного отбора [11].

Ее смысл заключается в том, что варианты генов, которые обусловливают негативный эффект на продолжительность жизни, не влияют на здоровье индивида в репродуктивном возрасте, т.е. манифестируются только в пожилом возрасте и не подвергаются отрицательному отбору. Современные молекулярно-генетические исследования подтверждают постулаты эволюционной теории, например ген р53, который одновременно является и супрессором опухолевого роста, и геном клеточного старения [12].

В настоящее время становится понятно, что в классическом виде эти теории не могут быть абсолютны. В ряде исследований показано, что старение может развиваться как механизм адаптации к изменяющимся условиям среды для обеспечения преимущества части популяции на различных модельных организмах [13–16]. Более того, даже в одной бактериальной линии могут одновременно проявляться как физиологическое бессмертие, так и клеточное старение [17]. Таким образом, природа старения вероятно намного сложнее чем ранее предполагалось, в связи с чем требует еще более тщательного изучения.

ОСНОВНЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СТАРЕНИЯ

К настоящему времени было идентифицировано множество процессов, приводящих к старению на клеточном уровне в тех или иных модельных системах. Среди основных механизмов выделяют: нестабильность генома, укорочение теломер, эпигенетические изменения, нарушение протеостаза, нарушение распознавания питательных веществ, митохондриальная дисфункция, накопление сенесцентных клеток, истощение пула стволовых клеток и изменение межклеточного взаимодействия [18–20]. Подробно данные о механизмах клеточного старения представлены в табл. 1 (Приложение 1 ).

С момента выявления и определения клеточных механизмов старения они чаще всего описывались как изолированные или отдельные. Однако появляется все больше экспериментальных данных, демонстрирующих взаимосвязь и взаимную регуляцию между большинством из этих признаков. Традиционно ключевые механизмы старения были разделены на три взаимодействующие между собой группы признаков. Первая группа – это признаки, которые, как считается, являются основными причинами повреждения клеток (к ним относятся – нестабильность генома, укорочение теломер, эпигенетические изменения, нарушение протеостаза). Вторая группа признаков – те, которые считают частью компенсаторных или антагонистических ответов на повреждение (нарушение распознавания питательных веществ, митохондриальная дисфункция, накопление сенесцентных клеток). Первоначально эти механизмы направлены на уменьшение повреждения, однако при хроническом или интенсивном воздействии приводят к повреждениям. И интегративные признаки – истощение пула стволовых клеток и изменение межклеточного взаимодействия, являющиеся финальным результатом признаков предыдущих двух групп и, в конечном итоге, ответственные за снижение функций, связанных со старением [21]. Современное представление о ключевых механизмах старения на молекулярном, клеточном, тканевом и системном уровнях подробно представлены в обзоре [20].

Однако пути старения значительно различаются среди клеток разных видов и, более того, среди различных клеток одного и того же вида. Например, фибробласты мыши экспрессируют теломеразу и имеют очень длинные теломеры, и в клеточной культуре они стареют независимо от укорочения теломер [22], а фибробласты человека “стареют” после некоторого числа клеточных делений и экспрессия теломеразы может отсрочить этот процесс [23]. В то же время “старение” клеточной культуры ткани молочной железы человека не зависит от укорочения теломер и связано с экспрессией белка p16 [18].

Оценка роли конкретных факторов, модулирующих процессы старения у человека, на которые можно будет эффективно терапевтически воздействовать для продления здорового долголетия, является одной из основных задач биологии старения, имеющей в перспективе прикладное значение. Незаменимым инструментом, позволяющим проводить исследования механизмов старения и влияющих на них факторов, являются классические модельные организмы в комбинации с организмами экстремальными по продолжительности жизни.

МОДЕЛЬНЫЕ ЖИВОТНЫЕ

Для выявления генетических факторов и метаболических путей, лежащих в основе старения и долголетия, в качестве биологических моделей используется множество различных организмов. К преимуществам использования модельных животных можно отнести: короткую продолжительность жизни, возможности проводить широкий набор манипуляций на геномном уровне, а также небольшие финансовые затраты и невысокие этические требования. Исследования на таких далеких от человека модельных организмах, как дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), нематодный червь (Caenorhabditis elegans), плодовая мушка (Drosophila melanogaster) и грызуны (мыши Mus musculus и крысы Rattus norvegicus), позволили определить консервативные генетические механизмы старения. Применение различных генетических подходов (например, индуцированный мутагенез, РНК-интерференция и др.) позволило сфокусировать исследования на определенных генах и эффективно искать ассоциации фенотип/генотип у полученных мутантов.

Список модельных организмов, которые используются для изучения генетики долголетия, за последние годы пополнился животными, которые отличаются аномальной продолжительностью жизни. Среди них бирюзовый киллифиш (Nothobranchius furzeri) – самое короткоживущее животное, которое можно содержать в неволе, а его старение демонстрирует многие характеристики старения млекопитающих. В природе N. furzeri живут не более 1–1.5 лет, в аквариумах при правильном содержании могут доживать до трех лет, но в возрасте полутора лет становятся бесплодными. Короткая продолжительность жизни N. furzeri дает уникальную возможность для проведения лонгитюдных исследований позвоночных [24]. Напротив, такие виды как ночница Брандта (Myotis brandtii), гренландский кит (Balaena mysticetus) и африканский саванный слон (Loxodonta africana) являются видами с экстремальным увеличением продолжительности жизни, что может быть связано с уникальными вариациями генов репарации ДНК и генов системы поддержания стабильности генома.

