Химическая физика, 2020, T. 39, № 6, стр. 24-35

ВВЕДЕНИЕ

Плазменный коагуляционный фактор XIII (pFXIII), будучи одним из ключевых белков системы свертывания крови, принадлежит к широкой группе трансглутаминаз (эндо-ε-глутамин: ε‑лизин-трансфераза). Подобно другим факторам свертывания крови, рFXIII циркулирует в плазме крови как неактивный профермент. Основная функция pFXIII заключается в поддержании гемостаза путем ковалентной стабилизации фибринового сгустка, сопровождающейся увеличением его механической прочности и устойчивости к деградации плазмином [1, 2]. В присутствии активной формы коагуляционного фактора XIII (FXIIIa, EC 2.3.2.13) полипептидные цепи фибрина вовлекаются в ковалентное сшивание посредством образования изопептидных связей ε/γ-глутамил-лизиновых связей [3]. При этом COOH-концевые части γ-цепей контактирующих периферических D-областей молекул мономерного фибрина ковалентно связываются друг с другом, образуя межмолекулярные γ–γ-димеры [4]. Дополнительно FXIIIa катализирует образование изопептидных связей между α-цепями соседних молекул мономерного фибрина, так что α-цепь одной молекулы взаимодействует с α-цепями двух других молекул, в результате чего образуются α-полимеры, содержащие более пяти полипептидных α-цепей [5]. Также pFXIII наделен многими другим потенциально важными функциями [6, 7].

Плазменный коагуляционный фактор XIII обладает гетеротетрамерной структурой, FXIII-A₂B₂, которая состоит из двух идентичных одноцепочечных каталитических субъединиц A (FXIII-A₂), каждая из которых имеет молекулярную массу ~83 кДа, и двух идентичных одноцепочечных регуляторных субъединиц B (FXIII-B₂) с молекулярной массой ~80 кДа. Субъединицы скреплены между собой слабыми нековалентными связями [1, 2]. Образование комплекса между двумя гетеросубъединицами играет важную роль в поддержании гемостаза, так как полагают, что основная роль FXIII-B заключается в защите каталитических субъединиц от протеолитической деградации, продлевая тем самым “время жизни” FXIII-A в кровеносном русле [8]. Другая функция субъединиц FXIII-B обусловлена их способностью прикрепляться к молекуле фибриногена, доставляя таким образом каталитические субъединицы к белку-мишени [1].

Каталитическая субъединица FXIII-A представляет собой полипептидную цепь, состоящую из 731 остатка (исключая остаток инициаторного метионина (Met)), в том числе девяти остатков цистеина, не образующих ни одной дисульфидной связи. Третичная структура FXIII-A характеризуется наличием пяти различных структурных доменов: N-концевой активационный пептид (FXIII-AP), включающий 37 аминокислотных остатков, домен β-сэндвич (Gly38-184Phe), каталитический домен (Asn185-515Arg), разделенный на NH₂-(189–332) и COOH-терминальные (333–515) субдомены, домены β-barrel 1 (Ser516-628Thr) и β-barrel 2 (Ile629-731Met) [1, 9, 10]. Активный сайт состоит из остатков Cys314, His373 и Asp396, свойственных каталитической триаде цистеиновых протеаз. Первичная структура некаталитической субъединицы FXIII-B составлена из 641 аминокислотного остатка, которые образуют десять коротких тандемных структур (sushi-домены), каждая из которых образована приблизительно 60 аминокислотными остатками, не имеющими в отличие от каталитической субъединицы ни одной свободной тиоловой группы. В свою очередь, структура каждого sushi-домена стабилизирована двумя дисульфидными связями [11].

Превращение pFXIII в FXIIIa является многоступенчатым процессом, который физиологически индуцируется в заключительной фазе каскада свертывания крови при совместном действии тромбина и Са²⁺. На первой стадии процесса активации происходит катализируемое тромбином протеолитическое расщепление связи Arg37–Gly38 на NH₂-концевой части субъединицы FXIII-A. Это приводит к высвобождению активационного пептида FXIII-AP и превращению гетеротетрамера FXIII-A₂B₂ в гетеротетрамер FXIII-${\text{A}}_{{\text{2}}}^{'}{{{\text{B}}}_{{\text{2}}}},$ который по-прежнему не обладает ферментативной активностью. Вторая стадия активации требует ионов кальция, необходимых для диссоциации гетеротетрамера FXIII-${\text{A}}_{{\text{2}}}^{'}$B₂ на субъединицы FXIII-${\text{A}}_{{\text{2}}}^{'}$ и FXIII-B₂. На последнем этапе в присутствии ионов кальция субъединицы FXIII-${\text{A}}_{{\text{2}}}^{'}$ претерпевают крупномасштабные конформационные перестройки, обуславливающие экспонирование остатков Cys314, His373 и Asp396, что приводит к образованию активной формы фермента FXIII-${\text{A}}_{{\text{2}}}^{*}$ [1, 12]. В последнее время были получены данные, свидетельствующие в определенной степени о том, что димерная молекула FXIII-${\text{A}}_{{\text{2}}}^{*}$ склонна разделяться на два мономера FXIII-A*, каждый из которых сохраняет трансглутаминазную активность [13].

