Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 2, стр. 144-150

МЕТОДИКА

Объектом исследований служил природный бактериальный штамм 36DCP, выделенный из образца почвы, загрязненной отходами химического производства (Уфа, Россия).

Накопительные и чистые культуры получали с использованием минимальной солевой среды М9 [13], следующего состава (г/л): Na₂HPO₄ – 6.0; KH₂PO₄ – 3.0; NaCl – 0.5; NH₄Cl – 1.0, содержащей в качестве единственного источника углерода 4-ХФУК (100 мг/л). После автоклавирования в среду добавляли стерильные растворы CaCl₂ и MgSO₄ до конечных концентраций 1.0 и 2.0 мM соответственно.

Культивирование проводили в конических колбах (250 мл) при температуре 28°С в термостатируемой установке УВМТ-12-250 (“Элион”, Россия) при 120 об./мин. Интенсивность роста культуры оценивали по оптической плотности (OП₅₉₀) клеточной суспензии с использованием фотоколориметра КФК-2 (ЗОМЗ, Россия).

Морфометрические характеристики были получены с помощью просвечивающей электронной микроскопии на микроскопе Н-300 (“Hitachi”, Япония) при увеличении 18 000 (75 кВ).

Культуральные и физиолого-биохимические свойства изолята определяли согласно методическому руководству [14].

Выделение геномной ДНК, амплификацию частичной последовательности гена 16S рРНК и секвенирование проводили, как описано в статье [15]. При анализе последовательностей множественное выравнивание и дальнейшее построение филогенетического древа было выполнено как указано ранее [16]. Последовательность длиной 1488 пар нуклеотидов депонирована в международную базу данных GenBank под номером MK072948.

Определение количества 4-ХФУК в среде культивирования и экстракцию метаболитов проводили по методике, описанной в работе [17]. Продукты катаболизма 4-ХФУК в метилированных экстрактах устанавливали с помощью хроматомасс-спектрометра “Хроматэк-Кристалл 5000” (СКБ "Хроматэк”, Россия) на базе квадрупольного масс-спектрометрического детектора Finnigan DSQ II (“ThermoFinnigan”, США). Условия анализа: капиллярная колонка НР-5MS 30 м × 0.2 мм, растворитель – гексан, температура инжектора и интерфейса 250°С, начальная температура колонки 50°С, скорость нагрева 20 град/мин, конечная температура колонки 250°С. Полученные соединения идентифицировали путем сравнения их масс-спектров с библиотекой спектров NIST05. Обработка результатов проводилась с использованием программного комплекса Xcalibur.

Ингибирование диоксигеназы, расщепляющей ароматическое кольцо, осуществляли согласно методике, описанной в работе [18], с небольшими модификациями. Клетки штамма 36DCP (1.0 г) в середине лаг-фазы роста собирали центрифугированием (3630 g, 10 мин), ресуспендировали в 100 мл 0.1 М фосфатного буфера (pH 7.0) и добавляли 200 мкл среды LB, 100 мкл 4-ХФУК и 2,2'-дипиридил до конечной концентрации 10 мМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Грамотрицательные клетки штамма 36DCP имели форму прямых или слегка изогнутых палочек размером 0.4 × 1.6 мкм, способных двигаться за счет полярных жгутиков. На МПА после 48 ч инкубации при 28°С изолят образовывал прозрачные, гладкие колонии с более плотным возвышающимся центром. Культура продуцировала внеклеточные флюоресцирующие пигменты желто-зеленого, а на ломтике картофеля – синего цвета. Для штамма был характерен аэробный рост с использованием кислорода в качестве конечного акцептора электронов в диапазоне температур от 22°С до 45°С и значениях pH, близких к нейтральным (6.8–7.2).

В качестве единственного источника углерода культура использовала D-глюкозу, цитрат, этанол и глицерин, проявляла каталазную, лецитиназную и аргининдегидролазную активность, осуществляла восстановление NO₃.