Кроме того, активно обсуждается использование домашних пород собак (Canisiliaris) в качестве перспективной животной модели в генетических исследованиях старения, особенно учитывая, что у них естественным образом развивается когнитивное снижение, связанное с возрастом, с поведенческими и гистологическими характеристиками, очень похожими на человеческие [25].

Обширные генетические данные, полученные в исследованиях на различных модельных организмах, представлены в нескольких обзорных статьях [26–30]. В табл. 2 (Приложение 2 ) представлены последние данные по поиску генов и метаболических путей, влияющих на продолжительность жизни модельных организмов. Ограничение калорийности питания наряду со снижением активности сигнальных путей TOR, IIS и с увеличением активности сигнального пути AMPK, по-видимому, эволюционно консервативны в регуляции продолжительности жизни за счет ингибирования анаболических процессов и перепрограммирования метаболизма организмов различных видов. Инсулин/IGF-1-сигнальный путь стал первым, чья роль в регуляции продолжительности жизни была достоверно подтверждена для большинства модельных организмов. Также известно, что многие гены поддержания стабильности генома, в особенности гены репарации ДНК и противоопухолевой защиты широко представлены для разных видов организмов, что свидетельствует об эволюционном консерватизме генетических путей в процессах старения и долголетия. Однако также существуют виды, выработавшие индивидуальные механизмы продления жизни, например такие как увеличение копийности генов или уникальные мутации [27].

ПОИСК ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ДОЛГОЛЕТИЕ У ЧЕЛОВЕКА

Всемирная организация здравоохранения провозгласила концепцию “здорового старения” глобальным приоритетом для современного общества [31]. Эта концепция обсуждается в научных кругах начиная с середины ХХ в. и включает такие понятия как высокая физическая, психологическая и социальная активность здоровых людей пожилого возраста (>60 лет) [32]. В свете этого долгожителей можно рассматривать как “золотой стандарт” здорового старения. Было высказано предположение, что геном долгожителей не содержит патологических вариантов генов со значительной пенетрантностью, либо содержит протективные аллели от различных факторов риска окружающей среды. Поэтому долгожители могут служить естественной моделью для изучения биологических аспектов успешного старения человека [33]. Ранее термин “долгожители” относили к людям старше 90 лет, но в последнее время в большинстве исследований этим термином обозначаются люди, дожившие до 100 и более лет. Доля таких людей в развитых странах в среднем составляет ~0.01–0.025% [34]. В России численность людей старше 100 лет в 2021 г. составляла 30420 человек [35]. К “супердолгожителям” относят людей, достигших возраста 110 лет и старше. Такое исключительное долголетие встречается редко и, возможно, использует биологические механизмы, которые отличаются от тех, которые участвуют в обычном старении человека [36]. Произвольное использование возрастного порога для обозначения фенотипа “долгожительство” является значимой проблемой при исследовании генетики долголетия человека [37].

К особенностям фенотипа долгожителей относят следующие признаки:

1) половой дисбаланс (гендерные различия) – распространенность долгожительства среди женщин выше во всем мире, при этом соотношение мужчин и женщин обычно колеблется от 1 : 4 до 1 : 7, а среди сверхдолгожителей в возрасте от 110 лет соотношение мужчин и женщин составляет 1 : 9 [37];

2) семейные случаи долголетия – показано, что родители, братья и сестры и потомки долгожителей демонстрируют лучшее состояние здоровья и более высокую вероятность достижения долголетия по сравнению с контрольной группой того же возраста [4, 38 ];

3) клинический статус долгожителей весьма неоднородный. Так, например, процент долгожителей с хорошим физическим/когнитивным статусом колеблется в разных популяциях от 12 до 22% [39, 40].

Учитывая все это, для формирования исследовательских когорт (выборок) при проведении генетических исследований важна предварительная гериатрическая оценка клинического статуса долгожителей, что снижает излишнюю гетерогенность выборки [41]. Для этих же целей также важно проводить проверку этнической однородности выборки и долгожителей, и контрольной группы например методом анализа главных компонент.

Использование не популяционных когорт, а семейных случаев успешного старения представляет особый интерес. К таким исследованиям относят изучение близнецов-долгожителей [4, 42, 43] и изучение семейных случаев долголетия, таких, например, как международные исследования Long Life Family Study (LLFS) [44]. Использование редких крупных когорт семей долгожителей помогает улучшить структуру генетических исследований. К ним относятся коллекции “Лейденское исследование долголетия – Leiden Longevity Study”, “Генетика здорового старения – GEHA)/Mark-Age”, состоящие из долгожителей возраста 85 лет и выше, их сибсов и потомков среднего возраста европейского происхождения [45, 46]. Преимущества таких исследований в том, что потомки долгожителей, представленные как отдельная группа индивидов, предрасположенных к долголетию, могут сравниваться с их пожилыми супругами (выступающими в качестве контроля) для определения возрастных фенотипов, ассоциированных с семейным долголетием. Такая структура исследуемых выборок позволяет провести на нескольких поколениях достоверный анализ молекулярных и клинических параметров, характерных для долгожителей и членов их семей пожилого, среднего и молодого возраста.

Появление Британского биобанка (UK Biobank) [47] – ресурса, содержащего широкий спектр генетической и медицинской информации о примерно 500 тыс. человек, упростило исследования взаимосвязи между генетикой и процессом старения, и/или продолжительностью жизни, благодаря унифицированной классификации фенотипов, что необходимо для получения корректных результатов с использованием метаанализа. Подробное описание классификации фенотипов в Британском биобанке представлено в работе [48].

В настоящее время продолжаются исследования по поиску и анализу генетических вариантов, связанных со старением и долголетием. Технологии масштабного параллельного секвенирования (МПС) дают полную информацию о спектре однонуколеотидных замен и малых делеций/инсерций в геномах долгожителей, обеспечивая возможность детального анализа и/или комплексных подходов к изучению генетики долгожительства.

