Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 4, стр. 338-349

ПОСЛЕДСТВИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВЫ НЕФТЯНЫМИ УГЛЕВОДОРОДАМИ

К настоящему времени накоплен огромный объем работ, посвященных различным аспектам трансформации почвенного покрова при попадании в него углеводородов. Загрязнение нефтью и нефтепродуктами влияет на весь комплекс свойств почвы, определяющих ее плодородие и экологические функции. Степень этих изменений зависит от климата, ландшафта и рельефа местности, типа и исходного состояния почвы, а также от дозы, продолжительности воздействия и особенностей поллютанта. Нефть является комплексным загрязнителем, эффект от которого определяется количеством, составом и свойствами ее как органических, так и неорганических составляющих (тяжелые металлы и их соли, соединения ртути, серы, урана и пр.).

Изменение морфологии и физико-химических свойств почвы под действием нефти. После попадания нефти и нефтепродуктов наблюдается более темное окрашивание верхних горизонтов и мозаичность изменения морфологического строения в результате неравномерного распределения нефти в толще почвы [1–3]. Под действием загрязнения происходит трансформация гранулометрического состава – важнейшей генетической и агрономической характеристики почвы, влияющей на ее плодородие. Почвенные частицы покрываются нефтяной пленкой и происходит их агрегирование. Поровое пространство заполняется нефтепродуктами, которые вытесняют воздух и нарушают аэрацию. Создаются анаэробные условия, повышающие восстановленность почвы и снижение ее окислительного потенциала, что может приводить к развитию процессов оглеения и даже поверхностному заболачиванию почв [3, 4]. На формирование восстановительных условий также влияет увеличение содержания органического вещества (связанное с поступлением в почву компонентов нефти), при разложении которого расходуется кислород.

Уменьшение степени дисперсности меняет характер границ между горизонтами, некоторые из которых могут полностью деградировать. В верхних слоях образуется битуминозная корка, препятствующая росту растений и просачиванию воды вглубь [2].

Гранулометрический состав определяет все физические показатели почвы: порозность (пористость), влагоемкость, водопроницаемость, аэрацию, теплоаккумуляцию и теплопроводность. Из-за агрегирования частиц под действием нефти и заполнения ею наиболее крупных пор эти свойства ухудшаются [5–7]. При загрязнении нефтью и нефтепродуктами повышается содержание органического углерода, изменяется групповой и фракционный состав гумуса, количество и соотношение макро- и микроэлементов. Из-за сдвига соотношения C : N в сторону углерода нарушается азотный режим почв, благоприятный для нормального развития микроорганизмов и растений [8]. Также меняется соотношение форм азота, снижается содержание подвижных форм калия и фосфора [8–10].

Хлоридно-натриевое засоление почв, сопровождающее нефтяное загрязнение, приводит к сложной перестройке почвенно-поглощающего комплекса (ППК), в котором ионы натрия начинают вытеснять кальций и магний, преобладающие в чистой почве. Это, зачастую, является пусковым механизмом развития процесса осолонцевания почв [11]. В целом поглотительная способность почв снижается.

Выявлено неоднозначное воздействие нефти и нефтепродуктов на активность ферментов почвы, которые накапливаются в ней в результате жизнедеятельности микроорганизмов, мезофауны и корневой системы растений, а также после их отмирания. В зависимости от вида и количества загрязнителя, типа почвы, природных условий, группы почвенных ферментов и продолжительности загрязнения, ферментативная активность может, как усиливаться, так и ослабевать [4, 6, 9, 12–15].

Вместе с нефтью в почвы попадают тяжелые металлы и металлоорганические комплексы, в том числе содержащие уран, что может привести к увеличению радиоактивного фона в загрязненных местах [16, 17].