В процессе циркуляции в кровотоке коагуляционный фактор XIII, как и другие белки плазмы крови, постоянно подвергается воздействию различных активных форм кислорода (АФК). Хорошо известно, что, будучи высокочувствительной мишенью для АФК, белки подвергаются окислительным модификациям, вызывающим в них химические и структурные превращения, в свою очередь, обуславливающие нарушения их биологических функций [14, 15], причем характер этих нарушений во многом зависит как от структуры белка, так и от природы АФК. В общем случае окисление белков вызывает химические модификации аминокислотных остатков, превращая белки в производные, высокочувствительные к протеолитической деградации, образование межцепочечных перекрестных сшивок или разрыв пептидных связей, приводящий к фрагментации белка [15].

Ранее было показано, что индуцированное озоном окисление коагуляционного фактора XIII [16, 17] влияет на трансглутаминазную активность FXIIIa. Оказалось, что она в значительной степени зависит от стадии превращения рFXIII в FXIIIa, на которой проводилось окисление белка. Впервые с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения нами был идентифицирован набор окислительных сайтов в каталитической субъединице FXIII-A₂ при индуцированном озоном окислении pFXIII на разных стадиях его активации, и была исследована степень, а также химическая природа этих модификаций. Было показано [17], что набор аминокислотных остатков, подверженных окислительной атаке, и степень окисления этих остатков в FXIII-A₂ неактивированного pFXIII, активированного Ca²⁺ pFXIII и полностью активированного pFXIII, обработанного тромбином и Ca²⁺, значительно различаются. Полученные данные позволили постулировать, что в процессе превращения профермента в FXIIIa новые аминокислотные остатки, ранее недоступные окислителю, мигрируют к поверхности белковой глобулы, становясь, таким образом, уязвимыми мишенями для молекул окислителя, в то время как некоторые из исходно поверхностно-экспонированных аминокислотных остатков перемещаются внутрь белка, теряя способность вовлекаться в окислительные модификации [17]. Это убедительно свидетельствует о том, что превращение рFXIII в FXIIIa действительно сопровождается значительными конформационными перестройками FXIII-A₂ на всех стадиях ее активации.

В данной работе впервые исследуются влияние другого окислителя, гипохлорита, на фактор XIII и последствия образования окислительных модификаций на траснсглутаминазную активность FXIIIa. В отличие от озона гипохлорит является физиологическим окислителем. Плазменные белки, которые защищены антиоксидантными ферментами в несопоставимо меньшей степени по сравнению с внутриклеточными белками, непрерывно подвергаются окислительным атакам со стороны нейтрофилов [18]. Активация нейтрофилов как in vitro, так и in vivo при определенных заболеваниях (например, при воспалительных процессах, атеросклерозе и др.) вызывает генерацию АФК, таких как ${\text{O}}_{{\text{2}}}^{ - }$ и H₂O₂, и высвобождение фермента миелопероксидазы. Реакция последней с H₂O₂ в присутствии физиологических концентраций Cl⁻ приводит к образованию мощного окислителя HOCl, который рассматривается главным представителем АФК в плазме крови, а сама миелопероксидаза – маркером оксидативного стресса [19]. Идентификация окисленных аминокислотных остатков в каталитической субъединице может предоставить необходимую информацию как о механизме повреждения структуры pFXIII в условиях, приближенных к физиологическим, так и о снижении ферментативной активности FXIIIa вследствие ее окислительной модификации. Кроме того, полученные результаты позволяют сделать определенные выводы о пространственной доступности аминокислотных остатков в FXIII-A для АФК и о структурных перестройках в окисленном белке.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Фактор FXIII выделяли из донорской плазмы крови человека (получена из Московской центральной станции переливания крови) методом фракционного осаждения сульфатом аммония c последующей ионообменной хроматографией с использованием сорбента DEAE-ToyoPearl M650 (Tosoh, Япония) [20]. Превращение pFXIII в FXIIIа в присутствии ионов тромбина и кальция было выполнено, как сообщалось ранее [21].

