Кристаллография, 2021, T. 66, № 5, стр. 771-775

ВВЕДЕНИЕ

В эукариотах и археях фактор инициации трансляции 2 (e/aIF2) играет ключевую роль в инициации биосинтеза белка. В ГТФ-связанной форме он доставляет инициаторную метионил-тРНК на малую субчастицу рибосомы. Структурные перестройки, возникающие в 43S преинициаторном комплексе, состоящем из малой рибосомной субчастицы 40S, связанной с факторами инициации трансляции eIF1, eIF1A, eIF3, и тройным комплексом eIF2-Met-tRNAi^Met-GTP, способствуют быстрому гидролизу ГТФ даже в отсутствие мРНК [1]. После узнавания старт-кодона и удаления неорганического фосфата (Pi) eIF2 переходит в ГДФ-связанную форму и диссоциирует из инициаторного комплекса [2, 3], оставляя инициаторную тРНК в Р-сайте малой рибосомной субчастицы и открывая возможности для дальнейших этапов биосинтеза белка.

Фактор инициации трансляции 2 состоит из трех субъединиц (α, β, γ) и функционирует как гетеротримерный комплекс. Центральную роль в формировании e/aIF2 играет γ-субъединица. Она взаимодействует как с α-, так и с β-субъединицами, тогда как α- и β-субъединицы не взаимодействуют друг с другом. Присутствие α-субъединицы необходимо для связывания инициаторной метионил-тРНК [4, 5]; β-субъединица в эукариотическом факторе при образовании инициаторного комплекса 43S взаимодействует с мРНК [6]. Дефекты в связывании γ- и β-субъединиц, обусловленные миссенс-мутацией Ile222Thr в человеческом IF2γ (HsaIF2γ), приводят к Х-хромосомному неврологическому заболеванию, характеризующемуся умственной отсталостью и микроцефалией [7]. В дрожжах аналогичная мутация ухудшает правильный выбор старт-кодона и функционирование SceIF2 in vivo, причем негативная роль указанной мутации может быть минимизирована суперэкспрессией гена белка eIF2β [7]. Структурное обоснование негативной роли миссенс-мутации в этих факторах в настоящее время невозможно, так как до сих пор не определена структура ни одного эукариотического фактора инициации трансляции 2 с атомным разрешением.

Ранее было показано, что in vitro аIF2 может функционально заменять eIF2 в связывании Met-tRNAi^Met с эукариотической рибосомой и в сканировании матрицы [8]. В настоящее время известны кристаллические структуры γ-субъединиц из Pyrococcus abyssy (PabIF2γ) [9], Methanococcus jannaschii (MjaIF2γ) [10], Sulfolobus solfataricus (SsoIF2γ) [11, 13] и Pyrococcus furiosus (PfuIF2γ) [12]. Каждая γ-субъединица состоит из трех доменов, N-концевой домен (G-домен) представляет собой ГТФазу и отвечает за основные функции белка, в том числе за узнавание β-субъединицы [12–14]. G-домены структур aIF2 из разных организмов (за исключением лабильных переключателей) могут быть наложены друг на друга c r.m.s.d. < 0.65 Å [14]. Это предполагает наличие только незначительных локальных изменений в сайте узнавания β-субъединицы. Со стороны последней во всех известных структурах в узнавании γ-субъединицы участвует α-спираль [12–14]. В HsaIF2β участок 171–189 аминокислотной последовательности, соответствующий спирали α1 в структуре факторов из архей [15], скорее всего также имеет спиральную конформацию.

Тогда можем предположить, что миссенс-мутация будет иметь одинаковое влияние на целостность гетеротримера во всех e/аIF2. В настоящее время проверить это предположение возможно только для архей, так как только для них известны пространственные структуры IF2 или его субъединицы. Для исследования выбрали SsoIF2γ с мутацией Ile181Thr, которая является аналогом мутации Ile222Thr в HsaIF2γ. Полученная в работе структура мутантной формы Ile181Thr SsoIF2γ оказалась идентична структуре белка SsoIF2γ дикого типа (4rjl) [16]. Встраивание полученной структуры в структуру αβγ-гетеротримера [13] не выявило стерических или других препятствий для связывания β- и γ-субъединиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение Ile181Thr SsoIF2γ. Суперпродукцию и очистку мутантной формы Ile181Thr SsoIF2γ проводили так же, как и белка SsoIF2γ дикого типа [17]. Непосредственно перед кристаллизацией белок Ile181Thr SsoIF2γ смешивали с нуклеотидом GDPCP и проводили эксперименты по кристаллизации в условиях, описанных в [18] для мутантной формы Sso aIF2γ (∆37–47) с GDPCP.