Для изолята была определена практически полная последовательность (1488 п. н.) амплификата гена, кодирующего 16S pРНК. Сходство с исследуемой культурой показали бактерии рода Pseudomonas (уровень идентичности 97.3–99.7%), а филогенетически наиболее близким (уровень идентичности 99.7%) оказался типовой представитель вида – P. plecoglossicida FPC951 (AB009457). Однако штамм 36DCP кластрировался отдельно от клады, образованной типовыми штаммами видов P. plecoglossicida, P. monteilii, P. taiwanensis, P. mosselii и P. entomophila, хотя и имел с ними общего предка. При этом достоверность ветвления внутри этого кластера оказалась ниже необходимого 50%-ного порога (рис. 1). Эти результаты позволили идентифицировать исследуемый штамм как Pseudomonas sp. 36DCP и предположить, что он, возможно, является представителем нового вида бактерий.

Рис. 1.

Филогенетическое древо 16S рРНК штамма 36DCP и гомологичных ему последовательностей типовых видов бактерий рода Pseudomonas, построенное методом “neighbor-joining”. Цифрами показана достоверность ветвления, рассчитанная с помощью “bootstrap"-анализа (значимыми признаются величины больше 50). Масштаб отражает эволюционное расстояние, соответствующее 1 нуклеотидной замене на каждые 1000 нуклеотидов. В скобках указаны номера последовательностей в базе данных (GenBank).

В периодической культуре штамм Pseudomonas sp. 36DCP использовал 4-ХФУК в качестве единственного источника углерода и энергии (рис. 2). Значение оптической плотности (ОП) клеточной суспензии достигало максимальной величины (0.3 ед.) на 2 сут культивирования, при этом потребление субстрата составляло 10–15% в сут. Далее, после невыраженной стационарной фазы, наблюдалось снижение ОП клеточной суспензии и, соответственно, потребления субстрата до 3–5%.

Рис. 2.

Зависимость значений ОП₅₉₀ культуральной жидкости (1) и концентрации 4-ХФУК (2) от времени культивирования Pseudomonas sp. 36DCP в периодической культуре.

К настоящему времени данные по бактериальной деструкции 4-ХФУК ограничены немногочисленными исследованиями. Так, молодые культуры штаммов Flavobacterium peregrinum и Achromobacter sp., выращенные на 2М-4Х, полностью окисляли 2 мкM 4-ХФУК за 1.5 ч, тогда как более старые культуры даже через 4 ч показали менее 50% окисления субстрата [19].

Изучаемый штамм Pseudomonas sp. 36DCP был способен к разложению 4-ХФУК в довольно высокой концентрации, кроме того он показал активность в отношении других более хлорированных феноксиуксусных кислот, а именно: 2,4-Д и 2,4,5-Т, а также фенола и 2,4-дихлорфенола (неопубликованные данные). Таким образом, полисубстратная активность штамма Pseudomonas sp. 36DCP может быть использована для разработки технологий очистки территорий, загрязненных комплексом хлорароматических соединений.

В среде культивирования штамма Pseudomonas sp. 36DCP было определено присутствие двух соединений, вероятно являющихся интермедиатами пути деградации 4-ХФУК. Масс-спектр представлял собой сумму масс-спектров двух соединений, идентифицированных как пара-бензохинон и гидрохинон. Суммарный масс-спектр включал в себя пики молекулярных ионов (М⁺) с m/z 108 и 110 а. е. м. и характерные для обоих соединений пики осколочных ионов (рис. 3).

Рис. 3.

Суммарный масс-спектр интермедиатов при конверсии 4-ХФУК штаммом Pseudomonas sp. 36DCP, идентифицированных как пара-бензохинон (М⁺ 108) и гидрохинон (М⁺ 110).

На примере штамма Cupriavidus necator JMP134 показано, что после отщепления остатка уксусной кислоты и образования соответствующего хлорфенола аэробная деградация моно- и дихлорированных феноксиуксусных кислот протекает по классическому хлоркатехольному пути (рис. 4) [2].

Рис. 4.

