Российские нанотехнологии, 2023, T. 18, № 1, стр. 93-98

ВВЕДЕНИЕ

Развитие глобальной биоэкономики создает потребность в новых видах сырья и процессах, направленных на получение топлива и сырья. Использование микроводорослей может играть значительную роль в этих процессах. Попытки повысить ценность биомассы направлены на увеличение содержания липидов и углеводов, как предпочтительные исходные компоненты для конверсии в топливо и другие более ценные продукты. В последнее время внимание сосредоточено на получении микроводорослей с повышенным содержанием белка [1].

Отметим, что фототрофные микроорганизмы широко используются в различных технологиях: по очистке сточных вод, обессоливанию воды, утилизации дымовых газов, образующихся при сжигании ископаемого топлива [2].

При проектировании фотобиореакторов (ФБР) решаются такие задачи, как перемешивание и массоперенос в растущей культуре, создание необходимых температуры и рН, но доминирующим фактором по-прежнему остаются проникающая способность и распределение света. Естественный солнечный свет часто используют для уменьшения себестоимости выращивания, однако падающий свет неизбежно изменяется в зависимости от погоды, суточного цикла и времени года. Плотность светового потока фотонов солнечного света составляет более 2000 мкмоль м²⋅с^–1. Однако оксигенные фотомикроорганизмы могут достичь теоретически максимальной эффективности преобразования солнечной энергии в 8–10%. Также важным параметром являются спектральные характеристики света, так как только солнечная радиация в диапазоне 400–700 нм – фотосинтетически активная радиация (ФАР) – может использоваться, составляя 50% от всего солнечного света. Излучение, выходящее за пределы ФАР, является основной причиной повышения температуры при выращивании [3].

Кроме того, УФ-диапазон солнечного света смертелен для клеток. Распределение интенсивности света неравномерно внутри ФБР из-за поглощения и рассеяния в растущей культуре [4], а ослабление излучения зависит от длины волны света, концентрации клеток, геометрии ФБР и проникающей способности. В некоторых случаях свет может проникать только на несколько миллиметров, когда плотность культуры микроводорослей достигает более 10 г ⋅ л^–1 в ФБР [3].

В лабораторной практике для культивирования фототрофных микроорганизмов используют ФБР различных конструкций.

Цилиндрические колонные ФБР бывают с барботажем и без. Обычно неподвижные распылители различной конструкции (в виде кольца или дисков, снабженных отверстиями и форсунками или с равномерно расположенными диффузорами из кремнезема, которые работают как пористые твердые тела) для газовой фазы расположены в нижней части ФБР. Расход подаваемого газа составляет от 0.1 до 1.0 объема газа на объем культивируемой среды в минуту. Диаметр таких систем для культивирования, как правило, составляет от 7 до 24 см, а для освещения используют флуоресцентные или светодиодные лампы.

Плоские ФБР – это распространенный тип реакторов для исследования микроводорослей. Они состоят из двух параллельных пластин с небольшим расстоянием между ними, большой поверхности для светового излучения и поэтому обладают высокой эффективностью использования света, а также позволяют избежать “темновых зон”. При разных подходах плоские ФБР размещают вертикально, горизонтально или под определенным углом. Подобно цилиндрическим ФБР с барботажем плоские ФБР могут эксплуатироваться как эрлифтные ФБР с разделенными зонами, одна из которых аэрируемая, подаваемый воздух может распределяться через барботеры, трубки или мембраны для перемешивания растущей культуры и подачи воздушной смеси с диоксидом углерода. В ФБР такого типа часто используются различные перегородки для улучшения перемешивания и распределения света, светодиодное освещение, а также натриевые лампы, люминесцентные, галогенные, неоновые лампы. Освещение может быть как с одной, так и с двух сторон, в некоторых конструкциях второй источник света заменяют на зеркальную поверхность. Освещенность в ФБР такого типа поддерживается на уровне от 80 до 400 мкмоль м² ⋅ с^–1 [5].

В [6] для увеличения массообмена и исключения застойных зон и осаждения биомассы микроводорослей представлен инновационный лабораторный плоский ФБР вертикального эирлифтного типа с уникальной асимметричной U-образной формой объемом 7.2 л. Его эффективность была подтверждена культивированием Chlorella sorokiniana ATCC 22521 – в течение пяти суток выход по оптической плотности при 750 нм составил пять единиц.