Определение структуры мутантного белка. Дифракционные данные собраны в Институте белка РАН (Пущино, Россия) на генераторе с вращающимся анодом (Bruker AXS MICROSTAR) с CCD-детектором (Bruker PLATINUM 135). Данные обрабатывали с помощью программного комплекса PROTEUM^plus (Bruker AXS). Стартовые фазы получены методом молекулярного замещения в программе Phaser [19], принадлежащей комплексу кристаллографических программ CCP4 [20]. В качестве стартовой модели использовали структуру белка SsoIF2γ дикого типа высокого разрешения в комплексе с GDPCP (PDB ID 4rjl) [16]. Полученную структуру уточняли при разрешении 2.1 Å с использованием программного комплекса PHENIX [21]. Ручную правку и модификацию модели осуществляли с помощью программного комплекса Coot [22]. Статистика сбора данных и кристаллографического уточнения представлена в табл. 1. Координаты и структурные факторы помещены в банк белковых данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время структура βγ-комплекса IF2 известна для двух архей: S. solfataricus [13, 14] и P. furiosus [12], что позволяет надежно выделить область межмолекулярного взаимодействия βγ. Фрагменты аминокислотных последовательностей a/eIF2γ и a/eIF2β, ответственные за формирование межмолекулярного взаимодействия βγ, представлены на рис. 1. Список доступных структур субъединиц aIF2 с литературными ссылками и PDB-кодами для каждой структуры приведены в табл. 2. Для исследования влияния миссенс-мутации в аIF2γ на сродство β- и γ-субъединиц в архейном IF2 выбрали структуру SsoIF2γ прежде всего потому, что гетеротример SsoIF2 определен с более высоким разрешением (2.15 Å), чем гетеродимер PfuIF2 (2.8 Å). Кроме того, в кристалле гетеродимера PfuIF2 N-конец β-субъединицы имеет плотный контакт с доменом II γ-субъединицы, что, по-видимому, искажает его спиральную конформацию, которая cохраняется в SsoIF2γ.

Рис. 1.

Сравнение аминокислотных последовательностей фрагментов aIF2 и eIF2 (табл. 2), ответственных за формирование области межмолекулярного взаимодействия βγ. Остатки, взаимодействующие в межмолекулярной области β- и γ-субъединиц SsoIF2, помечены звездочками; а – сравнение фрагмента последовательностей IF2γ архейных и эукариотичесих белков; б – сравнение аминокислотных последовательностей участка β-cубъединицы архейных и эукариотических белков, ответственного за связывание γ-субъединицы; на сером фоне показаны идентичные остатки, на черном – остатки, кардинально различающиеся в архейных и эукариотических последовательностях.

Кристаллическая структура мутантной формы Ile181Thr SsoIF2γ в комплексе с GDPCP (аналогом ГТФ) определена при разрешении 2.1 Å. Наложение этой структуры на структуру аналогичного комплекса белка дикого типа [16] показывает их полную идентичность (средняя квадратичная ошибка равна 0.184 Å для всех С_α-атомов). Фрагмент структуры, ответственный за контакт с β-субъединицей, показан на рис. 2. В месте точечной мутации боковая цепь треонина повторяет валиновую часть Ile181, положения атомов OG1 и CG1 совпадают в пределах ошибки измерения. В мутантной форме атом OG1 связан с двумя молекулами воды (S107 и S177), в структуре дикого типа вода вблизи CG1 отсутствует. Таким образом, единственное следствие миссенс-мутации в SsoIF2γ – появление полярного остатка на поверхности при полном сохранении конформации белка.

Рис. 2.

Наложение участков (Asn143-Lys203) структур SsoIF2γ дикого типа и мутантной формы Ile181Thr SsoIF2γ, определяющих связывание β-субъединицы: а – вторичная структура и аминокислотные остатки SsoIF2γ дикого типа показаны черным, аминокислотные остатки мутантной формы – белым. N-концевая α-спираль (Ser2-Pro19) SsoIF2β, участвующая в формировании βγ-комплекса, показана серым; б – положения атомов CG1 в изолейцине белка дикого типа и OG1 в треонине мутантной формы совпадают в пределах ошибки измерения (0.26 Å). В мутантной форме остаток Thr181 связан с двумя молекулами воды.

Остаток в положении 181 включен в область межмолекулярного взаимодействия βγ и может оказывать влияние на сродство комплекса. Замена γ-субъединицы дикого типа в структурах SsoIF2αβγ и PfuIF2βγ на мутантную форму Ile181Thr SsoIF2γ показывает, что место мутации в области межмолекулярного взаимодействия βγ как SsoIF2, так и PfuIF2 остается доступным растворителю. Обе молекулы воды, входящие в ближайшее окружение Thr181 в свободной мутантной форме SsoIF2γ, сохраняют свое положение при образовании βγ-гетеродимера, что позволяет этому остатку образовать все возможные для него водородные связи. Таким образом, анализ структурных данных показывает, что миссенс-мутация в SsoIF2 не создает стерических или каких-либо других ограничений, мешающих связыванию субъединиц. Это подтверждают проведенные биохимические эксперименты по связыванию мутантной формы Ile181Thr SsoIF2γ с SsoIF2β дикого типа (рис. 3). Обе субъединицы по-прежнему связываются друг с другом со сродством в соотношении 1 : 1.

Рис. 3.

Профиль элюции комплекса SsoIF2βγ и его компонентов, полученный с использованием гель-хроматографии и колонки Superdex 75 10/30. Тонкая черная пунктирная линия – SsoIF2γ дикого типа, тонкая серая пунктирная линия – Ile181Thr SsoIF2γ, черная пунктирная линия – SsoIF2β, черная сплошная линия – SsoIF2γβ, серая сплошная линия – Ile181Thr SsoIF2γβ.

Сравнение аминокислотных последовательностей архейных и эукариотических факторов инициации трансляции 2 (рис. 1) показывает, что некоторые остатки области межмолекулярного взаимодействия βγ, сохраняющие идентичность в археях, кардинально меняются в случае эукариот. Это остатки в позициях 167, 177, 187, 189, 194 и 197 (номенклатура SsoIF2γ). Возможно, именно замены в каких-то из этих положений при наличии миссенс-мутации влияют на сродство β- и γ-субъединиц в эукариотических IF2. Исследование влияния замен в этих положениях на сродство Ile181Thr SsoIF2γ и SsoIF2β SsoIF2 является целью дальнейшей работы.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 18-04-01331-а).