Исследования влияния генетических вариаций на общую продолжительность жизни и, в частности, здоровое долголетие человека начались главным образом с локусов и генов-кандидатов, обнаруженных в модельных организмах [49]. Использование метода широкогеномного поиска ассоциаций (GWAS) предполагало возможность выявления новых генетических детерминант, связанных с долголетием у человека. GWAS исследования не основываются на предварительных знаниях о каком-либо выделенном гене или локусе, а представляют собой сравнение частоты встречаемости генетических вариантов в разных группах [50]. Целый ряд таких исследований выявил совокупность полиморфных вариантов, связанных с более длительной продолжительностью жизни в различных популяциях, но большинство из них не воспроизводились в независимых исследованиях [51–55]. На сегодняшний день только для четырех локусов было подтверждено влияние на продолжительность жизни в разных популяциях: APOE (APOE/TOMM40) [55–58], FOXO3А [50, 59–61], CDKN2B-AS1 [62, 63], локус 5q33.3 [59].

В сравнительных GWAS-исследованиях долгожителей (>90 лет и старше) с контрольной группой (младше 65 лет) наиболее достоверные ассоциации с долголетием были показаны для вариантов гена APOE $\varepsilon 4$/$\varepsilon 3$/$\varepsilon 2$: вариант $\varepsilon 4$ реже встречается у долгожителей, тогда как вариант $\varepsilon 2$ присутствует чаще. Аполипопротеин Е – продукт гена APOE участвует в транспортировке холестерина и других липидов в клетки; в головном мозге эта функция важна для поддержания и восстановления мембран нервных клеток и синапсов [63]. Полиморфизм гена APOE имеет высокую степень ассоциации с болезнью Альцгеймера (БА): установлено, что аллель $\varepsilon 4$ является достоверным генетическим фактором риска позднего начала болезни [63–66]. Также показано, что аллель $\varepsilon 4$ сопряжен с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний [67]. Помимо этого в ряде исследований указывается вероятная роль гена APOE в процессах развития ожирения, снижения иммунитета, а также, возможно, диабета второго типа, однако эти данные еще требуют подтверждения [68]. Кроме того, некоторые исследования показали, что носители $\varepsilon 4$ и $\varepsilon 3$ вариантов гена APOE  в среднем обладают более высокой фертильностью по сравнению с $\varepsilon 2$-носителями. Таким образом можно предположить, что в аллельном состоянии гена APOE $\varepsilon 4$/$\varepsilon 3$/$\varepsilon 2$ заложен выбор между здоровым долголетием человека и потенциальным большим количеством потомства [68]. Также было показано, что SNP (rs2075650) находится в состоянии сильного неравновесии по сцеплению (LD) с аллелем $\varepsilon 4$ гена APOE и связан с риском поздней манифестации БА [69]. Интересно, что этот вариант находится в интроне гена TOMM40, который расположен примерно на 15 тпн выше APOE на хромосоме 19. Последующий анализ GWAS подтвердил связь аллелей $\varepsilon 4$ и $\varepsilon 3$ гена APOE с полиморфным вариантом гена TOMM40, поэтому в связи с долголетием рассматривают локус APOE/TOMM40 [62].

Ген CDKN2B-AS1 представляет собой длинную некодирующую РНК (lncRNA), которая регулирует экспрессию гена циклин-зависимого ингибитора киназы 2A (CDKN2A). Оба этих гена находятся в локусе CDKN2A/B. Полиморфные варианты в этом локусе связаны с сердечно-сосудистыми и онкологическими заболеваниями [67, 70, 71].

Ген FOXO3A кодирует фактор транскрипции, влияющий на целый ряд процессов клеточного метаболизма, окислительно-восстановительного потенциала клеток, пролиферации клеток, репарации ДНК, аутофагии и многих других [72–75]. В частности, он действует как триггер апоптоза посредством экспрессии генов, необходимых для гибели клеток, запускает апоптоз в отсутствие факторов выживания, включая гибель нейронов при окислительном стрессе [76, 77]. B. Willcox и соавт. (2008) [60] впервые сообщили, что генетическая изменчивость гена FOXO3A четко коррелирует с продолжительностью жизни человека. Было проведено исследование пяти генов-кандидатов (ADIPOQ, FOXO1A, FOXO3A, SIRT1 и COQ7) в популяции американских долгожителей мужского пола японского происхождения (средний достигнутый возраст = 97.9 по сравнению с контрольной группой = 78.5). Для трех полиморфных вариантов (rs2764264, rs13217795 и rs2802292) в гене FOXO3A была установлена связь с долголетием и здоровым старением. Было показано, что гомозиготный генотип по аллелю G варианта rs2802292 можно считать протективным при сердечно-сосудистых заболеваниях. Этот же аллель был связан с заметно более низким уровнем инсулина и индексом HOMA (оценка модели гомеостаза) в контрольной группе [60]. C. Anselmi и соавт. (2009) [74] подтвердили связь вышеупомянутых вариантов гена FOXO3А с экстремальной продолжительностью жизни у мужчин долгожителей Южной Италии. Но вариант rs2802288, отстоящий на 2 тпн от rs2802292, показал лучшую аллельную ассоциацию [74]. Эти же результаты были подтверждены в немецкой популяции, но ассоциация была значительно выше у долгожителей, чем у пожилых людей [61]. Кроме того, ассоциация вариантов в гене FOXO3A была воспроизведена как методом “случай–контроль”, так и “продольными” исследованиями в датской популяции (лица старшего возраста по сравнению с лицами среднего возраста). Среди 15 проанализированных SNP гена FOXO3A авторы обнаружили связь восьми SNP с продолжительностью жизни: четыре ранее зарегистрированных (rs13217795, rs2764264, rs479744 и rs9400239) и четыре новых SNP (rs12206094, rs13220810, rs7762395 и rs9486902) [75]. В работе F. Flachsbart и соавт. [61] для трех вариантов (rs2802292, rs12206094 и rs4946935) было показано участие в аллель-специфичном ответе на клеточный стресс и индукцию аллель-специфичной экспрессии FOXO3А.