Лабораторные ФБР с мешалкой изготавливают из стекла с освещением с внешней стороны. Иногда дополнительный источник освещения помещают внутрь ФБР. Также нередко в таких типах ФБР для освещения используют оптическое волокно, погруженное внутрь растущей культуры.

Трубчатые ФБР состоят из двух частей, соединенных между собой насосами: “солнечного ресивера” и эрлифтной системы. Большая часть фотосинтетических реакций происходит в “солнечном ресивере”, состоящем из прозрачных труб из полимерного материала или стекла различного диаметра и длины, установленных в различных положениях, для обеспечения минимизации занимаемой площади. Вторая часть – “пузырьковая колонна” служит для интенсификации газового обмена между растущей культурой и атмосферой для более полного удаления накопившегося в процессе роста кислорода. Как правило, диоксид углерода подается в конце “пузырьковой колонны”–начале “солнечного ресивера” для увеличения времени его пребывания в системе. Трубчатые ФБР лабораторного масштаба также могут быть упрощенной версии – иметь только часть солнечного приемника с упрощенной насосной системой, что снижает затраты.

Другим типом ФБР является использование для их изготовления полимерных материалов, из которых можно получать ФБР различной конструкции: в виде мешков, подвешивающихся вертикально, под углом, размещающихся непосредственно на поверхности моря для перемешивания с помощью волнового движения. Но, как правило, такие системы имеют недостаточное перемешивание, что может привести к снижению выхода.

Тонкослойные ФБР каскадного типа представляют собой открытые ФБР, в которых растущая суспензия микроводорослей направляется вниз самотеком под действием силы тяжести по каналам, расположенным под определенным регулируемым углом. Суспензия собирается в рециркуляционную емкость и насосом заново подается наверх канала. Регуляция объемного расхода и угла установки каналов позволяет регулировать толщину слоя растущей культуры, который составляет 0.5–1 см. ФБР такого типа могут иметь один или несколько каналов и располагаются, как правило, в теплицах [5].

Для увеличения поглощения диоксида углерода разрабатываются лабораторные ФБР с мембранной системой [7].

В последнее время стали культивировать микроводоросли, иммобилизованные в гидрогелях, что позволяет сократить потребление воды во время выращивания и обеспечить потенциальный физический барьер против бактериальной микрофлоры. Также используется 3D-биопечать для создания различных гидрогелевых структур для выращивания ряда штаммов микроводорослей. Для оптимизации распространения света в гидрогелях их выполняют в форме кораллов. Однако выращивание микроводорослей в системах на основе гидрогелей все еще требует развития в отношении газового обмена и метаболитов, необходимых для жизнедеятельности микроводорослей [8].

В [9] было показано положительное влияние гидрогелей на рост микроводорослей с наночастицами оксида алюминия и оксида циркония при культивировании в колбах, тогда увеличение продуктивности достигло 20%.

В настоящей работе для увеличения продуктивности микроводоросли Chlorella vulgaris в плоском ФБР горизонтального типа использовали гидрогель с наночастицами диоксида титана, а также адаптивную систему освещения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. В работе использовали йота-каррагинан (Special Ingredients, Великобритания), поливиниловый спирт (ПВС) 22 000 г/моль (Авилон-КомпаниХим, Россия), диоксид титана чистотой 99.5% (BDT, Россия).

Культура и условия выращивания. В качестве культуры выбран штамм микроводоросли Chlorella vulgaris GKV 1 из коллекции НИЦ “Курчатовский институт”, широко используемый для различных исследовательских задач.

