Журнал неорганической химии, 2023, T. 68, № 8, стр. 1066-1076

ВВЕДЕНИЕ

Синтез и исследование физико-химических и биологических свойств комплексов биоактивных органических лигандов с катионами различных металлов позволяют существенно расширить возможности структурного дизайна лекарственных средств [1–6].

В нормальном протекании процессов в живых организмах важную роль играют такие d-элементы, как железо, медь и цинк. Дисбаланс этих металлов запускает процессы старения, способствует развитию атеросклероза, мутагенеза, нейродегенерации, иммунологических нарушений и др. [7–12]. Механизм возникновения таких заболеваний связывают с генерацией активных форм кислорода, вызывающих окислительный стресс с участием ионов железа и меди [13, 14].

Производные 2-оксибензойной (салициловой) кислоты (H₂Sal) широко применяются в клинической практике как жаропонижающие, анальгетические и противовоспалительные средства. Они могут оказывать терапевтическое влияние на опухоли, такие как рак молочной [15], поджелудочной [16], предстательной железы, яичников [17], рак легких [18]. Известно, что комплексы цинка(II) с производными салициловой кислоты также обладают противоопухолевой активностью [19].

2-Оксифенилфосфоновые кислоты являются малоизученными фосфорильными аналогами салициловой кислоты, в которых карбоксильная группа заменена фосфоновым фрагментом (рис. 1). Такая замена приводит к появлению других физико-химических и биологических свойств этих кислот по сравнению с салициловой кислотой, что обусловливает наш интерес к изучению как свободных 2-оксифенилфосфоновых кислот, так и их комплексов с биологически активными металлами [20–23].

В настоящей работе синтезирован комплекс цинка(II) с 2-окси-5-этилфенилфосфоновой кислотой (Н₃L) состава [Zn(H₂L)₂(Н₂О)₂][Zn(HL)(Н₂О)] · H₂O (I), структура которого установлена на основании данных рентгеноструктурного и элементного анализа, квантово-химических расчетов и ИК-спектроскопии. Методом потенциометрического титрования определены константы устойчивости комплексов кислоты Н₃L с перхлоратом цинка(II) в воде. Впервые изучены цитотоксические свойства кислоты Н₃L и комплекса I на клетках HeLa (аденокарцинома шейки матки человека) с использованием МТТ-теста. Кроме того, оценка накопления комплекса I в клетках HeLa проведена методом лазерной конфокальной микроскопии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Спектры ЯМР ¹H и ³¹Р записывали на спектрометре Bruker СХР-200; стандарты – ТМС (внутренний) и 85% Н₃РО₄ (внешний). Температуры плавления измеряли на приборе Boetius PHMK 05. Анализ содержания С и Н проводили на С,Н,N-анализаторе Carlo Erba (Strumentazione, Italy). Содержание фосфора и цинка определяли методом атомной эмиссии с индуктивно связанной плазмой на приборе iCAP-6500 Duo (Thermo Scientific, США). ИК-спектры регистрировали на спектрометре Bruker Vertex 70 в диапазоне 4000–400 см^–1 (суспензия в вазелиновом масле) и методом НПВО на спектрометре Nexsus, Nicolete.

2-Оксифенил-5-этилфосфоновую кислоту синтезировали согласно [20]. Температура плавления и результаты элементного анализа и спектров ЯМР соответствовали литературным данным. Для изучения комплексообразования использовали гексагидрат перхлората цинка(II) марки “х. ч.”.

Комплекс [Zn(H₂L)₂(Н₂О)₂][Zn(HL)(Н₂О)] · H₂O (I) был получен в виде бесцветного кристаллического осадка при смешивании водных растворов Н₃L (0.3 г, 1.5 ммоль) и Zn(ClO₄)₂ · 6H₂O (0.3 г, 0.7 ммоль). Комплекс достаточно хорошо растворим в воде, поэтому для его полного осаждения реакционную смесь выдерживали не менее 12 ч при температуре +6°С, а затем фильтровали и промывали ледяной водой. Выход составил 0.5 г (88%).

Константы устойчивости комплексов 2-окси-5-этилфенилфосфоновой кислоты (H₃L) с перхлоратом цинка(II) определяли методом потенциометрического титрования с использованием потенциометра OP-300 (Radelkis) по методике [24].

