Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 4, стр. 403-409

МЕТОДИКА

Штаммы N. crassa и культивирование. Штамм N. crassa дикого типа wt 987 (74-0R23-1A) и мутанты nit-2 (33 A) и nit-6 (3463 A) были предоставлены Центром по хранению генетического материала грибов (Fungal Genetic Stock Center – FGSC, США). Оба мутанта дефектны по НиР, а штамм nit-2 – по НиР и НР.

В качестве инокулята использовали суспензию конидий с концентрацией спор 30 мг/мл (соответствует 10⁶ конидий), которую получали по разработанному ранее методу [3] и хранили при – 70°C.

Инокулюм гриба равномерно распределяли по поверхности бислоя целлофан-фильтровальная бумага (диаметр чашки Петри 9 см), помещенного на агаризованную среду для роста (0.25 мг спор), или (при исследовании выхода нитрита из мицелия) на слой стеклянных шариков диаметром 7 мм, погруженных в жидкую питательную среду (1 мг спор). Мицелий выращивали на среде Фогеля с 2%-ной сахарозой в качестве источника углерода, модифицированной по источнику азота [24]. В различных опытах по конидогенезу вместо 25 мM NH₄NO₃ использовали 50 мM NH₄Cl или 50 мМ NH₄NO₃, или 50 мМ NaNO₃. При культивировании на агаризованной среде фильтровальный диск пропитывали 3 мл среды роста, чтобы предотвратить формирование конидий на мицелии при выращивании в темноте. Для образования протоперитециев в агаризованную среду Фогеля, покрытую целлофановым диском, включали 4 мM NH₄Cl в качестве источника азота, а также 1% сорбозы и 0.1% глюкозы как источник углерода. Смесь 20% сорбозы и 2% глюкозы стерилизовали отдельно и добавляли в стерильную расплавленную среду роста.

Фотоморфогенез. В опытах по фотостимуляции конидиогенеза мицелий N. crassa культивировали на агаризованой среде в темноте (в светонепроницаемых хлопчатобумажных мешках) в течение 24 ч при 28°C (переход от логарифмической к стационарной фазе роста) и затем в течение 2 ч экспонировали под флуоресцентными лампами ЛДЦ-36 (“ВНИИС_Лисма”, Россия) при интенсивности 15 Вт м^–2. Темновые контроли выдерживали при комнатной температуре. После 24 ч темновой инкубации всех чашек при 28°C собирали споры для изучения влияния различных реагентов на конидиогенез или же мицелий для определения внутриклеточного содержания нитрита и нитрата.

Для сбора конидий в каждую чашку Петри добавляли по 5 мл стерильной дистиллированной воды и полученную суспензию спор последовательно разводили (1 : 100, 1 : 1000 и 1 : 10 000) и анализировали. Для этого споры высевали на агаризованную среду Фогеля, модифицированную для получения колониального роста N. crassa [25]. Через 2 сут инкубации в тех же условиях подсчитывали число жизнеспособных конидий.

Для проверки действия различных реагентов на фотоморфогенез гриба 1 мл тестируемого соединения вносили в темноте под бислой “целлофан-фильтровальная бумага” и затем перед освещением инкубировали 30 мин при 28°C.

Мицелий собирали шпателем при красном свете, промывали дистиллированной водой, фильтровали через 3 слоя марли, высушивали при помощи фильтровальной бумаги и разрушали при растирании с жидким азотом в течение 15 мин. Для получения гомогената экстракцию проводили при слабом перемешивании в течение 30 мин тремя объемами 50 мM трис-HCl буфера, pH 8.0, содержащего 0.5 мM ЭДTA, 1 мM дитиотреитола, 5 мкг/мл леупептина, 5 мкг/мл апротинина, 5 мкг/мл пепстатина и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида. Пробы центрифугировали при 20 000 g в течение 30 мин при 4°С, и полученные супернатанты после депротеинизации исследовали на содержание нитритов и нитратов.

Для индукции образования протоперитециев целлофановый диск с мицелием N. crassa после 3 сут темнового роста на агаризованной среде при 23°C переносили при красном свете на новую чашку Петри со средой того же состава, но без источника азота. После 24 ч темновой инкубации при 23°C чашки с мицелием освещали синим светом (370–500 нм, 1 Вт м^–2) в течение 2 мин. Контроли хранили в темноте. После 2 сут темновой инкубации при 23°C подсчитывали под бинокулярным микроскопом число образовавшихся протоперитециев.

Число конидий и протоперитециев нормализовали на 1 см² поверхности чашки Петри.