Культивирование осуществляли в горизонтальном плоском ФБР общим объемом 5 л, выполненном из прозрачного органического стекла толщиной 5 мм. Объем культивируемой среды вместе с посевным материалом составлял 4.3 л. Перемешивание осуществлялось за счет прокачивания среды с помощью водяного насоса с расходом 1000 мл/мин. Температура при культивировании – 24 ± 1°С. В качестве питательной среды использовали модифицированную среду Bold’s Basal Media (BBM) следующего состава г/л: KNO₃ – 1.25, KH₂PO₄ – 1.25, MgSO₄⋅7H₂O – 1, CaCl₂ – 0.0835. Добавляли 1 мл стокового раствора микроэлементов. Его состав по Пфеннигу мг/л: EDTA – 5000, FeSO₄⋅7H₂O – 2000, ZnSO₄⋅7H₂O – 100, MnCl₂ – 30, H₃BO₃ – 300, CaCl₂⋅6H₂O – 200, CuCl₂ – 10, NiCl₂·2H₂O – 20, Na₂MoO₄⋅2H₂O – 20 [9]. рН питательной среды доводили до 7.0. В качестве источника освещения использовали флуоресцентную лампу мощностью 108 Вт. Ее устанавливали на таком расстоянии, чтобы обеспечивался световой поток в 100 мкмоль фотонов м^–2 ⋅ с^–1 на освещаемой поверхности ФБР. Барботаж атмосферным воздухом осуществлялся с помощью компрессора с расходом 250 мл/мин. Для первого ФБР (с гелем) организовали адаптивное освещение, внизу ФБР был помещен измеритель ФАР Almemo 2450 с датчиком FLA 623 PS (Ahlborn, Германия), по которому осуществляли досветку до необходимого уровня освещенности растущей культуры с помощью светодиодов (smd 2835 IP 23). При культивировании измеряли рН с помощью рН-метра Seven Compact (Mettler Toledo, Швейцария) и оптическую плотность при 750 нм на спектрофотометре Varioscan LUX (Thermo Fisher Scientific, США).

Приготовление гидрогеля. В качестве оптического материала синтезировали гель с содержанием диоксида титана (TiO₂) 0.25% (с кристаллической структурой рутил, размер частиц 84 ± 20 нм) по модифицированной методике [10]: ПВС (2.5%) и каррагинан (2.5%) гомогенизировали при 70°С и перемешивали на магнитной мешалке 400 об./мин 240 и 45 мин соответственно, затем смешивали на магнитной мешалке при 400 об./мин 60 мин, добавляли диоксид титана и гомогенизировали на магнитной мешалке при 400 об./мин 60 мин, затем заливали в чистую плоскую емкость для образования плоского геля, остужали при комнатной температуре, затем выполняли четыре цикла замораживание/оттаивание –24/+24°С в течение четырех суток, затем сушили при 35°С двое суток. Из полученного геля вырезали квадрат со стороной 200 мм, толщиной 5 мм и помещали в первый ФБР.

Определение плавучести гидрогеля. Плавучесть гидрогелей определяли путем помещения их в цилиндр на 100 мл со средой для культивирования микроводорослей и измерения глубины погружения. Измерения начинали проводить через 100 мин после помещения гидрогелей в цилиндр, давая им набухнуть.

Анализ состава метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК). Для анализа содержания МЭЖК необходима лиофильно высушенная биомасса. Сбор биомассы проводили центрифугированием при 7500 об./мин (центрифуга Awel MF 20, ротор AMF 20–8 RFID, Франция) в течение 10 мин при 20°C, дважды промывали дистиллированной водой для удаления адсорбированных солей. Собранную влажную биомассу лиофильно сушили на лиофильной сушилке FreeZone 2.5 (Labconco, США) в течение 12 ч.

Получение МЭЖК проводили прямым метанолизом согласно методу [11].

Анализ МЭЖК проводили методом газовой хроматографии на газовом хроматографе Bruker 430 GC (Varian Inc. США), снабженном пламенно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой Select TM Biodiesel (30 м × × 0.32 мм × 0.25 мкм). Количество вводимой пробы – 1 мкл [12].

МЭЖК идентифицировали по относительному времени удерживания на колонке компонентов смеси в сравнении со стандартом, количественное содержание индивидуальных жирных кислот (ЖК) определяли методом нормализации площадей.

Проведение рентгеновских исследований. Измерения проводили на Курчатовском специализированном источнике синхротронного излучения (“КИСИ-Курчатов”). Использовали методику записи кривых дифракционного отражения на просвет. Длина волны используемого синхротронного излучения составляла 1.5 Å.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Плавучесть гидрогеля является одним из основных факторов, определяющих его положение в ФБР, результаты данного параметра представлены в табл. 1.