Тем не менее следует отметить, что вышеописанные выявленные варианты в генах-кандидатах APOE/TOMM40, CDKN2B-AS1 и FOXO3А в совокупности объясняют лишь небольшую долю наследуемости долголетия. Следовательно, необходимы новые подходы для выявления дополнительных локусов, участвующих в формировании долголетия у человека.

Примером исследований на больших хорошо структурированных когортах могут служить работы с использованием ресурса Британского биобанка. Несколько GWAS-исследований использовали данные биобанка для поиска генотипов, связанных с наследуемой продолжительностью жизни, так как учитывалась и продолжительность жизни родителей, и продолжительность здоровой жизни (определяемая как количество прожитых лет в отсутствие серьезных хронических заболеваний) [76, 78]. В этих исследованиях подтвердились уже известные генетические варианты (в локусах APOE, ABO, ZC3HC1, IGF2R, CDKN2B-AS1, 5q33.3/EBF1 и FOXO3) и обнаружены новые варианты (ATXN2/BRAP, FURIN/FES, ZW10, PSORS1C3 и 13q21.31). Также были отмечены новые метаболические пути, возможно влияющие на продолжительность жизни человека: транспорт везикул, метаболизм ацилглицерина и стеролов, а также синаптическая и дендритная функции. Авторы отмечают, что идентифицированные генетические варианты, по-видимому, не лежат в основе генерализованной формы старения, независимой от болезни. То есть определенные генетические варианты, которые напрямую влияют на скорость старения человека, обнаружить не удалось. Возможно, что эффекты таких генетических вариантов были слишком малы, чтобы их можно было обнаружить в этом исследовании [54, 78].

Также в одном из недавних исследований авторы анализировали данные из Британского биобанка (UKB) и британской коллекции образцов тканей мозга (UK Brain Bank Network/UKBBN) с целью поиска ультраредких генетических вариантов (MAF < 0.2%), влияющих на продолжительность жизни (в выборке свыше 40 тыс. жителей Великобритании в возрасте от 16 до 105 лет) [79]. Был проведен анализ влияния ультраредких генетических факторов – это в основном так называемые варианты с усечением белка (Protein-truncating variants, PTV), а именно stop-gain мутации и мутации со сдвигом рамки считывания, на общую продолжительность жизни и на продолжительность здоровой жизни, т.е. период времени, прожитый до развития первого возрастного заболевания. Авторами было установлено, что мутационный груз наследуемых PTV (>6 PTV на геном) отрицательно влияет на общую продолжительность жизни и продолжительность здоровой жизни (выявлено сокращение ожидаемой продолжительности жизни в среднем на 1.3 года). В то же время влияния соматического накопления PTV на ожидаемую продолжительность жизни отмечено не было. Также в работе Shindyapina и соавт. [80] было выявлено, что редкие PTV-варианты могут быть связаны с развитием различных заболеваний, таких как болезни аутоиммунного спектра, рак легких и др.

Одним из вариантов современного аналитического подхода при изучении геномов долгожителей является расчет полигенного риска/балла (PRS) достижения интересующего фенотипа, в данном случае – долголетия человека. Так, в работе [76] использовали когорту здоровых долгожителей возраста более 100 лет (343) и подобранную по популяциям контрольную группу пожилых людей, состоящую из пяти когорт разного возраста (N = 2905). Было выбрано 330 полиморфных вариантов, на основе которых был проведен расчет PRS. Так как PRS для признака, в его простейшей форме, представляет собой взвешенную сумму генотипов для панели SNP, где “веса” представляют собой предполагаемую величину генетического эффекта, в качестве “весов” авторами были использованы различные размеры эффекта (логарифм отношения шансов [ORs]), доступные в сводной статистике GWAS по наследуемому долголетию (parental longevity) [54]. Авторы считают, что эта “панель маркеров” для расчета PRS частично способна компенсировать “маскирующий эффект” аллеля APOE-$\varepsilon 4$. При аннотации 330 вариантов, включенных в этот PRS, было обнаружено, что они обогащены генами, связанными с клеточной дифференцировкой, процессами развития и клеточной реакцией на стресс.

Недостаток новых достоверных генетических ассоциаций с долголетием частично объясняется отсутствием стандартизации критериев GWAS-исследований для определения групп долгожителей и групп сравнения (контроля), что затрудняет унификацию полученных результатов. Этот “недостаток” в некоторой степени исправляется использованием крупных баз данных “генотип–фенотип”. Но до сих пор генетические исследования старения и долголетия человека не были достаточно успешны в выявлении механизмов, лежащих в основе регулирования продолжительности жизни у человека. Поэтому дополнение данных GWAS-исследований более детальной информацией о последовательности ДНК, полученной с помощью технологии полногеномного секвенирования нового поколения (NGS), и изменение статистических методов анализа представляются следующим шагом вперед на современном этапе изучения долгожительства и процессов старения.