Растворы кислоты H₃L и соли Zn(ClO₄)₂ · 6H₂O с начальным объемом 160 мл титровали стандартным 0.1 М раствором NaOH при температуре 298 ± 0.1 K и ионной силе I = 0.1 M KCl. Выполнено четыре титрования в интервале pH от 2.6 до 11.3, которые включали от 51 до 61 точки. Исходные аналитические концентрации кислоты и соли варьировали в интервалах 0.29–1.05 и 0.60–2.26 мМ соответственно (табл. 1). При титровании отношение начальных концентраций реагентов $c_{{\text{L}}}^{{\text{0}}}{\text{/}}c_{{{\text{Zn}}}}^{{\text{0}}}$ варьировалось от 1.5 до 2.2. В четвертом титровании в интервале pH 6.5–9.5 наблюдали образование осадка. Поэтому данные этого титрования в указанной области в расчетах констант комплексообразования не использовали.

Константы устойчивости комплексов 2-окси-5-этилфенилфосфоновой кислоты (H₃L) с перхлоратом цинка(II) рассчитывали с использованием программы CHEMEQUI [25, 26], предназначенной для моделирования равновесий в растворах. В нашем случае потенциометрического титрования неизвестные константы устойчивости комплексов ${{\beta }_{1}},~{{\beta }_{2}} \ldots $ были искомыми и оптимизируемыми параметрами для минимизации квадратов остатков программой CHEMEQUI:

где n – число экспериментальных точек титрования, ${\text{p}}{{{\text{H}}}_{{exp}}}{\text{\;и\;}}~{\text{pH}}$ – экспериментальное и расчетное значения pH при заданной начальной концентрации реагентов. В программе водородный показатель pH является функцией равновесной концентрации катиона водорода: где a – возможная систематическая погрешность, b – коэффициент пропорциональности. Равновесная концентрация j-го комплекса ${{C}_{j}}$ как функция его константы устойчивости ${{{{\beta }}}_{j}}$ выражается в форме уравнения Бринкли [27]: где ${{{{\beta }}}_{j}}$ – общая константа устойчивости j-го комплекса, образующегося из m реагентов, ${{\nu }_{{jk}}}$ – стехиометрический коэффициент для данной равновесной реакции. Кроме того, в программе используются уравнения материального баланса: где ${{\nu }_{{ki}}}$ – стехиометрический коэффициент k-го реагента в реакции образования i-го вещества, $C_{k}^{0}$ – начальная концентрация $k$-го реагента, s – число всех реагентов и комплексов. Уравнения (3) и (4) используются для последующего расчета [H⁺] и ${\text{pH}}$. Программа CHEMEQUI включает четыре независимых алгоритма: градиентный метод программы EQ, симплекс-алгоритм Нелдера и Мида, метод стохастического поиска и генетический алгоритм [25, 26]. Алгоритмы программы и ее применение для оценки констант устойчивости комплексов в растворах методами калориметрии, потенциометрии, спектрофотометрии (ИК, УФ, UV-vis), ЯМР-спектроскопии и кондуктометрии изложены в обзоре [25]. CHEMEQUI находится в свободном доступе на сервере [26].

Цинк(II) образует в воде устойчивые гидроксиды [28], поэтому оценка констант комплексообразования Zn²⁺ с кислотой H₃L была выполнена как с учетом реакций гидролиза цинка(II), так и без их учета. В расчетах использовали известные константы lg β_n для равновесий Zn²⁺ + nH₂O = = Zn²⁺(OH^–)_n + nH⁺ (n = 1, 2), составляющие в воде при 298 K и ионной силе I = 0.1 M (NaNO₃) соответственно –7.89 и –14.92 [28]. Для расчета констант комплексообразования Zn²⁺ c протонированными формами лиганда H_nL^(3–n)– (n = 0, 1, 2) ранее были определены константы протонирования кислоты из данных ее титрования раствором NaOH, которые составили 11.58, 17.94 и 21.14 соответственно для равновесий L^3– + nH⁺ = H_nL^(3–n)– (n = 1, 2, 3) при 298 K и ионной силе I = 0.1 M (KCl) [21]. Независимое определение констант протонирования кислоты позволяет более надежно определить константы комплексообразования кислоты с катионом металла [29].