Образцы фактора XIII перед окислением находились в буферном растворе, содержащем 44 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) и 150 мМ NaCl c pН 7.4. Окисление образцов pFXIII и FXIIIa с концентрацией 1мг/мл проводили раствором гипохлорита (Sigma-Aldrich, USA) при температуре 37 °С в течение 1 ч при постоянном перемешивании. Количество окислителя составляло 150 мкМ. Реакцию останавливали добавлением десятикратного молярного избытка L-метионина. Для последующих работ образцы переводились в буфер 50 мМ Tris-HCl c 150мМ NaCl (pН 7.4) с использованием центрифужных фильтров Amicon Ultra с размером пор 10 кДа (Millipore, Ирландия).

Влияние окисления на ферментативную активность FXIIIа, полученного из контрольных и окисленных образцов профермента и фермента, оценивалась методом электрофореза в полиакриламидном геле (4% – концентрирующий гель, 10% – разделяющий гель) по накоплению продуктов реакции FXIIIa и фибриногена. Электрофорез восстановленных образцов проводили в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по методу Леммли (Laemmli). Белок был окрашен красителем “кумасси бриллиантовый синий” R250 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Для определения молекулярных масс полипептидных цепей использовали смесь белков-маркеров с молекулярной массой от 10 до 250 кДа (Page Ruler Plus Prestained Protein Ladder, Thermo Scientific, USA).

Для достижения удовлетворительного уровня детекции некаталитической субъединицы FXIII-B образцы после инкубации в растворе с гипохлоритом и контрольные образцы были поделены на две группы. Первая группа была подвергнута ферментативному расщеплению трипсином без предварительной обработки. Вторая группа образцов перед трипсинолизом подверглась процедуре восстановления дисульфидных связей с последующим алкилированием.

Восстановление дисульфидных связей осуществляли с использованием 5 мМ дитиотреитола, алкилирование проводили 15 мМ йодацетамидом. Ферментативное расщепление образцов трипсином осуществляли в соответствии с протоколом производителя (Trypsin Gold, mass spectrometry grade, V5280, Promega, США). Белок разбавляли 50 мМ трис-HCl-буфером с 0.15 М NaCl (рН 8.0) и гидролизовали трипсином при соотношении фермент : образец в смеси 1 : 50 (2 мкг трипсина/100 мкг pFXIII) в течение 16 ч при 37 °С. Реакцию останавливали добавлением муравьиной кислоты до конечной концентрации в 0.1%.

Эксперименты по высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) выполняли с помощью хроматографа Agilent 1100 c системой автоматического отбора проб (Agilent Technologies Inc., США) и тандемного масс-спектрометра 7T LTQ-FT Ultra (ThermoFisher Scientific Inc., США). Для хроматографического разделения 1 мкл каждого образца впрыскивали в колонку С18 (75 мкм × 12 см, Reprosil-Pur Basic C18, Ammerbuch-Entringen, Германия). Использовали следующую подвижную фазу: растворитель A – 0.1% муравьиная кислота в H₂O; растворитель B – ацетонитрил. Хроматографию осуществляли с линейным градиентом путем увеличения относительного содержания растворителя B с 3% до 50% в течение 60 мин. Масс-спектрометрический анализ пептидных фракций проводили с использованием программного обеспечения Xcalibur (Thermo Electron, Бремен, Германия) с автоматическим измерением спектров в двухстадийном режиме. На первом этапе точные массы пептидов были измерены в ячейке ICR в диапазоне m/z = 300–1600 с разрешением R = 50 при m/z = = 400 (количество ионов в ячейке ICR было установлено равным 5 ⋅ 10⁶). На втором этапе пептиды, характеризующиеся пятью наиболее интенсивными пиками первой стадии, подвергались столкновительной диссоциации; спектры фрагментов регистрировались в линейной ионной ловушке (число ионов в LTQ было установлено равным 3 ⋅ 10⁴). После фрагментации соответствующие массы родительских пептидов были динамически исключены из рассмотрения в течение следующих 30 с. Для каждого типа образцов (неокисленный профермент; профермент, обработанный 150 мкМ гипохлорита; неокисленный фермент; фермент, обработанный 150 мкМ гипохлорита) выполняли три биологических повторения, для каждого из которых измерения проводились трижды.

