Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 4, стр. 350-355

МЕТОДИКА

Выделение и очистка белков-модуляторов. В работе были использованы печень, легкое и сыворотка крови крыс Wistar обоего пола весом 220–250 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Перед декапитацией животных наркотизировали эфиром, собирали кровь, перфузировали через портальную вену печень и кровь физиологическим раствором в течение 3–5 мин и вырезали органы.

Для выделения МГТБ использовали также ткани органов молодых особей КРС (Bos taurus) обоего пола, достигших репродуктивного возраста, которые получали на мясоперерабатывающих предприятиях Московской области. Источниками получения МГТБ являлись такие свежеизвлеченные ткани, как головной мозг, сердце, аорта, семенники и яичники, а также отдельные ткани свежеэнуклеированных глаз, включая склеру, роговицу, влагу передней камеры глаза, радужку, стекловидное тело, цилиарное тело, нейральную сетчатку, пигментный эпителий и зрительный нерв.

МГТБ выделяли из сыворотки крови КРС, используя коммерческий препарат “Сыворотка крупного рогатого скота стерильная, инактивированная, питательная добавка при культивировании клеток и тканей”, произведенный в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова (Россия).

Кровь, полученную от крыс, инкубировали в течение 10 мин при 37°С, а затем в течение 1 ч при 4–8°С. Сыворотку крови аккуратно собирали пипеткой, центрифугировали при 2000 g в течение 30 мин при 4–8°С.

Свежеизвлеченные ткани различных органов крыс или КРС очищали от других тканей, нарезали на фрагменты размером 1–1.5 см и из них экстрагировали вещества в течение 3 ч при 4°C раствором, содержащим 1 мМ СаСl₂, 0.15 M NaCl и 1.0 мМ HEPES (pH 7.0–7.2). Полученные тканевые экстракты фильтровали через четыре слоя марли и центрифугировали при 3000 g в течение 15 мин при 4°C. Надосадочную жидкость собирали, осаждали белки сернокислым аммонием (78 г соли на 100 мл раствора) в течение 96 ч при 4°C. Аналогичным образом получали экстракты сыворотки крови млекопитающих. После образования осадка белки отделяли центрифугированием при 15 000 g в течение 45 мин. Супернатант и осадок собирали отдельно для каждого органа или сыворотки крови.

Надосадочную жидкость (супернатант) и осадок обессоливали на хроматографе NGC Chromatography System Quest Plus (“Bio-Rad”, CША) с колонкой EnRich SEC 70 (1 × 30 см, “Bio-Rad”, CША), сорбент в которой уравновешивали водой со скоростью 0.5 мл/мин. Элюцию осуществляли водой с той же скоростью. В полученных фракциях определяли присутствие МГТБ, оценивая мембранотропную активность [1].

Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Обессоленные фракции осадка экстрактов тканей органов КРС и крысы подвергали обращенно-фазовой ВЭЖХ на жидкостном хроматографе высокого давления “Agilent 1260” (“Agilent Technologie”, США) с колонкой Kromasil C₄ (4.6 × 250 мм, “AkzoNobel”, Швеция) и сорбентом которой уравновешивали 0.1%-ной трифторуксусной кислотой, рН 2.2. Связавшийся с сорбентом материал элюировали в течение 60 мин градиентом концентрации ацетонитрила 0–60% в 0.1%-ной трифторуксусной кислоте, рН 2.2. Скорость элюции – 1 мл/мин. Содержание продуктов определяли спектрофотометрически при 210 нм.

Содержание белка. На всех стадиях работы определяли количественное содержание белка во всех изучаемых фракциях спектрофотометрически по методу Варбурга и Кристиана [7].

Метод оценки мембранотропной активности. Мембранотропную активность изучали на мышах F1 C57BL/CBA (самцы, 18–20 г) методом, разработанным ранее для идентификации МГТБ [1, 8]. Метод основан на определении вязкоупругих свойств ткани печени и легкого мыши в условиях деформации сдвига после органотипического культивирования. Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента.

Масс-спектрометрический анализ. Анализ осуществляли на времяпролетном MALDI-TOF-масс-спектрометре UltraFlex 2 (“Bruker Daltonics”, Германия), оснащенном азотным лазером 337 нм с частотой импульса до 20 Гц. Все измерения проводили в линейном и рефлекторном режиме, определяя положительные ионы. Для накопления масс-спектров мощность лазерного излучения устанавливали на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца. Внешнюю калибровку проводили с использованием точных значений ММ известных белков. Образец наносили на три ячейки планшета, для каждой из которых записывали спектр, полученный в результате суммирования 10 серий спектров по 50 импульсов лазера для каждой. Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение (“Bruker Daltonics”, Германия): flexControl 2.4 (Build 38) и flexAnalysis 2.4 (Build 11). Точность измерения масс составляла ±2 Да. В качестве матрицы использовали насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (“Sigma-Aldrich”, Германия) в смеси 50%-ного ацетонитрила и 2.5%-ной трифторуксусной кислоты. Все использованные реактивы, включая воду, были аналитической или специальной для масс-спектрометрии чистоты.