Нами было проанализировано девять моделей равновесий в растворе с образованием от одной до четырех химических форм: 1) ZnL; 2) ZnL, ZnOH, Zn(OH)₂; 3) ZnL, ZnL(OH); 4) ZnL, ZnL(OH), ZnL(OH)₂; 5) ZnL, ZnL(OH), ZnOH, Zn(OH)₂; 6) ZnL, ZnL₂; 7) ZnL, ZnL₂, ZnL₂(OH); 8) ZnL, ZnL₂, ZnL(OH), ZnL₂(OH); 9) ZnL, ZnL₂, ZnHL, ZnL₂(OH). Здесь для простоты заряды частиц, образованных ионами Zn²⁺, L^3–, H⁺ и OH^–, не указаны. В качестве критериев выбора модели равновесных реакций, вполне соответствующей эксперименту, использовали R-фактор Гамильтона ($HRF$) и коэффициент детерминации ($R_{{det}}^{2}$):

где $\left\langle {{\text{p}}{{{\text{H}}}_{{exp}}}} \right\rangle ~ = \frac{1}{n}\sum\nolimits_{i = 1}^n {{\text{p}}{{{\text{H}}}_{{exp,i}}}} $, n – число экспериментально измеренных значений pH, ${\text{p}}{{{\text{H}}}_{{exp,i}}}{\text{\;и\;p}}{{{\text{H}}}_{i}}$ – экспериментальное и соответствующее рассчитанное по модели равновесий значение pH для данных начальных концентраций реагентов. Модель равновесия с образованием в растворе комплексов ZnL^– и ZnL(OH)^2– наилучшим образом согласуется с экспериментальными данными. В этой модели учитывались следующие равновесные реакции: L^3– + nH⁺ = H_nL^(3–n)– (n = 1, 2, 3); H₂O = H⁺ + OH^–; Zn²⁺ + L^3– = ZnL^–; Zn²⁺ + L^3– + + OH^– = ZnL(OH)^2–. Для 12 оценок констант комплексов с использованием трех титрований и четырех расчетных алгоритмов программы CHEMEQUI фактор $HRF$ изменялся в интервале от 1.668 до 1.843%, а коэффициент $R_{{det}}^{2}$ – от 0.9972 до 0.9979. Средние величины констант комплексообразования lgβ были определены из их m = 12 оценок${\text{lg}}$ с учетом весовых вкладов ${\text{\;l}}{{{\text{g}}}^{i}}$, характеризующих степень согласия с экспериментальными данными:

Экспериментальные данные РСА для соединения I получены на дифрактометре Bruker AXS D8 Venture Photon III C14 IuS 3.0 (λ(MoK_α), графитовый монохроматор) [30] (табл. 2). Поглощение учтено полуэмпирическим методом по эквивалентам (программа SADABS) [31]. Структура определена комбинацией прямого метода и Фурье-синтезов. Атомы водорода рассчитаны из геометрических соображений. Структуры уточнены полноматричным анизотропно-изотропным МНК. Все расчеты выполнены по программам SHELXS и SHELXL [32]. “Монокристаллы” I растут в виде тонких сросшихся пластин (как в слюде), разделить которые невозможно. Было проверено более 20 кристаллов, все они оказались сростками, но часть рефлексов для всех образцов индицировали в одной и той же ячейке. Лучший из кристаллов, с которого были получены экспериментальные данные, все равно был образован не менее чем восемью доменами (программа CellNow [33]). Для интегрирования был выбран наибольший домен (~35% индицированных при соотношении сигнал/фон ≥ 8 рефлексов), в процессе интегрирования матрицу ориентации фиксировали. Уточнение проводили с учетом центросимметричного двойникования, 37% рассеивающей мощности “кристалла” разупорядочено. Низкое качество эксперимента позволило перевести в анизотропию лишь атомы Zn и упорядоченные атомы P, что привело к ошибке типа A в checkcif (39 неводородных атомов уточняли в изотропном приближении). Две ошибки типа B (высокий wR₂ и низкая точность в связях C–C) обусловлены строением образца.

Структурные данные и результаты уточнения для соединения I депонированы в Кембриджском банке структурных данных (CCDC № 2244640); deposit@ccdc.cam.ac.uk или http://www.ccdc.cam.ac.uk).