Триптические пептиды образцов pFXIII и FXIIIa были идентифицированы путем поиска в базе данных UniProtKB (UP000005640-9606 HUMAN, Homo sapiens) с использованием программного обеспечения PEAKS Studio (v.8.5, Bioinformatics Solutions Inc., Canada). Точность определения массы для иона-предшественника была установлена равной 15 ppm/млн. Точность массы фрагментов МС/МС – до 0.50 Да.

Фильтрация результатов по средней доле ложных отклонений (FDR) для пептидов была установлена на уровне < 0.1%. Пептиды от шести аминокислотных остатков и максимум с тремя модификациями рассматривались для идентификации. Список обнаруженных окислительных модификаций приведен в табл. 1.

Идентификация с использованием программы PEAKS достигается путем интеграции результатов поиска в выбранной базе данных и результатов анализа спектров с помощью алгоритма de novo. Алгоритм поиска в базе данных используется для идентификации белков. При поиске в базе данных в качестве вариабельных модификаций указывается только ограниченное число посттрансляционных модификаций (ПТМ) для максимизации чувствительности (например, окисление (+15.99), диокисление (+31.99)). Алгоритм поиска модификаций используется для выявления большего количества ПТМ. На этом этапе анализируются только спектры с высокими показателями достоверности при анализе de novo, но не идентифицированные при поиске в базе данных. Список вариабельных модификаций расширяется и включает более специфические модификации из находящихся в базе данных UNIMOD.

Точные сайты модификации идентифицировались по наличию определяющих сайт фрагментов ионов. Определение достоверных сайтов модификаций было достигнуто с помощью параметра Ascore, включающего доверительную оценку идентификации модификации пептида в конкретной позиции (аминокислотного остатка), рассчитанной с помощью программного обеспечения PEAKS, в качестве вероятности –10log p того, что модификация произошла в сообщенной позиции, сравнительно с другими возможными позициями. В этой работе мы использовали порог фильтрации для параметра Ascore > 100.

Все эксперименты повторялись трижды. Аминокислотный остаток, который оказывался модифицированным только в одном из образцов, исключался из дальнейшего анализа. Каждый из аминокислотных остатков, окисленных по меньшей мере на 1% (степень модификации > 1%), считался модифицированным.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Важным параметром в анализе окислительных модификаций белка является идентификация его аминокислотной последовательности – так называемое покрытие. Для субъединицы FXIII-А в контрольном образце рFXIII была детектирована следующая последовательность пептидных фрагментов: 6–11, 13–73, 96–107, 114–129, 144–151, 159–171, 200–221, 245–269, 286–310, 334–363, 380–408, 446–462, 468–513, 516–531, 547–565, 570–616, 652–657, 662–678, 697–727, в то время как для окисленного образца рFXIII детектированными участками субъединицы FXIII-А оказались фрагменты 6–11, 13–73, 96–107, 114–129, 144–156, 159–171, 200–221, 245–269, 286–310, 334–363, 381–418, 446–513, 516–531, 535–565, 570–621, 662–678, 704–727. Это составило 61 и 64%, соответственно, от общего числа аминокислотных остатков каталитической субъединицы.

В контрольном образце каталитической субъединицы FXIIIa были картированы следующие пептидные фрагменты: 6–11, 13–73, 77–107, 144–151, 159–171, 214–221, 245–252, 261–269, 286–310, 334–363, 380–408, 446–462, 468–513, 516–531, 535–540, 547–565, 570–616, 652–657, 662–678, 697–727, а в окисленном образце: 6–11, 13–73, 96–133, 144–156, 159–171, 207–221, 245–269, 286–310, 327–363, 390–418, 433–513, 516–531, 535–565, 570–621, 624–635, 638–657, 662–678, 704–727, что составляет 61 и 76%, соответственно, от первичной структуры белка. Обращает на себя внимание тот интересный факт, что покрытия для окисленных форм каталитической субъединицы как в образце рFXIII, так и в FXIIIa несколько выше, чем в неокисленных образцах. Это, по-видимому, обусловлено разрыхлением структуры белка при окислении и раскрытием новых пептидных связей, доступных для гидролитических ферментов.

