Кристаллография, 2021, T. 66, № 4, стр. 663-667

ВВЕДЕНИЕ

Анализ литературных данных показывает, что гидрогели являются перспективными материалами для использования в различных областях биотехнологии и биомедицины. Их производство малозатратно, они могут быть легко разработаны и удобны в обработке [1–4]. Гидрогели в качестве перевязочных материалов имеют большие преимущества перед другими покрытиями благодаря ряду свойств: они не прилипают, ускоряют заживление, легко удаляются из раны, уменьшают боли и воспаления.

Известно также, что ионы редкоземельных элементов и комплексы на их основе обладают противомикробной активностью [5–8]. Так, наночастицы на основе La проявляют антимикробные свойства относительно различных патогенных бактерий и грибков человека, особенно они активны против Staphylococcus aureus [9]. Высокая концентрация ионов La³⁺ может привести к повреждению внешней оболочки клеточной мембраны Escherichia coli и увеличить ее проницаемость. Это приводит к снижению скорости или прекращению синтеза аденозинтрифосфата и, как следствие, блокированию роста клеток E. coli [10]. Редкоземельные элементы от La³⁺ до Lu³⁺ имеют ионные радиусы от 1.03 до 0.99 Å. Эти величины близки к радиусу иона Ca²⁺ (1.00 Å), входящего в состав клеток бактерий. Включение этих элементов в композит может способствовать замещению ионов Са²⁺ в клетках бактерий ионами редкоземельных элементов, вызывая гибель бактерий [11, 12].

В [13] для повышения антимикробной активности композитного перевязочного материала было предложено включить в матрицу гидрогеля ионы редкоземельных элементов (RE). Впервые были созданы композиционные гидрогели на основе нетоксичного, биосовместимого полимера поли-n-винилпирролидона (ПВП) (С₆H₉NO)_n c гидрофильной группой N–C=O и гидрофобной полимерной цепочкой С–С с функциональными частицами RE(NO₃)₃ ⋅ xH₂O (ПВП–RE). Были выбраны редкоземельные элементы La, Gd, Yb и показано, что новые материалы ПВП–RE действительно обладают антимикробной активностью. Отличительной особенностью композита ПВП–La(NO₃)₃ ⋅ 6H₂O (ПВП–La) от композитов ПВП–Gd и ПВП–Yb было присутствие на его поверхности включений с размерами до 15–20 мкм в форме “розеток” (подобных цветам). Методом рентгенофазового анализа не удалось получить подробных сведений об особенностях структуры таких образований.

Цель настоящего исследования – детальная характеризация структурных особенностей композиционного гидрогеля ПВП–La(NO₃)₃ ⋅ 6H₂O методами электронной микроскопии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Композиционный гидрогель получали методом золь-гель из ПВП, сшивающего агента тетраэтоксисилана и порошка La(NO₃)₃ ⋅ 6H₂O. При получении композиционного гидрогеля ПВП–La к 11%-ному водному раствору ПВП добавляли молочную кислоту концентрацией 0.01 мас. % (катализатор), порошок La(NO₃)₃ ⋅ ⋅ 6H₂O в количестве 5.59 мас. % и тетраэтоксисилан – 5.04 мас. % [13].