Поиск генетических факторов продолжительности жизни методом GWAS в основном проводился в соответствии с гипотезой, что вероятность долголетия зависит от ряда вариантов, имеющих относительно высокую популяционную частоту. Первые попытки поиска редких вариантов (MAF < 5%), определяющих продолжительность жизни, были предприняты в работах [35, 53] и включали дизайн исследования крайнего случая (фенотипа) [81]. Поиск ультраредких вариантов (MAF < < 0.01%) был предпринят в полноэкзомном исследовании для выборки 1248 человек. В результате были выявлены новые варианты в генах FN3KRP и PGP [82].

Методы ассоциации, используемые в исследованиях GWAS, не позволяют выявить значимые редкие варианты по отдельности или предоставить инструменты для измерения их сложного эффекта, называемого бременем редких вариантов (rare variant burden). Один из способов решить эту проблему – объединить несколько вариантов в одну ковариату на основе регионов, например генов. Для этого используются следующие методы, основанные на обнаружении наличия или подсчете вариантов в гене: комбинированный многомерный и коллапса (Combined Multivariate and Collapsing/CMC), метод адаптивного коллапса на основе ядра (Kernel-Based Adaptive Collapsing/KBAC) и тест ассоциации ядра оптимизированной последовательности (Optimized Sequence Kernel Association Test/SKAT-О). Основная тенденция в работах последних лет по изучению геномов долгожителей – использование комбинаторных биоинформатических анализов и усложнение дизайна эксперимента (например, использование технологии одноклеточного секвенирования или сочетания с данными транскриптомного анализа).

Примером использования одного из таких подходов служит работа S. Shen с коллегами [83], в которой было проанализировано 19 геномов долгожителей от 100 до 116 лет. Корреляционные методы включали ассоциативный анализ, тест ассоциации ядра последовательности (SKAT-анализ) и тесты нагрузки для редких вариантов. Это исследование было проведено для вариантов с MAF > 1%. Вместо контрольной выборки использовали информацию для населения Восточной Азии (208 индивидов) из базы данных “1000G”. SKAT-анализ представляет собой тест на связь между набором редких (или распространенных) вариантов и непрерывными/дихотомическими фенотипами на уровне набора SNP (например, гена или региона). Всего с помощью анализа SKAT в этой работе был выделен 41 ген, которые достоверно коррелировали с долгожительством. Первые 10 генов были: PABPC3, BAGE2, HLA-DRB1, PDE4DIP, PADI4, CHI3L2, MUC17, WARS, HLA-DRB5 и SIRPB1. Анализ распределения этих генов по метаболическим путям (с использованием баз данных MutsigDB, KEGG и Reactome) показал перепредставленность метаболических путей, связанных с иммунными и воспалительными ответами, такими как реакции интерферонов, антител и иммунитета [83].

Удачным примером использования синтетического подхода (использование ряда различных аналитических методов) к анализу данных служит работа P. Garagnani с коллегами [84]. В этом исследовании были секвенированы полные геномы 81 индивида старше 104 лет (средний возраст 106.6 лет) и 36 здоровых неродственных индивидов из тех же регионов Италии (средний возраст 68.0 ± 5.9) с глубоким покрытием (90×). Дополнительно ДНК 333 долгожителей (средний возраст: 100.4 ± 1.4) и 358 неродственных индивидов контрольной группы (средний возраст: 60.7 ± 7.2) использовали для типирования по 542 585 генетическим маркерам с использованием чипа CoreExomeChip v1.1 Illumina (Сан-Диего, Калифорния, США). Наиболее значимым результатом авторы считают идентификацию пяти распространенных вариантов (rs7456688, rs10257700, rs10279856, rs69685881 и rs7805969) в одной и той же области, расположенной между геном COA1 и геном STK17A, и выявление гена STK17A как нового гена-кандидата. Следует отметить, что это часто встречаемые в европейских популяциях аллели (от 30 до 60%).

Один из этих пяти вариантов, rs10279856, может играть регуляторную роль в регионе и, возможно, имеет плейотропный эффект, поскольку он является локусом количественного признака экспрессии (eQTL) для гена STK17A и двух других генов (COA1 и BLVRA). Анализ на основе гаплотипов идентифицировал гаплотип в локусе гена COA1 (chr7: 43720429–43756081), сильно связанный с экстремальной продолжительностью жизни (значение p = 1.84 × 10^–8). Более того, сравнение с литературными данными [85] выявило еще один полиморфизм (rs623108) с потенциальным влиянием на экспрессию гена STK17A, что указывает на разные сигналы от различных полиморфных вариантов, регулирующих экспрессию генов COA1, STK1A, и BLVRA. При этом авторы выделяют особенности паттернов соматических мутаций у долгожителей, связывая их с более низкой мутационной нагрузкой по сравнению с контрольной группой. Суммируя, авторы определяют эффективные механизмы репарации ДНК как важнейшие составляющие здорового старения и защиты от сердечно-сосудистых заболеваний.

К настоящему времени исследования выявили до 750 генов, связанных с долголетием, которые вовлечены в различные виды жизнедеятельности, такие как рост и развитие, энергетический метаболизм, окислительный стресс, поддержание стабильности генома и когнитивных функций. В то же время только семейства генов FOXO показали связь с долголетием в многочисленных независимых исследованиях человека и модельных животных [56, 84, 86].