Для субъединицы FXIII-B в контрольном и окисленном образцах рFXIII были идентифицированы следующие последовательности пептидных фрагментов: 4–66, 70–85, 96–127, 154–187, 197–208, 265–306, 314–332, 346–360, 363–412, 456–487, 533–543, 578–613; 1–66, 70–85, 96–127, 154–187, 198–208, 265–306, 314–339, 346–360, 363–412, 424–443, 450–487, 492–497, 502–511, 533–543, 572–613, 619–625, что составляло 58 и 66%, соответственно, от суммарного числа аминокислотных остатков субъединицы. В неокисленном и окисленном образцах FXIIIa были картированы следующие участки полипептидной цепи субъединицы FXIII-B: 1–66, 70–85, 90–127, 154–187, 198–208, 254–360, 363–412, 424–497, 502–511, 533–543, 578–613, 619–625 и 1–66, 70–85, 96–127, 154–163, 165–187, 198–208, 265–360, 363–412, 424–443, 450–497, 502–511, 533–543, 578–613, 618–625, что составляло 71 и 69%, соответственно, от всех аминокислотных остатков субъединицы.

Полученные масс-спектрометры пептидов, принадлежащих неокисленным и окисленным образцам коагуляционного фактора XIII, позволили нам составить список молекулярных масс этих пептидов для обнаружения модифицированных сайтов и типа их модификации, обусловленных индуцированны гипохлоритом повреждением pFXIII (табл. 1). Следует отметить, что аминокислоты в исследуемых пептидах модифицированы до различных продуктов окисления. Можно наблюдать, что среди модификаций имеются случаи с присоединением одного (+15.99), двух (+31.99) и трех (+47.98) атомов кислорода одновременно, а также другой тип окислительной модификации для остатка пролина и хлорирования остатка тирозина.

Окислительные модификации аминокислотных остатков Met, Trp, Tyr, Lys, Cys, Asp, Asn, Pro, Phе в субъединице FXIII-A были идентифицированы на основе базы данных UNIMOD (http:// www.unimod.org) и ранее опубликованных работах по механизму окисления белков [17, 22, 23]. Для устранения возможных ошибок в расчетах при сравнении степени модификации образцов, связанных с недостаточным покрытием пептидов в образцах, аминокислотные остатки, которые не были обнаружены в одном из образцов, не учитывались.

Анализ субъединиц FXIII-А и FXIII-B неокисленного и окисленного гипохлоритом коагуляционного фактора XIII методом ВЭЖХ-МС/МС

Увеличение содержания окисленных пептидных форм и уменьшение содержания неокисленных пептидов наблюдалось в окисленном образце относительно незатронутого гипохлоритом pFXIII. Количество окисленных аминокислотных остатков в субъединицах FXIII-A и FXIII-B и степени окисления идентифицированных сайтов модификации различаются у образцов рFXIII и FXIIIа, обработанных гипохлоритом (табл. 2, 3). Для всей молекулы окисленного фактора XIII наблюдаемое отношение количество/степень окисленных аминокислотных остатков составляет 3.5%/1.7%, в то время как для субъединиц FXIII-A и FXIIII-B в окисленном FXIIIp это отношение равно 3.4%/2.1% и 3.5%/1.2% соответственно. В случае обработанного гипохлоритом FXIIIа суммарное отношение количество/степень окисленных аминокислотных остатков, приходящихся на гетеросубъединицы составляет 4.8%/2.5%. Для отдельных окисленных субъединиц FXIII-A2* и FXIII-B2 эта величина равна 5.4%/3.7% и 4.1%/1.2% соответственно. Из представленных данных видно, что молекула FXIIIа представляет собой более уязвимую мишень для окислителя по сравнению с молекулой рFXIII.

Таблица 2.

Модифицированные аминокислотные остатки в субъединице FXIII-A

Модифицированный остаток	Номер остатка	Контрольный pFXIII	Окисленный pFXIII	Контрольный FXIIIa	Окисленный FXIIIa
W	57				<10%
Y	103				<10%
W	130				80–100%
C	152		80–100%		80–100%
M	159		50–80%		50–80%
Y	160				20–50%
W	164		10–20%		10–20%
M	247		10–20%		80–100%
M	265	<10%	80–100%		80–100%
P	288				20–50%
P	289				<10%
C	327				80–100%
N	344				<10%
M	350		50–80%		80–100%
M	406		80–100%		80–100%
C	409		80–100%		80–100%
P	411				20–50%
M	475		50–80%	<10%	80–100%
M	499		80–100%		80–100%
M	512	<10%	80–100%		80–100%
K	513				<10%
M	520		50–80%		80–100%
M	595		10–20%		80–100%
M	646				80–100%
P	655				80–100%
P	675		<10%		20–50%
M	676	<10%	50–80%		50–80%
M	709		50–80%	<10%	80–100%

Таблица 3.  