Пути аэробной деградации хлорированных феноксиуксусных кислот у бактерий: а – 2,4-Д штамма C. necator JMP134 [2], б – 2,4,5-Т штамма B. phenoliruptrix АС1100 [11, 12]. I – 2,4-Д, II – 2,4-дихлорфенол, III – 2,4-дихлоркатехол, IV – 2,4-дихлор-цис, цис-муконат, V – транс-2-хлордиенлактон, VI – цис-2-хлордиенлактон, VII – 2-хлормалеилуксусная кислота, VIII – 2,4,5-Т, IX – 2,4,5-трихлорфенол, X – 2,5-дихлоргидрохинон, XI – 5-хлоргидроксигидрохинон, XII – 2-гидрокси-1,4-бензохинон, XIII – гидроксигидрохинон, XIV – малеилуксусная кислота, XV – β-кето-адипиновая кислота, TCA – цикл трикарбоновых кислот.

В то время как образование производных гидрохинона характерно для метаболизма более хлорированных субстратов, в частности 2,4,5-Т у штамма B. phenoliruptrix АС1100 (рис. 4.). Инициация конверсии происходит в результате монооксигеназной активности 2,4,5-Т-оксигеназы, которая превращает 2,4,5-Т в 2,4,5-трихлорфенол [20]. На второй и третьей стадии монооксигеназа катализирует два гидроксилирования, продуктом которых является 5‑хлоргидроксигидрохинон. Далее происходят последовательные реакции окисления и восстановления субстрата, в результате чего отщепляется последний атом хлора и образуется гидроксигидрохинон, являющийся субстратом для орто-расщепления ароматического кольца [11, 12]. Необходимо отметить, что штамм B. phenoliruptrix АС1100 был получен методом так называемого плазмид-ассоциированного молекулярного бридинга [21], вследствие чего вышеописанный путь деградации 2,4,5-Т может носить несколько избыточный характер и отличаться от природных метаболических путей таких соединений.

Таким образом, продуктами стадий инициации деградации хлорфеноксиуксусных кислот во всех исследованных путях их метаболизма являются хлорфенолы. Проведенный сравнительный анализ позволяет предположить, что в результате деградации 4-ХФУК штаммом Pseudomonas sp. 36DCP также первоначально образуется хлорфенол, у которого галогензаместитель находится в пара-положении по отношению к гидроксильной группе. В то время как наличие гидрохинона в среде культивирования показывает, что дальнейшая конверсия 4-ХФУК у исследуемого штамма проходит по одноименному пути.

Известно, что по пути гидрохинона бактерии могут конвертировать как поли-, так и монозамещенные фенолы. Так, через образование производных гидрохинона разной степени галогенированности, идет метаболизм полихлорфенолов, в частности 2,4,6-трихлорфенола (2,4,6-ТХФ) у вышеупомянутого деструктора 2,4-Д штамма C. necator JMP134 [22], а также три-, четыре- и пентохлорфенолов у культур Rhodococcus chlorophenolicus PCP-I, Rhodococcus sp. CP-2, Rhodococcus sp. CG-1 и Mycobacterium sp. CG-2 [23, 24]. Характерно, что во всех случаях первые два атома хлора элиминируются путем гидроксилирования сначала в пара-, а затем в орто-положении по отношению к фенольной гидроксильной группе субстрата с образованием соответствующих хлорпроизводных гидрохинона и гидроксигидрохинона.

В путях деградации пара-замещенных фенолов первоначальная реакция также включает замену пара-заместителя на гидроксильную группу, однако продуктом является незамещенный гидрохинон. При этом в результате монооксигеназной активности сначала образуется промежуточный интермедиат – пара-бензохинон, который затем восстанавливается до гидрохинона. Такой механизм установлен для деструкторов пара-нитрофенола штаммов Moraxella sp., Pseudomonas sp. WBC-3, Pseudomonas sp. 1–7, Arthrobacter protophormiae RKJ100 [25–28], 4-аминофенола штамма Burkholderia sp. АК-5 [29] и 4-фторфенола штамма Arthrobacter sp. IF1 [30].

Таким образом, в пути деградации 4-ХФУК штамма Pseudomonas sp. 36DCP наиболее вероятно монооксигеназное превращение предполагаемого метаболита – пара-хлорфенола в пара-бензохинон, который затем восстанавливается до гидрохинона, обнаруженного в среде культивирования.