Белки семейства генов FOXO, которые представляют собой подсемейство транскрипционных факторов, консервативны в организмах от Caenorhabditis elegans до млекопитающих и во всех случаях сохраняют свою функцию регулятора передачи сигналов инсулина и инсулиноподобного фактора роста. В то же время инсулин/IGF-1-сигнальный путь также является наиболее эволюционно консервативным путем, который модулирует продолжительность жизни модельных организмов на большом эволюционном расстоянии от Caenorhabditis elegans до приматов [87–89]. А отличительный признак старения – “нарушение чувствительности к питательным веществам” – был первым, для которого показано влияние этого сигнального пути у животных. Ограничение в питании – это хорошо известный фактор, который, как показано, увеличивает продолжительность жизни разных видов эукариот, от дрожжей до приматов, и клеточный ответ на действие такого фактора регулируется несколькими сигнальными путями: инсулином, киназой TOR, AMP-киназой, сиртуинами [88, 89]. Хочется отметить, что основной препарат с геротерапевтическим эффектом – метформин – воздействует на эти сигнальные пути, обеспечивая защиту против макромолекулярного повреждения, улучшенный ответ аутофагии и уменьшение воспаления [90, 91] (рис. 1).

Рис. 1.

Транскрипционный фактор FOXO как эволюционно консервативный регулятор сохранения равновесия, клеточного гомеостаза и стабильности генома.

Другие гены-кандидаты вовлечены в процессы регуляции клеточного цикла, рост клеток и передачу сигналов, поддержание стабильности генома и пути, связанные с эндокринной системой. Кроме того, к генам-кандидатам, которые связаны с долгожительством, относят гены, связанные с метаболизмом лекарственных препаратов, гены, участвующие в фолдинге, стабилизации и деградации белков, а также гены, связанные со свертыванием и регуляцией кровообращения, и т.д. В большинстве случаев эти гены или их полиморфные сайты были подтверждены в исследованиях для различных популяций, которые обнаружили определенные гены или пути, связанные с долголетием [49, 53, 86].

Несмотря на большое количество полученных данных, нельзя поставить точку в поиске генетических детерминант, определяющих здоровое долголетие. Можно предположить, что в будущих исследованиях при анализе данных необходимо будет учитывать возможное эпистатическое взаимодействие различных полиморфных вариантов. Сложные фенотипы, по определению, зависят от большого количества генетических и экологических факторов и взаимодействия между этими факторами.

ИММУНИТЕТ И ДОЛГОЖИТЕЛЬСТВО

Старение – это многогранный процесс, в котором задействованы многочисленные молекулярные и клеточные механизмы в контексте различных систем органов. Важнейшим компонентом старения является набор функциональных и структурных изменений в иммунной системе, которые могут проявляться как снижение способности бороться с инфекцией, снижение ответа на вакцинацию, повышенный риск метаболических и нейродегенеративных заболеваний, содержащих иммунологический компонент [92–94]. Также было показано, что ухудшение работы иммунной системы с возрастом способствует старению мозга и развитию его патологий [95]. Например, обнаружено, что возрастные изменения микроглии способствуют развитию нейродегенеративных заболеваний [96].

С современной точки зрения врожденный и адаптивный иммунитет не только зависит от старения, но и является важной частью его основных механизмов. К биомаркерам иммунного старения и патологиям, связанным с иммунным старением, относят повышенную активность антимикробных пептидов, высокий уровень С-реактивного белка, активацию сигнальных путей TLR/NF-κB, cGAS/ STING/IFN 1,3, AGEs/RAGE, активацию инфламмасомы NLRP3, снижение уровней NK-клеток (естественные киллеры) при врожденном иммунитете, инволюцию тимуса, а также уменьшение числа наивных Т-клеток [97].

К признакам иммунного старения относят: низкий иммунный ответ из-за ограничения разнообразия Т-клеточного репертуара (TCR); накопление Т-клеток памяти в иммунном репертуаре; хроническое воспаление слабой степени, характерное при старении и называемое “inflamm-aging/возрастное воспаление”, и пока считают, что все эти изменения в основном связаны с возрастной инволюцией тимуса [98].

Инволюция тимуса – одно из критических возрастных изменений иммунной системы. Активность тимуса не прекращается полностью по крайней мере до пятидесяти лет, но генерация новых Т-клеток снижается с возрастом [94, 99]. В молодости тимус обеспечивает около 16% пула наивных Т-клеток, а остальная часть образуется в результате пролиферации [100]. У пожилых людей процент наивных Т-клеток падает ниже единицы, что заставляет иммунную систему полностью полагаться на пролиферацию уже существующих Т-клеток [94]. Таким образом, процессы уменьшения количества наивных Т-клеток и накопления дифференцированных иммунных клеток можно рассматривать как два признака старения Т-клеточной иммунной системы [92, 98].

Одним из признаков иммунного старения является постепенное увеличение циркулирующих популяций миелоидных клеток по сравнению с популяциями лимфоидных клеток [101]. В исследовании P. Helbling и соавт. было обнаружено, что изменения в костном мозге старых мышей приводят к клональному смещению гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в сторону миелоидной линии. Анализ профиля транскриптом микроокружения стромы костного мозга у мышей выявил возрастную прогрессирующую гиперрегуляцию различных провоспалительных генов (включая гены Il6 и Il1b) [102].

Также было обнаружено, что процессы иммунного старения связаны с изменениями в субпопуляциях миелоидных клеток, резидентных для различных тканей. Применение метода секвенирования транскриптомов отдельных клеток (scRNA-seq) выявило большую гетерогенность миелоидных клеток, присутствующих в тканях у пожилых мышей; интересно, что наиболее заметно такая гетерогенность проявлялась в ответ на воспаление [103]. Также у пожилых мышей методом scRNA-seq было обнаружено увеличение доли интерстициальных макрофагов, экспрессирующих гены хемокиновых рецепторов Ccr2 и Cx3cr1, и уменьшение доли альвеолярных макрофагов [104]. В другом исследовании scRNA-seq-анализ продемонстрировал увеличение экспрессии воспалительных генов (включая экспрессию гена цитокина Il1b) в макрофагах, резидентных в печени (также известных как клетки Купфера) у пожилых мышей, что, вероятно, может способствовать развитию воспаления и повреждению печени [103]. Таким образом, показано, что иммунное старение у мышей связано с изменением программ транскрипции тканевых макрофагов в сторону провоспалительных фенотипов, что способствует развитию воспаления в различных тканях. Дальнейшие исследования, вероятно, будут направлены на анализ развития различных клонов макрофагов, резидентных в тканях и органах человека при старении [103, 104].