Определение N-концевой аминокислотной последовательности. Аминокислотную последовательность определяли на автоматическом секвенаторе белков Shimadzu PPSQ-33A (“Shimadzu”, Япония) по методу Эдмана [9] с использованием программы производителя.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ). Электрофорез проводили по методу Лэммли [10] на вертикальных пластинах толщиной 0.75 мм в ПААГ, содержащего 12.5% акриламида в разделяющем и 4% в концентрирующем геле, при постоянном токе 20–30 мА в течение 1 ч. После окончания электрофореза гель фиксировали и окрашивали кумасси R250. Из геля вырезали фрагменты, соответствующие белку с ММ 66000 Да. Для определения молекулярной массы использовали маркерные белки 2–250 кДа (“Bio-Rad”, США).

Трипсинолиз белка в геле in situ. Полученную в результате электрофореза в ПААГ полосу белка вырезали из геля (площадью 3 мм²), промывали 100 мкл 50%-ного метанола и дегидратировали в 400 мкл ацетонитрила. Восстановление дисульфидных связей проводили 100 мкл 10 мМ дитиотреитола (“Fermentas”, Латвия) с последующим их алкилированием 100 мкл 55 мМ йодацетамида (“Sigma-Aldrich”, Германия). Затем модифицированный белок подвергали гидролизу в геле, добавляя 20 мкл (1.0 мг/мл) трипсина (“Promega”, США) в 25 мМ NH₄HCO₃, после чего инкубировали в течение ночи при 37°С. Полученные пептиды экстрагировали 10 мкл 50%-ного ацетонитрила в 1%-ной трифторуксусной кислоте и анализировали. Супернатант (1 мкл) смешивали на стальной мишени с 0.5 мкл (20 мг/мл) раствора α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (“Sigma-Aldrich”, Германия) в смеси 50%-ного ацетонитрила и 2.5%-ной трифторуксусной кислоты и подвергали масс-спектрометрическому анализу.

Идентификация белков по базам данных. Белки идентифицировали с помощью программного пакета Mascot (http://www.matrixscience.com/search_form_select.html). Поиск осуществляли по данным масс-спектров белков всех организмов с указанием типа гидролиза (трипсин с фиксированной модификацией цис-карбамоилметил) в базе данных Swiss-Prot и NCBI (Национальный центр США по биотехнологической информации).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как было показано ранее, использованный в работе метод выделения позволил получить из межклеточного пространства тканей различных органов млекопитающих МГТБ, оказывающие влияние на такие основные биологические процессы, как адгезия, миграция, дифференцировка, пролиферация и увеличение жизнеспособности клеток in vitro, а также стимулирующие восстановительные и репаративные процессы в поврежденных тканях [1]. При высаливании белков тканевых экстрактов насыщенным раствором сульфата аммония были получены две фракции – надосадочная жидкость (супернатант) и осадок. Было установлено, что характерная для МГТБ мембранотропная активность обнаруживалась только во фракции супернатанта. После концентрирования и повторного высаливания белков супернатанта был получен второй осадок, проявляющий мембранотропную активность. Изучение его состава методами электрофореза в ПААГ и обращенно-фазовой ВЭЖХ показало, что осадок представлял собой альбумин сыворотки крови КРС практически в гомогенном состоянии. Данную фракцию можно было получить в препаративных количествах из любого источника, поэтому она была использована для анализа и характеристики компонентов МГТБ, выделенных из тканей различных органов, а также сыворотки крови КРС и крыс Wistar. Следует отметить, что такое изучение представляло несомненный интерес для понимания молекулярных основ тканеспецифичности биологического действия МГТБ [1].

При анализе пептидно-белковых компонентов МГТБ, выделенных из тканей различных органов, в том числе, глаз, КРС и крыс Wistar, а также сыворотки крови, с помощью метода “пептидного отпечатков” (PMF, peptide mass fingerprint) было установлено, что в образовании МГТБ принимали участие три изоформы сывороточного альбумина (табл. 1 и 2). Было показано, что альбумины, выделенные из сыворотки крови, стекловидного тела, склеры, цилиарного тела, радужки, нейтральной сетчатки, головного мозга, сердца, аорты, семенников и яичников КРС, имели ту же аминокислотную последовательность, что и сывороточный альбумин B. taurus. Аальбумины из пигментного эпителия роговицы и зрительного нерва соответствовали другому сывороточному альбумину B. taurus, а альбумин из передней камеры – третьему. Эти альбумины внесены в базу данных NCBI под номерами gi|1351907, gi|367460260 и gi|74267962 соответственно. Их аминокислотные последовательности различны. Так, в первой группе альбуминов в положении 214 находится аланин, в то время как во второй группе в данном положении расположен треонин. В аминокислотной последовательности альбумина, выделенного из передней камеры, обнаружены четыре замены остатков Глу116Aла, Aла214Tре, Aла429Глу, Aсп579Гли по сравнению с альбуминами из первой группы (табл. 1). Используя метод “пептидных отпечатков” (PMF), был проведен сравнительный анализ триптических фрагментов альбуминов, выделенных из сыворотки, печени, легкого и головного мозга крысы Wistar. Оказалось, что альбумины, выделенные из сыворотки крови и головного мозга крысы, идентичны сывороточному альбумину крысы (Rattus norvegicus), имеющему в базе данных NCBI номер gi|124028612, а легкого и печени – другим альбуминам, номера которых gi|158138568 и gi|55628 соответственно. Эти альбумины различались тремя заменами аминокислотных остатков в положении 262: Вал → Лей → Вал, в 317 – Иле → Tре → Tре, в 431 – Вал → Иле → Вал (табл. 2). Установленные замены остатков в первичной последовательности альбуминов, входящих в состав МГТБ, выделенных из тканей КРС и крысы, расположенные во втором и третьем доменах их молекул.