Эксперименты по определению цитотоксичности кислоты H₃L и комплекса I проводили на клетках HeLa (аденокарцинома шейки матки человека), полученных из коллекции клеточных культур позвоночных (Санкт-Петербург, Россия). Клетки HeLa были выращены в среде Игла МЕМ (ПанЭко, Россия), содержащей 10% эмбриональной сыворотки (HyClone, США), пенициллин (50 ед/мл), стрептомицин (50 мг/мл), в атмосфере 5% CO₂ при температуре 37°С. Клетки рассевали в 96-луночные планшеты в концентрации 5 × 10⁴ клеток/мл. Через 24 ч тестируемые соединения, предварительно растворенные в диметилсульфоксиде (ДМСО), вносили в культуральную среду. Клетки инкубировали при 37°С в увлажненной атмосфере воздуха и 5% CO₂ в течение 48 ч. Затем в инкубационную среду вносили 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (MTT, Sigma-Aldrich) в концентрации 0.5 мг/мл. Окрашивание клеток проводили при 37°С в увлажненной атмосфере воздуха и 5% CO₂ в течение 2 ч. Далее инкубационную среду отбирали и кристаллы образованного МТТ-формазана растворяли в 100%-ном ДМСО. Интенсивность окраски определяли при длине волны 536 нм с помощью планшетного ридера Cytation 3 (BioTek, США). За 100% принимали интенсивность окраски контрольных клеток, не обработанных тестируемым соединением. Статистический анализ, построение графиков и определение концентрации, вызывающей 50%-ное ингибирование роста популяции клеток (IC₅₀), определяли на основе дозозависимых кривых с помощью программного обеспечения OriginPro 8.

Изучение клеточной аккумуляции комплекса I проводили на клетках HeLa. Клетки, выращенные на покровных стеклах размером 24 × 24 мм при плотности клеточной культуры 15 × 10⁴/2 мл в шестилуночных планшетах, инкубировали в течение 24 ч с растворенным в ДМСО комплексом I, конечная концентрация которого в инкубационной среде составляла 100 мкM. В качестве контроля использовали клетки без обработки комплексом. Далее клетки отмывали от остатков среды раствором PBS_x1 (фосфатно-солевой буфер) и фиксировали раствором 4%-ного параформальдегида в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем проводили пермеабилизацию в 0.5%-ном растворе Triton X-100 в PBS_x1 в течение 10 мин при комнатной температуре. Далее образцы после промывания в деионизованной воде сушили при комнатной температуре в темноте. Заклеивали стекла по периметру лаком. Изучение накопления комплекса I в клетках проводили с помощью лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 880 (Carl Zeiss, Германия). Изображения получали в инвертированном конфокальном режиме с использованием объектива C Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil DIC M27. Для возбуждения флуоресценции комплекса I использовали лазерное облучение с длиной волны 405 нм, сигнал детектировали в диапазоне длин волн 415–536 нм. Все полученные треки были сохранены в формате czi-ном. Полученные изображения были обработаны с помощью программы для анализа изображений ImageJ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее нами был синтезирован комплекс [Cu(H₂L)₂(Н₂О)₂], состав и строение которого установлены на основании данных РСА, элементного анализа и ИК-спектроскопии [21]. В настоящей работе получен комплекс [Zn(H₂L)₂(Н₂О)₂][Zn(HL)(Н₂О)] · H₂O (I), который, в отличие от светло-голубых кристаллов комплекса меди, представляет собой прозрачные слоистые кристаллы.

Структура I образована комплексами [Zn(H₂L)₂(Н₂О)₂] (рис. 2а, рис. S1 ), 1D-цепочками [Zn(HL)(Н₂О)] (рис. 2б, рис. S1 ) и кристаллизационными молекулами H₂O. В октаэдрическом комплексе [Zn(H₂L)₂(Н₂О)₂] атомы O молекул H₂O находятся в цис-позиции друг к другу, аналогично расположены и атомы O оксифенильных фрагментов, в то время как фосфоновые атомы O – в транс-позиции друг к другу. В аналогичных комплексах меди(II) с H₃L [21], 2-оксифенилфосфоновой [23] и 2-окси-5-метоксифенилфосфоновой кислотой [22] атомы O молекул H₂O и атомы O оксифенильных фрагментов находятся в транс-позиции; комплексы центросимметричны. В 1D-цепочке [Zn(HL)(Н₂О)] мостиковые атомы O оксифенильного фрагмента, молекулы H₂O и фосфонового фрагмента объединяют соседние атомы Zn. Следует отметить, что цепочка разупорядочена по двум позициям (рис. 3) в соотношении 0.54 : 0.46, а координированные молекулы H₂O в каждой цепочке разупорядочены по двум позициям с заселенностями O(15), O(16), O(15B) и O(16B) 0.27, 0.27, 0.26 и 0.20 соответственно. Низкое качество экспериментальных данных позволяет обсуждать лишь топологию структурных единиц.