Определение нитрита и нитрата. Нитрит определяли в среде культивирования после различных периодов освещения мицелия N. crassa, выращенного в поверхностной культуре на бислое “целлофан-фильтровальная бумага”, положенном на слой стеклянных шариков, погруженных в жидкую питательную среду. Для этого к среде, профильтрованной через стеклянный фильтр № 4 (“Duran”, Германия), добавляли реактив Грисса (1%-ная сульфаниловая кислота в 20%-ной HCl, содержащей 0.1%-ный нафтилэтилендиаминдигидрохлорид) и после 15 мин инкубации измеряли поглощение раствора при 545 нм. Для построения калибровочной кривой использовали нитрит натрия.

Внутриклеточную концентрацию нитрита и нитрата (NO_x) определяли в супернатантах гомогенатов N. crassa (30 мин, 20 000 g при 4°С) после действия 2,3-диаминонафталина (ДАН), образующего флуоресцирующий продукт, 1-(H)-нафтотриазол, флуорометрическим методом с небольшими модификациями [26]. Депротеинизированные при 100°C супернатанты мицелия добавляли к смеси, содержащей 0.125 ед/мл НР, 25 мкM НАДФН и 25 мкM ФАД в 20 мM трис-HCl буфере, pH 7.6, и инкубировали 30 мин при 37°C. Для окисления непрореагировавшего НАДФН использовали систему лактатдегидрогеназа–пируват в концентрациях 150 Ед/мл и 10 мМ соответственно. Затем добавляли 316.0 мкM ДАН в 0.62 M HCl, и смесь инкубировали 10 мин при 37°C в темноте. Чтобы стабилизировать флуоресценцию образованного продукта, вносили 280 мкM NaOH. Интенсивность флуоресценции измеряли при помощи флуоресцентного ридера Wallac 1420 (“Perkin Elmer”, США) при λ_{возбуждения} 365 нм и λ_{эмиссии} 405 нм. Концентрацию NO_x выражали в нмоль/мг белка.

Концентрацию общего белка определяли по методу Бредфорд, используя БСА в качестве стандарта.

Статистика. Число биологических параллелей варьировало от 3 до 15, число биохимических параллелей было не ниже 3.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности фотоморфогенеза в различных штаммах N. crassa.Ранее было установлено, что в зависимости от природы источника азота в среде роста и его концентрации может происходить ингибирование или активирование фоторегулируемых процессов полового и бесполого развития у N. crassa [27, 28], а также регуляция фотозависимых генов al, bli и con [29]. В 2015 г. было показано [24], что конидиогенез в клетках дикого типа гриба, выращенных на среде с хлористым аммонием в качестве единственного источника азота, нечувствителен к действию света, в то время как в культуре, выращенной на среде с нитратом аммония или натрия, освещение стимулировало образование жизнеспособных бесполых спор. При этом фотоответы nit-2 и nit-6 мутантов на среде с NH₄Cl были сходны, но сильно отличались от ответов на среде с NH₄NO₃.

Был проведен сравнительный анализ стимуляции светом образования предшественников женских половых структур, протоперитециев, у штамма дикого типа и nit-6 мутанта. Полученные данные свидетельствовали о том, что после освещения количество образовавшихся протоперитециев у данных штаммов изменялось сходным образом (табл. 1).

Таким образом, стимуляция светом образования бесполых и половых структур у дикого типа и мутантов по азотному метаболизму N. crassa различалась.

Выход нитрита из мицелия nit-6 мутанта N. crassa при фотостимулируемых каротиногенезе, конидиогенезе и образовании протоперитециев. В предыдущей работе [30] показано, что выброс ${\text{NO}}_{2}^{ - }$^{клетками суточной культуры мутанта nit-6, в которых отсутствует НиР, но присутствует НР, более чем в 10 раз превышает таковой из клеток nit-2 штамма гриба, лишенного обоих ферментов. Поэтому использование nit-6 штамма N. сrassa, в котором осуществляется каталитическое превращение нитрата в нитрит, и выход ${\text{NO}}_{2}^{ - }$ можно рассматривать как показатель суммарного содержания ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ и NO₂ вне клетки, что облегчает выполнение исследования. Ранее было изучено [30], как изменяется содержание нитрита в среде культивирования при фотоиндукции каротиногенеза в мицелии nit-6 мутанта N. crassa. После 30 мин инкубации мицелия на свету (лаг-фаза фотоиндукции каротиноидов) концентрация нитрита в среде превышала его концентрацию в темновом контроле в полтора раза и далее снижалась до уровня темнового контроля.}