Масс-спектрометрический анализ пептидов, входящих в состав МГТБ, выделенных из различных тканей крысы и КРС, показал, что в нескольких тканях таких органов, как головной мозг и кость (большая берцовая) крысы, сетчатка, хрусталик, стекловидное тело, радужка, цилиарное тело, пигментный эпителий, склера и эмбриональная сыворотка крови и роговица глаза КРС, присутствовал пептид с ММ 4301 ± 2 Да [5]. Данный пептид не был обнаружен в биорегуляторах, выделенных из сыворотки крови и печени взрослых особей КРС, а также печени и сердца крысы [5]. Следует отметить, что в биорегуляторах, выделенных из тканей глаза КРС, присутствовали еще сигналы со значениями m/z, равными 4530 и 4818 [5]. Изучение структуры пептидных компонентов некоторых МГТБ показало, что они были фрагментами тех или иных регуляторных белков и ферментов. Так, методами протеомных исследований установлено, что полипептид с ММ 4749 ± 2 Да, который отвечает за проявление биологической активности МГТБ, выделенного из головного мозга крыс, представлял собой N-концевой фрагмент гуанин-нуклеотидсвязывающего G_O-белка (субъединицы α-1) мозга крысы [11]. Биорегулятор, выделенный из пигментного эпителия глаза КРС, в качестве функциональной основы содержал пептид с ММ 4372 ± 2 Да, структура, которого идентична n-концевому фрагменту фосфодиэстеразы циклического ГМФ (КФ 3.1.4.17) сетчатки КРС [11]. Из набора полипептидов МГТБ сыворотки крови были выделены и методом леддерного секвенирования карбоксипептидазой Y идентифицированы частичные C-концевые последовательности двух пептидов. Так, аминокислотная последовательность пептида с ММ 1448 ± ± 2 Да имела 100%-ную гомологию с N-концевым фрагментом Р-кадгерина эндотелия бычьей аорты, а частичная C-концевая аминокислотная последовательность пептида с ММ 1151 ± 2 Да оказалась гомологичной N-концевой последовательности фрагмента киназного домена регуляторного белка TRB-2 гранулоцитов КРС.

Полученные данные показали, что только три изоформы сывороточного альбумина обладали способностью проникать в межклеточное пространство тканей КРС и крысы. В каждом виде у альбуминов существовали определенные места замен аминокислотных остатков, они были строго постоянны и не зависели от таких факторов, как порода, пол, условия содержания и прочее. Конформация соответствующих изоформ альбуминов позволяла сайтам связывания с полипептидами, входящими в состав МГТБ, оказаться в строго определенном положении доступными для взаимодействия с ними.

Этот факт может объяснить способность альбумина в различной степени влиять на активность полипептидов МГТБ. Например, в сыворотке крови взаимодействие с альбумином обратимо ингибирует биологическую активность регуляторного пептида. В роговице и склере глаза КРС, а также в печени и легком крыс альбумин ответственен за проявление тканевой специфичности МГТБ. В тканях заднего отдела глаза (пигментного эпителия, радужки и стекловидного и цилиарного тел) альбумин дополнительно активирует биологическое действие полипептидов МГТБ [1, 12]. Можно предположить, что, поскольку существует избирательный транспорт через гистогематические барьеры, то только определенные изоформы альбумина способны попадать в межклеточное пространство и связываться с полипептидами МГТБ по кальций связывающему механизму. Основная функция этих изоформ сывороточного альбумина и состоит в образовании определенной макромолекулярной структуры межклеточного пространства, исключительно важной для установления и поддержания межклеточных адгезионных взаимодействий. Как было показано ранее, данная структура образуется в межклеточном пространстве за счет выраженной тенденции пептид-белковых комплексов из состава МГТБ к межмолекулярной агрегации с образованием крупных наноразмерных частиц. Наличие агрегации в различных тканях было показано иммуногистологическими методами [1, 12]. Она оказывает влияние на плазматическую мембрану клеток, увеличивая ее проницаемость, а также вязко-упругие свойства в условиях сдвиговой деформации (основной адгезиометрический метод биотестирования МГТБ) [13]. Предполагают, что данная структура связана с мембраной клеток посредством углеводной компоненты, которая обнаруживается в составе всех МГТБ животного происхождения. Решение данного вопроса явится предметом наших дальнейших исследований.

Работы с животными проводили в соответствии с законодательством Российской Федерации и Директивой Европейского Парламента и Совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях [14].