Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 2, стр. 166-171

МЕТОДИКА

Растительный материал. В качестве объекта исследований использовали 9-суточные проростки гороха (Pisum sativum L., сорт Амброзия), выращенные гидропонным методом при 25°С. Эти проростки был погружены в воду на 2–3 см выше корневой шейки для имитации условий дефицита кислорода. Через 48 ч растения были использованы для исследований [7].

Фермент экстрагировали из гомогенизированных листьев растений. Экстракт подвергали гель-фильтрации на колонке (1.5 × 20 см) с сефадексом G-25 (“Pharmacia”, Швеция), а затем ионообменной хроматографии на колонке (1.5 × 15 см) с ДЭАЭ-целлюлозой (“GE Healthcare”, Швеция) и целевой белок гель-хроматографировали на колонке (2.0 × 30 см) с сефадексом G-200 (“GE Healthcare”, Швеция) по методике, описанной в работе [3].

Активность фермента измеряли на спектрофотометре (“ЛОМО СФ-56”, Россия) по скорости окисления НАДН при 340 нм. Реакционная среда содержала 2 мл 50 мМ трис-HCl-буфера, рН 7.4, 0.06 мМ НАДН и 1 мМ пирувата натрия. Реакцию запускали добавлением пирувата натрия [8]. Активность ЛДГ в прямой реакции измеряли в 50 мМ трис-HCl-буфере, рН 7.4, содержавшем 0.5 мМ НАД⁺ и 25 мМ лактата натрия. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, которое в течение 1 мин при 25°C образовывало (прямая реакция) или превращало (обратная реакция) 1 мкмоль НАДН.

Молекулярную массу белка определяли методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-200, для калибровки которого был использован Dextran blue (2000 кДа). Для расчета использовали формулу

Молекулярную массу субъединиц оценивали методом электрофореза в 12%-ном ПААГ в присутствии ДДС-Na. В качестве белков-маркеров молекулярной массы использовали набор стандартных белков (кДа): b-галактозидаза (116.0), БСА (66.2), овальбумин (45.0), ЛДГ (35.0), REase Bspl98 (25.0), b-лактоглобулин (18.4) и лизоцим (14.4). Гели окрашивали нитратом серебра по методике [9].

Электрофорез ЛДГ проводили в 8%-ном ПААГ по методу Девиса в не денатурирующих условиях [10]. Для окрашивания гелей применяли нитрат серебра [9], для специфического определения фермента – тетразолиевый метод [11]. Определение белка проводили по методу Лоури.

Влияние рН на скорость ферментативной реакции изучали в 50 мМ трис-HCl-буфере, рН 5.0–10.0 [5].

Кинетические константы прямой и обратной реакций, катализируемых ЛДГ из листьев гороха, были определены методом Лайнуивера–Берка. Каталитические константы K_м, V_max и Е_акт для субстратов пируват и L-лактат определяли в стандартной реакционной смеси при рН 7.5 и 25°С. Концентрацию субстратов варьировали от 0 до 60.0 мМ, а концентрации других компонентов поддерживали постоянными [1].

Влияние температуры на скорость ферментативных реакций ЛДГ изучали в диапазоне температур реакционной смеси от 15 до 60°С.

Эксперименты проводили в 4–6 биологических повторностях, а аналитические определения – в трех. В табл. и на рис. приводятся результаты типичных опытов, каждое значение которых является средним арифметическим трех определений. Для расчета их достоверности использовали метод вариационной статистики с помощью критерия Стьюдента. Обсуждаются статистически достоверные различия при р ≤ 0.05 [12]. Для построения графиков использовали данные, обработанные с помощью программ линейной и параболической аппроксимации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Было установлено, что в листьях гороха, корни которого инкубированы в условиях недостатка кислорода, индуцировалась лактатдегидрогеназная активность. Максимальная активность ЛДГ была обнаружена после 2 сут их инкубирования (рис. 1), при этом уровень активности фермента увеличивался в 10–11 раз по сравнению с контрольными растениями. Для получения ЛДГ в высокоочищенном состоянии использовали листья гороха, инкубированные в условиях дефицита кислорода в течение 2 сут. Результаты очистки ЛДГ из листьев гороха приведены в табл. 1.