В настоящей работе морфологию порошка La(NO₃)₃ ⋅ 6H₂O изучали с помощью растрового электронного микроскопа (РЭМ) Scios (FEI, США). Для минимизации радиационных повреждений образца при взаимодействии с электронным пучком использовали метод низковольтной растровой электронной микроскопии (ускоряющее напряжение до 1 кВ). Для детального исследования особенностей микро- и наноструктуры “розеток” исходные композиты высушивали в электронном микроскопе. При проведении исследования этих включений в композиционом геле ПВП–La с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) методом фокусировки ионного пучка были приготовлены срезы толщиной до 100 нм. Локальный анализ высушенного до постоянной массы и перетертого в порошок до потери кристаллического блеска ПВП–La, а также поперечного среза проводили в просвечивающем электронном микроскопе Tecnai Osiris FEI в режиме высокоразрешающей просвечивающей растровой электронной микроскопии с использованием высокоуглового кольцевого темнопольного детектора (ВР ПРЭМ). Карты распределения элементов в композите регистрировали с помощью энергодисперсионного рентгеновского анализатора (Super-X SDD).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследована структура исходных компонентов, используемых для получения образцов, и сформированного композитного гидрогеля ПВП–La в нативном и высушенном состояниях. На РЭМ-изображениях порошка La(NO₃)₃ ⋅ 6H₂O (добавляемого затем в гидрогель ПВП) обнаружены включения шестигранных призм с размером ребра ∼1.8 мкм, а также игольчатых кристаллов шириной до 1 мкм и длиной до 50 мкм (рис. 1). Анализ рентгенограмм порошка La(NO₃)₃ ⋅ 6H₂O (PDF № 00-022-1126) показал, что эти кристаллы могут быть фазами La₂O₃ (PDF № 01-074-2430) и La(OH)₃ (PDF № 01-083-2034) (рис. 2а).

Рис. 1.

РЭМ-изображение исходного порошка La(NO₃)₃ ⋅ 6H₂O: а – кристаллы в виде призм, б – игольчатые кристаллы.

Рис. 2.

Рентгеновские дифрактограммы порошка La(NO₃)₃ ⋅ 6H₂O (а) (показаны положения рефлексов Брэгга для La(NO₃)₃ ⋅ 6H₂O (1), La(OH)₃ (2), La₂O₃ (3)) и нативного гидрогеля ПВП–La (б).

Гидрогель представляет собой смесь твердого вещества (полимера) и жидкости (воды). По данным [14] в гидрогелях могут присутствовать четыре типа структурированной воды: свободная вода (1) (заполняет пространство между цепями полимера и пор и может быть легко удалена из гидрогелей в мягких условиях); связанная вода (2) (напрямую присоединяется к полимерной цепи посредством гидратации функциональных групп или ионов и является неотъемлемой частью структуры гидрогелей, она может быть удалена только при высоких температурах); промежуточная вода (3) (не присоединенная к сети гидрогелей, но физически захваченная между гидратированными полимерными цепями); полусвязанная вода (4) (обладает промежуточными свойствами связанной и свободной воды: слои воды могут быть включены в структуру гидрогелей, но гораздо слабее взаимодействуют с функциональными группами и ионами).

На присутствие структурированной воды указывают два диффузных пика на рентгеновской дифрактограмме нативного гидрогеля ПВП–La (рис. 2б): асимметричный пик при 2θ ~ 20°, об-условленный водой (1) и водой (2), и сдвинутый в сторону больших углов диффузный пик при 2θ ∼ ∼ 42°, соответствующий кластерам воды (3). Отметим, что дифракционные пики La(NO₃)₃ ⋅ 6H₂O на дифрактограммах нативного ПВП–La отсутствуют. Этот факт свидетельствует о гидролизе La(NO₃)₃ ⋅ 6H₂O при образовании композитного гидрогеля ПВП–La.

На РЭМ-изображении гладкой поверхности нативного, а также высушенного гидрогеля ПВП–La наблюдаются включения в виде “розеток” размерами до 15–20 мкм (рис. 3). РЭМ-изображения отдельной розетки размером ∼10 мкм и ее поперечного среза (режим детектирования обратно рассеянных электронов) представлены на рис. 3б, 3в. Из полученных изображений следует, что такое включение – “розетка” – представляет собой объемное образование, погруженное в массу композита ПВП–La на глубину до ∼5 мкм. Более светлый контраст от включения при регистрации в режиме обратно рассеянных электронов свидетельствует о том, что оно обогащено лантаном. На рис. 4 представлены РЭМ-изображения с большим увеличением отдельных “лепестков розетки”, полученные в режимах детектирования вторичных и обратно рассеянных электронов. Видно, что каждый отдельный “лепесток” представляет собой агломерат наностержней, в каждом фрагменте которого выделяется преимущественное направление. Наностержни определяют форму агломератов в гидрогеле в целом. Области включений содержат микропоры, в то время как вне “розетки” в композиционном геле пор обнаружено не было. Можно предположить, что в процессе формирования композиционного гидрогеля происходит “локальное” перераспределение концентрации ионов лантана, приводящее к образованию “розеток”.