Модифицированные аминокислотные остатки в субъединице FXIII-B

Модифицированный остаток	Номер остатка	Контрольный pFXIII (alk)	Окисленный pFXIII (alk)	Контрольный FXIIIa (alk)	Окисленный FXIIIa (alk)
Y	18		<10%		20–50%
Y	19		10–20%		10–20%
M	29		80–100%		80–100%
Y	43		<10%		<10%
Y	80				<10%
D	118		<10%		<10%
W	120		<10%		20–50%
Y	164				<10–20%
P	380				20–50%
M	383		20–50%		50–80%
D	389	<10%	20–50%
Y	395				<10%
Y	408		<10%		<10%
M	441		80–100%		50–80%
N	442			<10%	<10%
Y	470		20–50%		<10%
M	503		80–100%	<10%	80–100%
W	578		20–50%
D	579		20–50%		20–50%
Y	606		<20%		<20%

Как видно из рис. 1, за исключением активационного пептида, окисленные аминокислотные остатки были обнаружены во всех структурных элементах субъединицы FXIII-A в молекуле рFXIII. В домене β-сэндвич поврежденными оказались аминокислотные остатки Cys153, Met160 и Trp165; в каталитическом домене поврежденными были только остатки метионинов – Met248, Met266, Met407, Met475, Met500, Met513; в домене β-barrel 1 также в окислительную модификацию были вовлечены только остатки метионинов – Met521 и Met596; в домене β-barrel 2 были обнаружены модификации Pro656, Pro676 и Met710. При обработке FXIIIа гипохлоритом были выявлены дополнительные сайты модификаций в FXIII-A2*: Trp58, Tyr104, Trp121, Tyr161, Pro289, Pro290, Cys328, Asn345, Pro412, Lys614, Met647, Pro656.

Рис. 1.

Первичная структура (последовательность аминокислотных остатков соответствует UniProt P00488 (F13A_HUMAN); http://www.uniprot.org) и экспериментально полученные методом ВЭЖХ-МС/МС последовательности пептидных фрагментов субъединицы FXIII-А для образцов окисленного pFXIII (сплошные линии) и окисленного FXIIIa (точечные линии). Остаток инициаторного Met изображен серым цветом. Сайты модификации в субъединице FXIII-А показаны черными кругами.

Как видно из рис. 2, при обработке рFXIII гипохлоритом в субъединице FXIII-B появляются модификации аминокислотных остатков Tyr38, Tyr39, Met49, Tyr63 в первом домене, Asp138, Trp140 – во втором домене. Ни один из остатков, принадлежащих c третьего по шестой доменам, в покрытии не был поврежден гипохлоритом. В седьмом домене наблюдались модификации Met403, Asp408, Tyr428, в восьмом – Met461, Tyr490, в девятом и десятом – Met523 и Trp598, Asp599, Tyr626 соответственно. В FXIIIа образуются дополнительные модификации субъединицы FXIII-B: Tyr80 – в первом домене, Tyr164 – в третьем домене, Phe380 – в шестом домене, Tyr415 и Asn442 в седьмом домене. Таким образом, так же как и в случае каталитической субъединицы, субъединицы FXIII-B₂ в окисленном образце FXIIIа являются более чувствительными к токсическому действию гипохлорита по сравнению с таковыми в рFXIII.

Рис. 2.

То же, что и на рис. 1, но для субъединицы FXIII-B; 20 аминокислотных остатков на NH₂-концевой части цепи, обозначенные серым цветом, являются сигнальным пептидом. Остальные обозначения те же, что и на рис. 1.

Результаты электрофореза по ковалентной стабилизации цепей фибрина демонстрируют, что в присутствии FXIIIa полипептидные цепи фибрина участвуют в ковалентной сшивке, что проявляется в образовании γ–γ-димеров и α-полимеров. Так как сшивание α-цепей вызывает формирование многомерных структур различной молекулярной массы, наблюдается набор полидисперсных продуктов (рис. 3). Как видно, образование γ–γ-димеров сопровождается снижением количества исходных γ-цепей. При сшивании α- и γ-цепей под действием FXIIIа, обработанного гипохлоритом, накопление γ–γ-димеров снижается по сравнению с контрольным образцом, что есть следствие повреждения структуры FXIII-${\text{A}}_{{\text{2}}}^{*}$ при окислении. Так как цепи Bβ не участвуют в ковалентных сшивках, их содержание остается неизменным.

Рис. 3.