Рис. 1.

Динамика изменения активности ЛДГ в листьях гороха в контроле (1) и в растениях после кислородного голодания (2).

В результате многостадийной очистки был получен электрофоретически гомогенный фермент с высокой удельной активностью (41.9 Е/мг белка) и выходом (26.8%). При ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлоза максимальное количество лактатдегидрогеназной активности было десорбировано с носителя при элюции 350–500 мМ NaCl. При электрофорезе в ПААГ был обнаружен один белковый компонент с Rf – 0.38, который окрашивался нитратом серебра (рис. 2). Этот компонент взаимодействовал с тетразолиевым синим, используемым для специфического определения активности ЛДГ (рис. 2). Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о том, что очищенный белок ЛДГ был электрофоретически гомогенен и обладал лактатдегидрогеназной активностью.

Рис. 2.

Электофорез в ПААГ очищенной лактатдегидрогеназы при pH 7.5. Гели окрашены нитратом серебра (1) и специфическим тетразолиевым синим (2); F – фронт (бромфеноловый синий).

Сравнение значений молекулярных масс нативной ЛДГ, полученной гель-хроматографией на сефадексе G-200, и фрагментов ЛДГ, определенных методом электрофореза в присутствии ДДС-Na, (рис. 3) позволило предположить, что молекула фермента обладала четвертичной структурой. Поскольку молекулярная масса его нативной молекулы составляла 148 кДа, а молекулярная масса одной субъединицы 37.1 кДа, то можно было допустить, что молекула ЛДГ из гороха представляла собой тетрамер.

Рис. 3.

Электрофорез в ПААГ в присутствии ДДС-Na очищенной лактадегидрогеназы (8). Белки-маркеры молекулярной массы (кДа): 1 – b-галактозидаза (116.0); 2 – БСА (66.2); 3 – овальбумин (45.0); 4 – ЛДГ (35.0); 5 – REase Bspl98 (25.0); 6 – β-лактоглобулин (18.4); 7 – лизоцим (14.4).

Были установлены каталитические характеристики очищенного фермента. Значение константы Михаэлиса по пирувату составило 15 мкМ, что свидетельствовало о его высоком сродстве к субстрату (рис. 4). Низкая величина K_м ЛДГ при использовании пирувата могла свидетельствовать о высокой скорости окисления гликолитического НАДН [13].

Рис. 4.

Определение значений К_м ЛДГ из листьев гороха после кислородного голодания в течение 48 ч для пирувата (а), НАДН (б), лактата (в) и НАД⁺ (г).

Известно что, величина K_м ЛДГ из томата при использовании в качестве субстрата пирувата составляет 200 мкМ [14], а фермента, экстрагированного из мышц кролика – 48 мкМ [15]. Величина K_м при взаимодействии ЛДГ из листьев гороха с НАДН составила 71 мкМ (рис. 4), что свидетельствовало о ее достаточно высоком сродстве к данному коферменту. При этом показано, что значение этой константы колеблется от 8 до 77 мкМ для ЛДГ из мышц кроликов и из картофеля соответственно [5, 15, 16].

Для субстратов обратной реакции значения K_м выделенной ЛДГ оказались значительно выше, показывая меньшее сродство фермента к лактату и НАД⁺. Так, значение K_м по лактату составило 600 мкМ, а по НАД⁺ – 1.17 мМ (рис. 4). Аналогичные результаты изменения сродства ЛДГ к субстратам обратной реакции были получены и для ферментов из других источников. Так, значения K_м по лактату для ЛДГ из мышц кролика и картофеля составили 553–853 мкМ [15] и 11 мМ [5] соответственно, а для НАД⁺ – от 0.2 мМ для фермента из картофеля до 3.2 мМ ‒ из печени крыс [5, 16].