Отнесение колебательных частот донорных групп в ИК-спектре лиганда Н₃L, позволяющих судить о его координации, а также комплекса меди [Cu(H₂L)₂(H₂O)₂] приведено в работе [21]. При сохранении общего характера ИК-спектр комплекса I несколько отличается от ИК-спектров Н₃L и [Cu(H₂L)₂(H₂O)₂]. Основные отличия в ИК-спектрах комплексов наблюдаются в интервале частот 1285–1070 см^–1, где лежат полосы ν(Ph–O), τ(CH₂), ν(P=O) и δ_Ph. В спектре комплекса цинка в этом спектральном диапазоне присутствуют: полоса средней интенсивности около 1271 см^–1, более интенсивная полоса около 1235 см^–1, менее интенсивная полоса при 1215 см^–1 и очень интенсивная широкая полоса с максимумами при 1139, 1103, 1074 см^–1. В спектре [Cu(H₂L)₂(H₂O)₂] в этом спектральном диапазоне наблюдаются две хорошо разрешенные полосы: дублетная полоса средней интенсивности при 1249, 1225 см^–1 и интенсивная дублетная полоса при 1115, 1086 см^–1. В диапазоне 900–420 см^–1 в основном меняется соотношение интенсивности полос.

Что касается фосфорильной группы, то к ν(P=O) в спектре комплекса I можно отнести узкую полосу выше средней интенсивности при 1235 см^–1. Это несколько выше, чем положение полосы ν(P=O) в спектре свободной Н₃L (1230 см^–1), и свидетельствует о присутствии не участвующего в координации с катионом цинка фосфорильного атома кислорода. В спектре комплекса меди, в котором фосфорильный кислород молекулы Н₃L также не участвует в координации с катионом меди, частота ν(P=O) незначительно (~6 см^–1) понижается. Полоса при 1271 см^–1 может быть связана с ν(Ph–O) фенольной группы. Интенсивные полосы при 1024 и 937 см^–1 в спектре I обусловлены колебаниями δ(POH) и ν(PO) фосфонового фрагмента (1017 и 943 см^–1 в ИК-спектре [Cu(H₂L)₂(H₂O)₂]).

В диапазоне частот 4000–2000 см^–1 в ИК спектре I на фоне широкой интенсивной полосы с максимумом при ⁓3000 см^–1 фиксируются полосы валентных колебаний молекул воды ν(H₂O), входящих в состав комплекса, а также ν(С‒Н), ν(OH)_Ph и ν(ОН)_Р. Новую по сравнению со спектром Н₃L полосу около 3381 см^–1 в ИК-спектре комплекса цинка можно отнести к валентным колебаниям координированных молекул воды (3314 см^–1 в спектре медного комплекса). Деформационным колебаниям δ(H₂O) соответствует полоса ниже средней интенсивности при 1672 см^–1 (широкая полоса при ~1695 см^–1 в спектре комплекса меди). Полоса около 3148 см^–1 может быть обусловлена ν(OH)_Ph (3201 см^–1 в комплексе меди). Валентные колебания OH-групп фосфонового фрагмента ν(OH)_P имеют малую интенсивность (2570 и 2274 см^–1 в спектре [Cu(H₂L)₂(H₂O)₂]).

Принимая во внимание общий характер спектров комплексов цинка и меди c Н₃L, можно сказать, что при одинаковом способе координации Н₃L эти комплексы изоструктурными не являются, что согласуется с данными РСА.