Рис. 3.

РЭМ-изображение поверхности нативного композитного гидрогеля ПВП–La (а), отдельной “розетки” на поверхности высушенного ПВП–La (б) и ее поперечного среза (в) (режим обратно рассеянных электронов).

Рис. 4.

РЭМ-изображения отдельных лепестков розетки, полученные в режиме детектирования вторичных (а) и обратно рассеянных (б) электронов.

Для более детального анализа включений готовили утоненные образцы композита ПВП–La, которые исследовали с помощью ПЭМ (рис. 5). Анализ электронограмм области А выделенного участка лепестка наностержней и области В массива гидрогеля ПВП–La, содержащих по три диффузных отражения с межплоскостными расстояниями d ∼ 2.7, 1.8–1.9 и 1.0–1.1 Å, свидетельствует об аморфном состоянии всего образца с элементами ближнего порядка (рис. 5б).

Рис. 5.

РЭМ-изображение поперечного среза “розетки” (а), где квадратом выделена область ПЭМ-исследования. Изображение участка А “розетки” и участка В вне ее, полученное в режиме ВР ПРЭМ, и соответствующие им дифракционные картины справа (б). Карты распределения элементов в выделенной области включения (в).

На рис. 5в представлено картирование по элементам La, O, Si, C, N выделенной области поперечного среза “розетки” высушенного гидрогеля ПВП–La, откуда следует, что наностержни, формирующие лепестки “розетки”, обогащены не только лантаном, но и кислородом. Кроме того, анализ данных энергодисперсионного рентгеновского анализа участков А и В, выделенных из массива композита и включения, показал, что область “розетки” содержит элементы С (54 ат. %), О (29 ат. %), N (4 ат. %), Si (0.5 ат. %) и La (10 ат. %), а область гидрогеля вне “розетки” – С (53 ат. %), О (14 ат. %), N (6 ат. %), Si (3.7 ат. %) и La (2 ат. %).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Электронно-микроскопическое исследование композиционного гидрогеля ПВП–La показало, что при формировании материала в объеме гидрогеля кристаллический порошок La(NO₃)₃ ⋅ 6H₂O гидролизуется, и лантан равномерно распределяется в матрице ПВП. Однако на поверхности композита формируются включения в виде “розеток” размерами до 20 мкм, построенные из наностержней, обогащенных лантаном и кислородом. Таким образом, согласно данным энергодисперсионного рентгеновского анализа ионы лантана распределяются неравномерно по поверхности гидрогеля ПВП–La. Можно говорить о нижней и верхней границах концентрации La на поверхности – вне “розеток” (как и в объеме нативного гидрогеля ПВП–La) присутствует ∼2 ат. % ионов La³⁺, и дополнительно во включениях их концентрация достигает ∼10 ат. %. Согласно литературным данным при увеличении концентрации редкоземельных элементов усиливается ингибирование роста бактерий. Вероятно, именно факт высокой концентрации лантана во включениях – “розетках” – на поверхности композита способствует более высокой антимикробной активности гидрогеля ПВП–La, что было отмечено в [13] при сравнении с полученными в аналогичных условиях гидрогелями ПВП–Gd, ПВП–Yb, на поверхности которых подобные включения отсутствовали.

Авторы выражают благодарность профессору Г.М. Кузьмичевой за предоставление образцов для исследования и плодотворное обсуждение результатов.

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в части электронно-микроскопических исследований на оборудовании ЦКП “Диагностика материалов” ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” и Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 18-03-00330).