О возможном сдвиге реакции, катализируемой очищенной ЛДГ из листьев гороха в сторону утилизации лактата, свидетельствовало низкое значение константы ингибирования субстратом – 1.15 мМ (рис. 5).

Рис. 5.

Определение значения константы ингибирования для ЛДГ из листьев гороха после кислородного голодания в течение 48 ч

Была изучена термостабильность выделенной ЛДГ в интервале от 15 до 60°C. Температурный оптимум действия фермента при восстановлении пирувата составил 40°С, а при окислении лактата – 45°С (рис. 6). Это согласовывалось с температурными оптимумами ЛДГ из разных организмов, которые, как правило, находятся в пределах 30–60°С [6, 17]. Однако было установлено, что ЛДГ из растений (томат и картофель) обладают максимальной активностью около 40°С [6, 18].

Рис. 6.

Влияние температуры на скорость реакций восстановления пирувата (1) и окислении лактата (2), катализируемых ЛДГ из листьев гороха.

На основе полученных данных были построены графики Аррениуса для реакций восстановления пирувата и окисления лактата (рис. 7), позволившие рассчитать значения энергии активации (Е_акт) для переходного состояния фермент-субстратного комплекса. Графики Аррениуса для ЛДГ из листьев гороха описывались прямыми линиями, что свидетельствовало о том, что молекула фермента обладала одним конформационным состоянием [19]. Вычисленные значения энергии активации выделенной ЛДГ составили для прямой и обратной реакций 4.7 и 5.3 кДж/моль соответственно. Следует отметить, что эти значения варьируют у ферментов, выделенных из различных организмов. Так, у растений ячменя ЛДГ характеризуется энергией активации, равной 11 кДж/моль [5], у креветки и трески 44.8 [16] и 55 кДж/моль [20] соответственно.

Рис. 7.

График Аррениуса для ЛДГ из листьев гороха при восстановлении пирувата (а) и при окислении лактата (б).

Изучение влияния концентрации ионов водорода на активность выделенной ЛДГ показало, что оптимальное значение рН для протекания прямой реакции составляло 7.5 и для обратной – 8.8 (рис. 8). По данным работ [21, 22] при рН 7.0 равновесие реакции смещено в сторону образования лактата, а в щелочной среде in vivo реакция осуществляется в обратном направлении. По мере изменения рН ионизация групп, как активного центра фермента, так и субстрата может изменяться, что влияет на скорость связывания субстрата с активным центром. ЛДГ у большинства организмов проявляет максимальную активность при значениях рН, близких к нейтральным [15, 23, 24].

Рис. 8.

Зависимость скорости реакции от pH среды для ЛДГ из листьев гороха при восстановлении пирувата (1) и при окислении лактата (2).

При использовании гомогенного препарата ЛДГ важное значение приобретает разработка способа сохранения его активности. Было установлено, что очищенная ЛДГ полностью сохраняла стабильность при хранении в морозильной камере при –74°С в течение 6 мес.

Таким образом, с помощью многостадийной очистки из листьев гороха, корни которого инкубировались в условиях недостатка кислорода, была получена электрофоретически гомогенная ЛДГ. Были изучены физико-химические и каталитические свойства фермента. Установлено, что его молекула представляла собой гомотетрамер, состоящий из четырех одинаковых субъединиц. Показано, что ЛДГ из листьев гороха обладала более высоким сродством к пирувату, по сравнению с лактатом, что позволяло ей активно участвовать в реокислении гликолитического НАДН. Оптимальная для работы выделенного фермента температура составляла 40°С для прямой и 45°С для обратной реакции. Обнаружено, что оптимальное значение рН для катализа восстановления пирувата – 7.5, и окисления лактата – 8.8 [1, 16]. Полученные данные открывают перспективы для изучения роли ЛДГ (совместно с гликолатоксидазой, подобной L-лактат-цитохром с-оксидоредуктазе дрожжей) в адаптивной реакции клеточного метаболизма к гипоксическим условиям, возникающим в корне при затоплении [1].

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований (№ 17-04-01039).