Геометрия комплекса цинка(II) с H₃L также была определена по результатам DFT-расчетов с использованием программы Gaussian 06 (функционал B3LYP с базовым набором 6-31+G(d,p)). Согласно расчетам, координационное окружение атома цинка в изолированной части комплекса [Zn(H₂L)₂(Н₂О)₂] в целом идентично окружению, определенному методом РСА (рис. 4). Различия в геометрии связаны, по-видимому, с тем, что расчеты проводили в газовой фазе, а в РСА использовали кристаллический образец. В изолированной части комплекса [Zn(H₂L)₂(H₂O)₂] длины связей Zn–ОРРh составляют 1.922–1.925 Å, Zn–ОРh – 2.229–2.307 Å, а Zn–OН₂ – 2.247–2.266 Å.

Константы устойчивости комплексов цинка(II) с 2-окси-5-этилфенилфосфоновой кислотой H₃L (рис. 5, табл. 3) в воде при 298 K и ионной силе 0.1 М KCl определены методом потенциометрического титрования с использованием четырех расчетных алгоритмов программы CHEMEQUI (см. Экспериментальную часть), предназначенной для определения констант устойчивости из экспериментальных данных различных физико-химических методов [25, 26]. В расчетах использовали известные константы протонирования lg β_m кислоты H₃L в воде при 298 K и ионной силе 0.1 М: 11.58, 17.94 и 21.14 соответственно для равновесий L^3– + mH⁺ = H_mL^(3–m)– (m = 1, 2 и 3) [21].

Ион Zn²⁺ с L^3– образует в воде простой комплекс ZnL^–, который в щелочной среде с ростом pH до 10 практически полностью превращается в комплекс ZnL(OH)^2–. Максимум связывания 33% иона Zn²⁺ в комплекс ZnL^– приходится на pH 8.2 при концентрации реагентов Zn²⁺ и H₃L около 0.3 и 0.7 мМ соответственно (рис. 5). Кислота H₃L значительно слабее связывает цинк(II) в комплекс ZnL^– (lg K_ZnL = 6.63, табл. 3), чем медь(II) в комплекс CuL^– (lg K_CuL = 8.91 [21]). Тем не менее константа устойчивости комплекса ZnL^– в случае 2-окси-5-этилфенилфосфоновой кислоты не является низкой: только для половины из 568 комплексов состава ZnLig самых различных органических лигандов характерны константы устойчивости >5.0 в воде в стандартных условиях при 298 K и ионной силе 0.1 М [34]. В работе [35] показано, что константы устойчивости ионов металлов M_i и M_j с органическим лигандом в воде в стандартных условиях связаны простой зависимостью: lg K_j = = (r_i/r_j) · lg K_i, где r_i и r_j – термодинамические радиусы ионов M_i и M_j. Поскольку r_Cu = 0.826 и r_Zn = 1.138 [35], исходя из значения lg K_CuL = 8.91 для комплекса CuL^– приведенное уравнение дает для комплекса ZnL^– величину lg K_ZnL = 6.47, хорошо согласующуюся с экспериментальным значением 6.63 ± 0.13 (табл. 3). Ступенчатая константа присоединения иона OH^– к комплексу ZnL^– lg K(ZnL^– + OH^–) = 6.06 существенно выше, чем аналогичная константа lg K(CuL^– + OH^–) = 4.48 [21] для меди(II). Этот факт косвенно свидетельствует о том, что координационная сфера цинка(II) заполняется донорными центрами кислоты в значительно меньшей степени, чем в случае меди(II).

Наши недавние исследования in vivo показали, что 2-окси-5-этилфенилфосфоновая кислота (H₃L) обладает высокой анальгетической активностью и представляет интерес в качестве нестероидного противовоспалительного препарата, являясь при этом малотоксичным соединением (LD₅₀ = 2000 мг/кг) [20, 21]. Ее комплекс [Cu(H₂L)₂(Н₂О)₂] при такой же малой токсичности проявляет анальгетический эффект значительно выше эффекта свободной кислоты и препарата сравнения – анальгина [21]. Кроме того, вскрытие лабораторных животных не показало ульцерогенного воздействия H₃L и ее комплекса [Cu(H₂L)₂(Н₂О)₂] в дозах, соответствующих ЕД₅₀, на желудочно-кишечный тракт, в отличие от салициловой кислоты.