Уровень экспрессии и разнообразие B-клеточных рецепторов (BCR) также изменяются при старении [92, 105]. Неизвестно, снижается ли выработка В-клеток костным мозгом в пожилом возрасте у людей, но это явление было показано на мышах [106]. Также было показано, что как у мышей, так и у людей доля В-клеток памяти увеличивается с возрастом [107, 108].

В последнее время нашими коллегами [109] была предложена концепция выявления иммуногенетических факторов нейропсихических заболеваний, сопровождающих старение человека, с помощью глубокого анализа иммуногенетических профилей клеток адаптивной иммунной системы. Были получены иммуногенетические профили репертуара Т-клеточных рецепторов больных болезнью Альцгеймера (БА) и обнаружено, что у индивидов с БА происходят изменения ряда физико-химических свойств молекул, участвующих в Т-клеточном иммунном ответе. Полученные предварительные данные указывают на уникальность профилей репертуара Т-клеточных рецепторов у больных Альцгеймером и следовательно на их потенциальное использование в качестве биомаркеров [109]. Кроме того, были обнаружены Т-клетки со специфическими репертуарами в мозге человека; показано, что при старении в мозге происходит достоверное снижение разнообразия профилей репертуара Т-клеточных рецепторов [109].

Недавние исследования с использованием моделей трансгенных мышей показали, что иммунный ответ может иметь негативный эффект на развитие и течение болезни Альцгеймера. Авторами [110] было обнаружено, что регуляция (инактивация) В-клеток может иметь протектирующий эффект при болезни Альцгеймера на модельных мышах и положительно влиять на когнитивные функции у стареющих мышей на данной модели.

Суммируя, можно сказать, что иммунное старение человека представляет собой процесс сложного ремоделирования, при котором клонотипический иммунитет ухудшается, в то время как наследственный, врожденный иммунитет в значительной степени сохраняется [111, 112].

При этом воспаление можно рассматривать и как адаптивный процесс, поскольку оно может вызвать противовоспалительную реакцию, противодействующую возрастной провоспалительной среде. С этой точки зрения здоровые долгожители представляют собой ценную модель для изучения положительных изменений/геномных вариаций, приводящих к “аномально продуктивной” работе иммунной системы. Именно здоровые долгожители демонстрируют сложный и гетерогенный фенотип с улучшенной способностью адаптироваться и эффективным ответом иммунной системы [113].

Появляются интересные экспериментальные данные об особенностях иммунной системы долгожителей. В основном иммунофлуоресцентными и протеомными методами показано, что у долгожителей сохраняются более “молодые” иммунологические параметры и что истощение их иммунной системы менее очевидно, чем у пожилых людей [114–116]. Используя стандартные методы анализа генома здоровых долгожителей, практически невозможно получить корректные данные об особенностях иммунной системы. Прямых экспериментальных данных по анализу сложных, высоко полиморфных геномных локусов (TCR, аллотипы иммуноглобулинов, HLA), определяющих иммунитет у здоровых долгожителей, очень мало. В работе A. Puca [117] было проведено типирование аллотипов иммуноглобулинов по маркерам IgG3 GM 23– и 23+ (замена G на A в Fc цепи γ2) методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) для 95 долгожителей из Южной Италии. И показано, что аллотип GM3 значительнее представлен у долгожителей.

В работе S. Shen с коллегами [83] представлен пример использования данных секвенирования полных геномов для гаплотипирования генов главного комплекса гистосовместимости при помощи программы HLAscan. Авторы обнаружили, что ген DRB1, а именно гаплотипы DRB1 * 13: 02, DRB1 * 14: 01 и DRB1 * 16: 02 имеют четкую корреляцию с продолжительностью жизни, но типирование указано только до второго поля. Конечно же интересно получить данные о “предпочтительности” у долгожителей HLA-гаплотипов на аминокислотном уровне (типирование до 4-го поля). Потому что уровень типирования до второго поля определяет аминокислотные различия между HLA-белками с одним и тем же антигенным пептидом.

K. Hashimoto с коллегами [118], используя комбинацию нескольких методов (секвенирование одноклеточного транскриптома мононуклеарных клеток периферической крови для семи долгожителей, анализ одноклеточного репертуара TCR обогащения CD4+ Т-клеток для двух долгожителей), показали, что у долгожителей есть уникальные характеристики циркулирующих лимфоцитов, которые могут представлять собой важную адаптивную систему для достижения исключительного долголетия за счет поддержания иммунного ответа на инфекции и болезни. Это увеличение уровня экспрессии генов GZMA, GZMB, GZMH, PRF1, NKG7 (TIA-1), GNLY, CD40LG, KLRG1, KLRB1 и ITGAL (CD11A) и уменьшение уровня экспрессии генов CCR7, CD27, CD28 и IL7R. Также авторы считают, что результаты анализа репертуара одноклеточных TCR для двух долгожителей показывают, что изменение клеточного состояния CD4+ T-клеток, по крайней мере частично, объясняется клональной экспансией из-за повторной стимуляции тем же антигеном [118].