В ходе исследования выявлено, что гидрогель как без частиц, так и с частицами диоксида титана погружается на небольшую глубину до 0.3 см. При этом наличие наночастиц в геле концентрацией 0.25% не способствовало увеличению глубины погружения гидрогеля. Гидрогели изучали в высушенном и набухшем состоянии (рис. 1).

Рис. 1.

Микрофотографии гидрогеля в проходящем свете до и после культивирования, увеличение ×400: а – приготовленный высушенный гель, б – набухший гель до культивирования, в – гель после культивирования, г – высушенный гель после культивирования.

Продуктивность C. vulgaris при культивировании с использованием гидрогеля и адаптивного освещения была выше на 53.4% по сравнению с контролем (рис. 2).

Рис. 2.

Изменение концентрации биомассы C. vulgaris в фотобиореакторах со временем при культивировании: 1 – с гелем, 2 – без геля.

Это можно объяснить несколькими факторами: применением адаптивного освещения, позволяющего поддерживать необходимый уровень освещенности независимо от плотности культуры (рис. 3), и оптического материала (гидрогеля) с высоким альбедо, что создает еще две отражающих поверхности в толще растущей культуры, что в совокупности увеличивает освещенность (рис. 4).

Рис. 3.

Изменение выходного напряжения с датчика фотосинтетически активной радиации и управляющего напряжения на диоды при культивировании C. vulgaris в фотобиореакторе: 1 – выходное напряжение с ФАР-датчика, 2 – управляющее напряжение на диодах.

Рис. 4.

Рост культуры в фотобиореакторах.

Согласно приведенным на рис. 3 данным с ростом плотности растущей суспензии микроводорослей уменьшается проникающая способность света, что приводит к возрастанию управляющего напряжения на диодах и, соответственно, увеличению интенсивности освещения от светодиодов, расположенных в нижней камере ФБР.

Отметим, что при культивировании с гидрогелем он выступает в роли “механической мешалки”, препятствующей образованию “застойных зон” и оседанию клеток, наблюдаемых в центре и углах ФБР без геля, и способствует лучшему перемешиванию растущей культуры в ФБР.

Изменение рН было не сильным, хотя в случае с гидрогелем, защелачивание выше из-за более интенсивного роста культуры (рис. 5).

Рис. 5.

Изменение рН в фотобиореакторах со временем при культивировании: 1 – с гелем, 2 – без геля.

В составе липидов выявлены восемь ЖК (табл. 2 ). Ненасыщенные ЖК составляли более 70% как при культивировании с гидрогелем, так и в его отсутствие, причем почти 40% составляли полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК): линолевая и линоленовая. Интересен тот факт, что содержания как отдельных ЖК, так и насыщенных и ненасыщенных ЖК в обоих вариантах культивирования различаются незначительно.

В европейских стандартах на биодизель прописаны четкие ограничения на содержание ПНЖК, доля которых не должна превышать 12% для линоленовой кислоты, 1% для четырех и более двойных связей. В проведенном исследовании установлено, что содержание линоленовой кислоты в количестве ЖК в липидах биомассы C. vulgaris было на уровне 16%.

На рис. 6 виден характерный дифракционный пик при 1.4 Å^–1 для гидрогеля, состоящего из каррагинана, ПВС и наночастиц TiO₂ [5].

Рис. 6.

Дифракционная кривая сухого гидрогеля с наночастицами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Получены данные о возможности эффективного использования гидрогеля на основе каррагинана, ПВС и наночастиц диоксида титана и адаптивного освещения для увеличения продуктивности микроводоросли C. vulgaris, которая повысилась более чем на 50% по сравнению с контролем. Установлено, что содержание наночастиц диоксида титана в гидрогеле в количестве 0.25% не влияет на его плавучесть. Присутствие гидрогеля в культуральной среде при выращивании также дает положительный эффект с точки зрения создания более подходящего гидродинамического режима в фотобиореакторе. Состав ЖК биомассы, полученной при культивировании с гидрогелем, и контроля различался незначительно. С помощью специализированного источника синхротронного излучения подтверждено присутствие наночастиц диоксида титана в гидрогеле.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках соглашения № 075-15-2021-1357.