Известно, что в аэробных условиях у бактерий гидрохинон может далее направляться по β-кетоадипатному пути через две различные метаболические ветви (рис. 5). Первый путь включает первоначальное гидроксилирование гидрохинона с образованием гидроксигидрохинона (1,2,4-тригидроксибензол) и последующую реакцию расщепления кольца, катализируемую 1,2-диоксигеназой. Второй путь деградации гидрохинона носит менее распространенный характер. В этом случае ароматическое кольцо гидрохинона непосредственно расщепляется с помощью специфической гидрохинон-1,2-диоксигеназы, а образующийся при этом 4-гидроксимуконовый полуальдегид окисляется до малеилуксусной кислоты [31].

Рис. 5.

Две ветви пути аэробной деградации гидрохинона [31]. I – гидрохинон, II – гидроксигидрохинон, III – 4-гидроксимуконовый полуальдегид, IV – малеилуксусная кислота, V – β-кето-адипиновая кислота, TCA – цикл трикарбоновых кислот.

Для того чтобы определить по какой из двух возможных ветвей пути гидрохинона протекает конверсия 4-ХФУК у исследуемого штамма был использован хелатор железа 2,2-дипиридил. Известно, что данное соединение ингибирует активность многих диоксигеназ, расщепляющих ароматическое кольцо [32]. К культуре, находящейся в лаг-фазе и активно наращивающей биомассу на 4-ХФУК в качестве единственного источника углерода и энергии, добавляли 2,2-дипиридил. Метаболиты были идентифицированы после 1 ч культивирования в прежних условиях. Хроматомасс-спектрометрический анализ показал наличие в пробе только пара-бензохинона и гидрохинона. Таким образом, отсутствие гидроксигидрохинона в среде культивирования свидетельствует о том, что вероятно гидрохинон является субстратом диоксигеназы, расщепляющей ароматическое кольцо.

Непосредственное расщепление ароматического кольца гидрохинона с образованием 4-гидроксимуконового полуальдегида известно для конверсии многих экологически значимых соединений, а именно: пара-замещенных фенолов (4-хлор-, 4-фтор-, 4-бром-, 4-йод- и 4-нитрофенола) у Arthrobacter ureafaciens CPR706 [33], линдана (γ-гексахлорциклогексан) у Sphingomonas (ранее Pseudomonas) paucimobilis UT26 [34], 4‑нитрофенола штаммами Moraxella sp., Pseudomonas sp.WBC-3 и Pseudomonas sp. 1–7 [25–27], 4-гидроксиацетофенона у Pseudomonas fluorescens ACB [35] и алкилфенолов у Sphingomonas sp. TTNP3 и Sphingobium xenophagum Bayram [36].

В проведенном исследовании на основании идентифицированных ключевых метаболитов в среде культивирования (пара-бензохинона и гидрохинона) и по аналогии с другими рассмотренными известными системами биодеградации был предложен метаболический путь конверсии 4-ХФУК у Pseudomonas sp. 36DCP (рис. 6).

Рис. 6.

Возможный путь деградации 4-ХФУК у Pseudomonas sp. 36DCP. I – 4-ХФУК, II – пара-хлорфенол, III – пара-бензохинон, IV – гидрохинон, V – малеилуксусная кислота, TCA – цикл трикарбоновых кислот. В скобки взяты предполагаемые метаболиты.

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что деградация 4-ХФУК у Pseudomonas sp. 36DCP начинается с трансформации первоначального субстрата до 4-хлорфенола, который затем направляется по пути пара-замещенных фенолов. При этом наиболее вероятно монооксигеназное превращение 4-хлорфенола в пара-бензохинон, который затем восстанавливается до гидрохинона. Последний, вероятно, является субстратом дальнейшего расщепления кольца. Необходимо отметить, что ранее такого пути конверсии монохлорированных феноксиуксусных кислот у бактерий описано не было.

В работе было использовано оборудование центра коллективного пользования “Агидель” УФИЦ РАН.