Известно, что всемирная организация здравоохранения и международное медико-биологическое общество рекомендуют использовать альтернативные методы и модели, такие как, например, применение перевиваемых клеточных культур взамен общепринятых тестов на лабораторных животных [36]. Это связано с вопросами этического и экономического использования лабораторных животных, а также с тем, что эксперименты с использованием животных трудоемки, длительны и не всегда воспроизводимы, поэтому дальнейшее изучение биологических свойств производных 2-оксифенилфосфоновой кислоты проводили на клетках аденокарциномы шейки матки человека HeLa. В работе изучены цитотоксические свойства кислоты H₃L и комплекса I в отношении клеток HeLa (рис. 6). Установлено, что H₃L является малотоксичным соединением: в концентрации до 150 мкмоль/л она не оказывает существенного влияния на выживаемость клеток HeLa, что согласуется с результатами исследования острой токсичности этой кислоты, полученными на лабораторных животных [20, 21].

Показано, что кислота H₃L и комплекс I обладают схожей цитотоксической активностью при малых концентрациях. Однако, в отличие от цитотоксического действия кислоты H₃L, влияние комплекса I на клетки HeLa значительно снижало их жизнеспособность при концентрациях >150 мкмоль/л. Данный результат подтверждается вычисленными значениями количественного критерия цитотоксической активности IC₅₀ (концентрация исследуемого соединения, вызывающая 50%-ное ингибирование роста клеточной популяции). Для комплекса I доза IC₅₀ составила 205.4 ± 5.9 мкмоль/л, для кислоты H₃L доза IC₅₀ не определена, так как находится выше пределов ее растворимости (>300 мкмоль/л).

Результаты исследования внутриклеточного проникновения комплекса I на клеточной линии HeLa показаны на рис. 7. Инкубацию клеток с комплексом проводили в течение 24 ч, добавляя в питательную среду растворенный в ДМСО комплекс I с конечной концентрацией 100 мкмоль/л. Проведение этого исследования стало возможным благодаря спектральным характеристикам комплекса: в спектре флуоресценции (λ_ex = 288 нм) раствора комплекса I в ДМСО присутствуют полосы при 364 и 700 нм. По данным флуоресцентной микроскопии (лазерная линия с длиной волны 405 нм) можно сделать вывод, что исследуемый комплекс проникает через клеточную мембрану клеток HeLa (рис. 7, панель 2), в то время как в контрольных образцах (рис. 7, панель 1) при возбуждении лазерной линией при 310–460 нм флуоресценция отсутствует.

Накопление соединений биомедицинского назначения в живых клетках может происходить различными путями и приводить к изменению физиологии и биохимии клеток, вследствие чего могут наблюдаться такие явления, как нарушение окислительно-восстановительного баланса клетки, образование активных форм кислорода, апоптоз. В работе на данном этапе не представилось возможности определить количество и внутриклеточную локализацию комплекса I. Однако понимание механизмов биоаккумуляции данного комплекса важно для изучения его регуляции на клеточном уровне.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Определено строение комплекса цинка(II) с 2-окси-5-этилфенилфосфоновой кислотой (H₃L), которое существенным образом отличается от строения комплексов меди(II) c производными 2-оксифенилфосфоновой кислоты [21–23]. Методом потенциометрического титрования впервые определены константы устойчивости комплексов H₃L с перхлоратом цинка в воде. Ион Zn²⁺ с L^3– образует простой комплекс ZnL^– и комплекс ZnL(OH)^2–, в то время как для Cu²⁺ обнаружено существование комплексов CuL^–, ${\text{lg}}{\kern 1pt} \beta ~\,\, = ~\,\,\frac{{\sum\limits_{i = 1}^m {\frac{1}{{HR{{F}_{i}}}}{\text{\;lg}}{\kern 1pt} {{\beta }^{i}}} }}{{\sum\limits_{i = 1}^m {\frac{1}{{HR{{F}_{i}}}}} }}.$, [Cu(OH)L]^2– и [Cu(OH)L₂]^5– как для H₃L, так и для ее аналогов [21–23].

Установлено, что кислота H₃L является малотоксичным соединением in vitro, что согласуется с результатами исследования острой токсичности in vivo [20, 21]. Низкая токсичность комплекса цинка и его способность к биоаккумуляции являются важным критерием для дальнейшего изучения его биологической активности.