Уровень содержания ионов нитрита в среде культивирования nit-6 штамма N. crassa также изменялся при фотостимулируемом конидиогенезе (рис. 1). Светозависимое образование конидий nit-6 мутантом гриба изучали в поверхностной культуре, выращенной на жидкой среде в присутствии 50 мМ NH₄NO₃ (в этих условиях наблюдается 8-кратная фотостимуляция конидиогенеза). После 24 ч темнового роста мицелий освещали в течение 30 мин, 1 или 2 ч, затем снова переносили чашки Петри в темноту на 1 сут (за это время происходит формирование конидий). Отбор проб культуральной среды для измерения содержания нитрит-ионов проводили в течение 2 ч фотоэкспозиции и каждый ч после ее окончания (в 6 ч диапазоне), а также через 1 сут. Выявлено достоверное возрастание по сравнению с темновыми контролями выхода этих ионов из мицелия nit-6 штамма N. crassa, подвергнутого освещению, которое оказалось наиболее интенсивным через 4 ч после окончания действия света.

Рис. 1.

Влияние освещения на выход нитрита в культуральную среду мутанта N. crassa nit-6 при фотостимуляции конидиогенеза.

В противоположность фотокаротиногенезу и фотоконидиогенезу на разных стадиях фотоморфегенеза полового цикла (3 сут мицелий, голод по азоту, облучение синим светом и стадия сформировавшихся протоперитециев в освещенной и темновой культурах штамма гриба nit-6) не был обнаружен выход ионов нитрита в среду культивирования.

Анализ динамики выхода нитрита в ходе фотоиндуцированного каротиногенеза [30] и фотостимулируемого образования вегетативных спор (данная работа) штамма N. crassa nit-6 свидетельствовал о возможном участии NO в передаче фотосигнала. Вместе с тем отсутствие выброса ${\text{NO}}_{2}^{ - }$^{в ходе светорегулируемого формирования предшественников половых структур N. сrassa указывало на то, что эндогенный оксид азота не участвовал в этом процессе. Таким образом, в зависимости от природы трех светорегулируемых процессов (индукция каротиногенеза, стимуляция бесполого или полового циклов) роль NO-генерирующего механизма в трансдукции фотосигнала гриба может отличаться.}

Внутриклеточное содержание нитрита и нитрата при светозависимом конидиогенезе N. crassa в разных условиях формирования конидий. Оценить, что происходит с метаболитами оксида азота внутри клетки при фотостимуляции конидиогенеза можно по данным рис. 2. На нем представлено содержание нитрита и нитрата в расчете на мг белка в супернатантах гомогенатов 3 штаммов N. crassa, определенное с использованием флуоресцентного индикатора ДАН. Для сравнения выбраны различные варианты образования конидий после действия света в гидратированной культуре (штамм + источник азота в среде роста) без заметного влияния света (wt-987 или nit-2 + + 50 мМ NH₄Cl) и фотостимуляция (остальные) [24]. Для всех вариантов после фотоэкспозиции наблюдалось резкое снижение содержания [${\text{NO}}_{3}^{ - }$ + ${\text{NO}}_{2}^{ - }$]. Исключение составил вариант (wt‑987 + 50 мМ NaNO₃), для которого этот параметр не изменялся. После освещения мицелия внутриклеточное содержание нитрит-ионов снижалось во всех случаях, кроме варианта (nit-2 + + 50 мМ NH₄Cl), в котором оно чрезвычайно мало и практически не изменялось. В фотоэкспонированных клетках nit-мутантов гриба содержание нитрат-ионов падало по сравнению с темновыми контролями в отличие от штамма дикого типа, в котором оно возрастало. Несмотря на наличие светозависимого изменения содержания ионов нитрита и нитрата в изучаемых штаммах N. crassa, прямой корреляции изменения этого параметра с явлением фотостимуляции конидиогенеза не удалось обнаружить.

Рис. 2.

Внутриклеточное содержание нитрита и нитрата, определенное флуоресцентным методом, в темновом и освещенном мицелии при конидиогенезе у штаммов N. crassa (штамм + среда культивирования) на среде с 50 мМ NH₄Cl (а), 50 мМ NH₄NO₃ (мутант nit-6, б) и 50 мМ NaNO₃ (штамм wt-987, в) 1 – NO_x/мг белка; 2 – NO₂/мг белка; 3 – NO₃/мг белка.