В работе О. Британовой c коллегами [119] было проанализировано изменение репертуара TCRβ с возрастом и в частности для 23 индивидов с возрастом от 85 до 103 лет с использованием РНК, выделенной из мононуклеарных клеток периферической крови. Основными особенностями репертуара TCRβ у долгожителей авторы считают сокращение гендерных различий в динамике сокращения разнообразия, которое в среднем возрасте уменьшается быстрее у мужчин, чем у женщин, и уменьшение среднего количества вирусоспецифичных (цитомегаловирус и вирус Эпштейн-Барра) клонотипов у долгожителей. Это может быть результатом либо истощения клонов специфических Т-клеток, либо возрастного отбора, благоприятствующего продолжительности жизни людей с более низким бременем CMV и EBV [120], либо более низкого клонального доминирования в специфических ответах на эти патогены [119].

Как мы уже писали выше, в период пандемии коронавируса COVID-19 появились данные о том, что долгожители столетнего возраста и старше легче переживают заболевание, чем более молодые индивиды. Например, по данным Института Роберта Коха (февраль 2021 г.) среди немецких пациентов, инфицированных SARS-CoV-2 в возрастной группе 80–89 лет, смертность составила 46.7%, тогда как для людей в возрасте 90 лет и старше – только 23.3% [121]. Предполагается, что легкая симптоматика течения инфекции у долгожителей может быть связана с аномальным воспалительным статусом [122–124]. В исследовании, в котором участвовали долгожители из Китая, было обнаружено, что полиморфизм SNP rs2069837 гена IL6 был связан с экстремальным долголетием [55]. Ранее была отмечена связь полиморфных вариантов гена IL6 (например, IL-6174G/G) с повышенным риском заболеваемости и смертностью в пожилом возрасте [125].

В настоящее время обсуждаются также и другие возможные причины, по которым долгожители легче переносят COVID-19:

– возможное влияние уникальных паттернов экспрессии редких вариантов генов, ассоциированных со здоровым долгожительством [126], что могло бы объяснить хорошую способность иммунной системы долгожителей защищаться от SARS-CoV-2;

– возможный вклад эпигенетических изменений, влияющих на иммунный ответ и предположительно определяющих селективное преимущество для долгожителей. На особенности их эпигенетического статуса могли оказать влияние такие внешние факторы как две мировые войны, голод и пандемии гриппа [127, 128].

Пока исследователи находятся только в начале “большого пути” и мы видим только старт подобных работ, которые конечно же будут продолжаться. Хотелось бы особо отметить, что многие текущие иммуногенетические исследования с участием долгожителей повторяют основные методологические ошибки, которые встречались в стартовых работах по анализу полных геномов долгожителей, среди них – анализ малой выборки, использование гетерогенной по возрасту группы (от 85 лет), игнорирование этнической гетерогенности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поиск ключевых генов старения и долголетия, и изучение внутриклеточных сигнальных путей может стать основой для разработки методов диагностики и коррекции состояний, сопровождающих процесс старения, разработки терапевтических способов, повышающих продолжительность и качество жизни.

Многочисленные работы с использованием модельных организмов, изучение основных механизмов клеточного старения, крупномасштабные широко геномные ассоциативные исследования человека, генетические исследования долгожителей позволили выявить различные эволюционно-консервативные метаболические пути, сходные у различных видов организмов и человека, а также отдельные генетические локусы, влияющие на ключевые признаки старения человека и продолжительность жизни.

Значительное увеличение продолжительности жизни и неотвратимое демографическое старение человечества подталкивают исследователей все больше фокусироваться на поисках генетических детерминант “здорового старения” и долголетия. В связи с этим возникает необходимость в создании общедоступных высококачественных ресурсов с открытыми и интегрированными базами данных. В настоящее время уже существует несколько крупных ресурсов, содержащих базы данных генов-кандидатов и генетических вариантов, связанных с долголетием и старением человека: AgeFactDB, Digital Aging Atlas и AGEMAP и др. Можно отметить проект Human Aging Genomic Resources (HAGR), который представляет собой набор баз данных (GenAge, AnAge, GenDR, LongevityMap и DrugAge) и инструментов, призванных помочь исследователям изучать генетику старения человека с использованием современных подходов, таких как функциональная геномика, сетевой анализ, системная биология и эволюционный анализ [127, 129–131].

Однако большой объем уже накопленных данных при отсутствии хорошо конкретизированных выводов приводит к предположению, что исследования механизмов старения и долголетия необходимо проводить комбинаторно с разных точек зрения. Комплексный анализ данных “multi-omics” исследований (геномика, эпигеномика, транскриптомика, протеомика, метаболомика и фармакогеномика), особенно с точностью разрешения до одной клетки, может обеспечить многомерный интегрированный профиль гетерогенного процесса старения с беспрецедентной детализацией. Потенциал полногеномных исследований для изучения генетической архитектуры “здорового старения” (или здорового долголетия) открывает новые возможности для поиска терапевтических мишеней, в том числе для фармакологической коррекции процессов старения, конечной целью которых является увеличение периода именно здоровой жизни человека.

Изучение генетических основ старения иммунитета (иммунного старения) становится особенно актуально в свете пандемии коронавируса. На наш взгляд, это будет стимулировать научные сообщества к проведению новых интересных исследований в таких направлениях, как:

– изучение молекулярных причин угасания иммунной системы с возрастом и слабой выживаемости при вирусных заболеваниях, и в то же время исследования феномена успешной выживаемости 100-летних пациентов с COVID-19 [2];

– изучение особенностей иммунной защиты при использовании различных типов вакцин у людей пожилого возраста и долгожителей.

Финансирование проекта осуществлялось из средств Научно-технологического университета “Сириус”.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.