Электрофорез восстановленных образцов ковалентно-сшитого фибрина под действием коагуляционного фактора XIII: 1 – маркер; 2 – FXIIIа, образованный из неокисленного pFXIII; 3 – FXIIIа, образованный из окисленного pFXIII; 4 – FXIIIа неокисленный; 5 – FXIIIа, окисленный гипохлоритом.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В данной работе впервые было исследовано индуцированное гипохлоритом повреждение плазменного коагуляционного фактора XIII. Белки плазмы крови постоянно атакуются различными по своей химической природе и реактивности АФК, в том числе гипохлоритом. Хорошо известно, что активированные нейтрофилы могут генерировать 100 мкМ/л HOCl/OCl^– in vitro, и было высказано предположение, что локальные концентрации HOCl/OCl^– вблизи активированных нейтрофилов in vivo могут быть значительно выше [24]. Таким образом, сильное окисление циркулирующих белков высокими концентрациями HOCl/OCl^–, генерируемых активированными лейкоцитами, может потенциально способствовать повреждению белков плазмы, включая рFXIII.

Окисление белков, индуцированное HOCl, может обуславливать химическую модификацию аминокислотных остатков, не вызывая при этом фрагментации или агрегации самого белка [23]. Показано, что реакционная способность различных аминокислотных остатков в белках к действию HOCl располагается в ряду Met > Cys $ \gg $ Cystinе ≈ His ≈ ≈ протонированные аминогруппы (R–${\text{NH}}_{{\text{3}}}^{ + }$) > > Trp > Lys $ \gg $ Tyr ≈ Arg > Gln ≈ Asn [25, 26]. Данные масс-спектрометрии свидетельствуют о том, что в исследуемом нами белке серосодержащие и ароматические аминокислотные остатки наиболее уязвимы к выбранному окислителю. В списке окислительных модификаций отсутствуют остатки гистидина, обладающего высокой реакционной способностью к гипохлориту. По всей видимости, те остатки гистидина, которые были детектированы в покрытии (His52, His65, His66, His343, His451, His460, His604, His667 и His717), “зарыты” в глубь белка и недоступны окислителю. В этой связи хотелось бы подчеркнуть, что реактивность каждого из аминокислотных остатков может сильно отличаться в разных белках, как это было продемонстрировано ранее [27] при воздействии озона на глютаминсинтетазу (GS) Escherichia coli и бычий сывороточный альбумин (BSA). Хотя BSA и GS имеют сопоставимый размер и содержат почти идентичные количества каждого вида ароматических аминокислотных остатков, окисление этих остатков в BSA происходило намного быстрее, чем в GS. Последнее обстоятельство указывает на то, что чувствительность к окислению зависит от первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры белка.

Совокупность результатов масс-спектрометрических и биохимических исследований показала, что фактор XIII характеризуется пониженной восприимчивостью к действию гипохлорита, в то время как его активация тромбином и ионами кальция снижает толерантность белка к действию окислителя. Это хорошо согласуется с полученными ранее данными, свидетельствующими о том, что превращение pFXIII в FXIIIа повышает чувствительность субъединиц FXIII-${\text{A}}_{{\text{2}}}^{*}$ к индуцированному озоном окислению [16, 28].

Относительная устойчивость pFXIII к индуцированному гипохлоритом окислению имеет несколько возможных причин. Структура pFXIII обладает максимальной компактностью по сравнению с другими формами белка, образующимися в процессе ферментативной активации, что предотвращает доступ любых молекул к каталитическому центру [29], включая маленькие молекулы АФК. Активационный пептид и домен β‑barrel 1 маскируют ключевые аминокислотные остатки Trp279, Cys314, His373 и Asp396, расположенные внутри ядра каталитического домена. Кроме того, AP-FXIII одной субъединицы FXIII-A предотвращает раскрытие активного центра, расположенного в другой субъединице FXIII-A. Структура каталитической субъединицы стабилизируется несколькими водородными связями и солевыми мостиками [30]. Кроме того, два NН₂-концевых sushi-домена субъединицы FXIII-B посредством их связывания с доменами β-barrel 1 и β-barrel 2 субъединицы FXIII-A участвуют в сборке гетеротетрамерной структуры pFXIII [10, 31, 32]. Также было предположено, что взаимодействие между субъединицами FXIII-A и FXIII-B осуществляется с помощью участка петли, локализованной в sushi домене 1 (остатки Tyr18-Pro28), и NН₂-концевых остатков Thr6-Asp25 активационной петли [1]. Таким образом, совокупность гетеро- и гомосубъединичных взаимодействий обеспечивает поддержание компактной и плотной пространственной структуры pFXIII, необходимой для функционирования белка.