В работе [31] для идентификации и функциональной оценки эндогенного NO у N. crassa также был использован флуоресцентный метод с другим флуоресцентным индикатором – 4-амино-5-метиламино-2',7'-дифлуоресцеин диацетатом. Было обнаружено увеличение содержания внутриклеточного оксида азота в гифах мицелия при росте в погруженной культуре, а также в конидиофорах при конидиогенезе в поверхностной культуре. Было также показано, что обработка мицелия NO-скавенджером, 2-(4-карбоксифенил)-4,5-дигидро-4,4,5,5-тетраметил-1-H-имидазолил-1-окси-3-оксидом, приводила к резкому уменьшению уровня транскрипции генов con-10 и con-13, экспрессия которых возрастает при конидиогенезе. Было предположено, что оксид азота образуется внутри молодых растущих гиф и участвует в формировании конидий. Вместе с тем, в данных экспериментах по конидиогенезу влияние света (сравнение освещенных и темновых культур) не было изучено, а также не учитывалось влияние изменения природы азотного компонента среды роста на фотоконидиогенез.

Увеличение содержания производных продуктов NO наблюдали при споруляции водного гриба Blastocladiella emersonii, применяя флуоресцентное определение с 4,5-диаминофлуоресцеин диацетатом [32]. Еще один флуоресцентный краситель, диаминорходамин-4М, использовали для доказательства образования NO при прорастании и раннем развитии мицелия Magnaporthe oryzae [33].

Действие L-нитроаргинина, S-нитрозоглутатиона (GSNO) и нитрита натрия на фотостимуляцию конидиогенеза. Результаты, приведенные в табл. 2 показали, как инкубация с различными реагентами, влияющими на азотный метаболизм, сказывалась на фотоконидиогенезе N. crassa при культивировании мицелия разных штаммов на среде с 50 мМ хлоридом аммония.

Эффект от добавления доноров оксида азота и ингибиторов NO-синтазы млекопитающих является индикатором образования оксида азота в клетках грибов [12, 16–20, 32]. Количественный анализ образования жизнеспособных конидий при действии ингибитора NO-синтазы, L-нитроаргинина (L-НА), выявил светозависимую стимуляцию процесса у всех изученных штаммов N. crassa. Это согласовывалось с данными работы [21] по действию специфических ингибиторов NO-синтазы на светозависимый конидиогенез al-2 bd штамма гриба, вычисленными по плотности полос конидиирования на единицу их площади.

Как правило в литературе для выяснения сигнальной функции эндогенного NO при дифференцировке грибов используют донор экзогенного оксида азота – нитропруссид натрия. При его добавлении наблюдали увеличение под действием света образования спорообразующих структур у грибов Phycomyces blakesleeanus [16] и плодовых тел у Flamulina velutipes [17], а также возобновление формирования конидий у L-аргининового ауксотрофа Coniothyrium minitans [18, 19]. Вместе с тем введение данного донора NO приводило к ингибированию образования вегетативных спор у A. nidulans [20] и фотоконидиогенеза у N. crassa [21]. Несмотря на то, что в данной работе использовали донор NO другой природы, GSNO, он также оказывал ингибирующее действие на фотостимуляцию образования конидий у N. crassa.

Следует отметить, что добавление нитрита натрия, который можно рассматривать как метаболит оксида азота, вызывало после освещения более чем двукратное увеличение по сравнению с водными контролями числа образовавшихся конидий у дикого штамма и значительное их уменьшение у nit-мутантов N. crassa как в темноте, так и после фотоэкспозиции (табл. 2). При этом у штамма дикого типа и nit-2 мутанта был отмечен эффект фотостимуляции конидиогенеза, что противоречило предположению об отрицательной регуляторной роли NO в фотоконидиогенезе, выдвинутому в работе [21].

Таким образом, результаты по введению в среду культивирования донора оксида азота GSNO, ингибитора NO-синтазы, L-НA, и нитрита натрия можно было отнести к косвенным свидетельствам участия NO в фотоконидиогенезе N. crassa.

Вопрос о природе генерации NO у грибов остается открытым. Одним из возможных ферментов, ответственных за этот процесс, является НР. Так, в работе [34] сообщалось, что при развитии Aspergillus nidulans синтез NO регулируется НР, причем ген нитратредуктазы niaD активируется при индукции конидиогенеза даже в условиях репрессии азотом в присутствии аммония. Ранее возможность участия НР и НиР в регуляции фотоконидиогенеза была показана для дикого штамма N. crassa [24], однако установлено, что это не являлось необходимым элементом процесса, так как и в отсутствие этих ферментов (nit-2 и nit-6 мутанты) наблюдалась светозависимая стимуляция образования спор.

Другими возможными кандидатами, ответственными за образование оксида азота у грибов, могут быть NO-синтаза, катализирующая синтез NO из аргинина и кислорода, ксантиноксидаза или неэнзиматический синтез [35].