Превращение FXIII-A₂ в FXIII-${\text{A}}_{{\text{2}}}^{*}$ способствует разрыхлению структуры каталитической субъединицы, делая ее более открытой и уязвимой для молекул окислителя. Предположительно активационный пептид играет исключительно важную роль в стабилизации димерной структуры FXIII-A₂. Его высвобождение из исходной молекулы приводит к ослаблению взаимодействия между мономерными субъединицами FXIII-A [33]. Как показано в самых последних работах [13, 34], FXIII-${\text{A}}_{{\text{2}}}^{*},$ лишенный FXIII-AP, способен самопроизвольно диссоциировать на два мономера FXIII-A*, что, в свою очередь, может обнажать те аминокислотные остатки, которые располагаются в области соприкосновения мономеров в димере. Как следствие, данные масс-спектрометрии свидетельствуют о появлении новых сайтов модификации в FXIIIа.

Вторая возможная причина высокой резистентности pFXIII к индуцированному гипохлоритом окислению может быть обусловлена обильным содержанием высокоокисляемых серосодержащих остатков, распределенных строго определенным образом вдоль полипептидной цепи мономерной субъединицы FXIII-A. Данные ВЭЖХ-MC/MC показывают, что из 18 остатков метионина, которые содержатся в субъединице FXIII-A, 12 остатков, локализованных в β-сэндвич-домене, каталитическом домене, в доменах β-barrel 1 и β-barrel 2, оказались поврежденными, остаток Met351 оставался в нативной форме, остатки Met137, Met243, Met381, Met647 и Met732 не были идентифицированы в покрытии. Степени окисления окисленных метионинов, как видно из данных табл. 2, различаются, что указывает на их разную пространственную доступность к молекулам окислителя. Наиболее сильно окисленные метионины, максимально уязвимые для гипохлорита, являются, по всей видимости, поверхностно-экспонированными. Метионины, находящиеся на поверхности, окисляются с незначительным влиянием на биологическую активность белка и рассматриваются в качестве перехватчиков АФК, чтобы полностью защитить функционально важные остатки либо минимизировать последствия разрушительного воздействия АФК на белок [35, 36]. Как указывалось выше, при активации pFXIII тромбином и Са²⁺ в покрытии обнаруживаются новые окислительные сайты, в том числе Met351, и растет степень окисления некоторых из выявленных остатков метионинов (табл. 2).

Защитная роль субъединиц FXIII-В, по-видимому, является еще одной причиной устойчивости pFXIII к окислению. Известно, что регуляторные субъединицы, представляющие собой тонкие гибкие нити, способны закручиваться вокруг глобулярных субъединиц FXIII-A [13, 37]. Это предполагает возможность пространственного экранирования субъединицами FXIII-В каждой субъединицы FXIII-A и ее каталитического домена от повреждающего действия молекул АФК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ранее было показано, что клеточный коагуляционный фактор XIII (cFXIII), состоящий в отличие от рFXIII, только из каталитических субъединиц, при индуцированном окислении озоном в условиях, аналогичных таковым для pFXIII, демонстрировал кардинальные изменения как в химической, так и в пространственной структуре белка, что приводило к значительной потере ферментативной активности при превращении cFXIII в FXIIIa [38].

В настоящей работе показано, что при обработке pFXIII гипохлоритом наблюдается модификация множественных аминокислотных остатков субъединицы FXIII-В, локализованных в различных sushi-доменах (табл. 3). Эти данные указывают на способность регуляторных субъединиц быть ловушками АФК, тем самым смягчая их действие на каталитические субъединицы. Диссоциация каталитических и регуляторных субъединиц в FXIIIа лишает FXIII-A* защиты FXIII-В. Антиоксидантная функция субъединицы B способна объяснить тот известный факт, почему субъединицы FXIII-A сами по себе проявляют нестабильность в плазме [12]. Таким образом, кажется разумным предположить, что из-за наличия субъединиц FXIII-В в структуре pFXIII и других вышеупомянутых причин pFXIII обладает высокой резистентностью к действию АФК, столь необходимой для сохранения функциональной активности при циркуляции в кровотоке.

В работе использовали оборудование ЦКП ИБХФ РАН.

Исследование выполнено в рамках бюджетного финансирования по госзаданию (тема 0084–2014–0001). Масс-спектрометрические данные получены при поддержке грантом Российского научного фонда № 16-14-00181.