Влияние нефтяного загрязнения на почвенный микробоценоз. Важнейшим компонентом почвенных экосистем являются микроорганизмы, от деятельности которых во многом зависит способность нефтезагрязненных почв к самоочищению. Воздействие нефти на комплекс почвенных микроорганизмов может стимулировать рост определенных видов и подавлять развитие других. Углеводороды способны влиять на микроорганизмы напрямую, оказывая токсическое действие (особенно ароматические углеводороды), или опосредованно, через изменение физико-химических свойств почвы (уменьшение доступности элементов минерального питания, ухудшение водного и воздушного режимов и др.). В результате поступления нефти изменяется общая численность и структура микробного сообщества, а его состав и степень разнообразия зависят как от вида, концентрации и длительности воздействия загрязнителя, так и от типа почвы и состояния микробоценоза до начала попадания в него поллютаната [18–23]. В целом, при небольших дозах уменьшается численность целлюлозолитических микроорганизмов и бактерий, использующих минеральные формы азота, и возрастает количество углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ), но также возможна стимуляция развития каждой составляющей микробного ценоза [20, 21]. При высоком содержании поллютанта снижается видовое разнообразие и плотность всех групп микроорганизмов. Чаще всего наблюдается следующая закономерность в развитии сообщества после поступления нефти: вначале происходит угнетение групп микроорганизмов, восприимчивых к загрязнению, и усиление деятельности УОМ, потом, по мере снижения количества углеводородов в почве, активизация микроорганизмов, жизнедеятельность которые ранее была подавлена. Далее, с увеличением срока давности загрязнения и по мере снижения его концентрации начинается постепенное восстановление сообщества почвенных микроорганизмов, близкого к исходному [18, 20, 21, 24–26].

Грибные сообщества оказались, в целом, более устойчивыми к воздействию нефтяного загрязнения, чем бактериальные. Однако и для них характерны те же процессы – элиминация чувствительных видов и доминирование углеводородокисляющих групп; подавление роста, а также снижение разнообразия грибных комплексов по сравнению с фоновыми почвами при высоких концентрациях нефти и стимулирование развития при небольшой концентрации поллютанта [27]. Наиболее распространенными в почвах, содержащих нефть и нефтепродукты, являются представители родов Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Candida, Mucor, Rhizopus, Alternaria и Trichoderma [27–34]. Отмечается тенденция к накоплению в нефтезагрязненных почвах фитопатогенных и потенциально опасных для человека и животных видов микромицетов [35, 36].

Реакция растений на поступление нефти в почву. Установлено, что нефть и нефтепродукты неоднозначно влияют на растительные организмы. Этот процесс такжезависит от типа, концентрации, продолжительности воздействия загрязнителя, а также вида растений, почвенно-климатических условий и агрохимического фона. Невысокие концентрации могут даже стимулировать рост растений, увеличивая всхожесть, длину надземной и подземной части, биомассу, ассимиляционную поверхность и содержание хлорофилла в листьях [37–42]. Более высокое содержание поллютанта снижает скорость прорастания и количество семян, тормозит рост и смещает фазы развития растений [38, 39, 42–46].

Положительное влияние нефти может объясняться действием стимуляторов роста растений, содержащихся в ней, улучшением питания растений за счет разложения ее органических компонентов и уменьшением конкуренции между ними из-за прореживания травостоя при поступлении в почву поллютаната [47]. Отрицательное воздействие нефти имеет как прямой, так и опосредованный характер. Прямое токсическое воздействие нефти проявляется в быстром разрушении тканей растений и зависит от ее фракционного состава, особенно от содержания ароматических углеводородов. Отмечаются многочисленные изменения в морфологическом строении растений, выросших в грунтах, загрязненных углеводородами [45, 46, 48, 49]. Нефть может изменять среду обитания растений путем ухудшения воздухообмена, гидрофобизации почвенных частиц, увеличения глыбистости почвы и др., или провоцировать нарушения функционирования почвенного биоценоза, отрицательно сказывающееся на растениях. Например, при нефтяном загрязнении отмечается возрастание количества почвенных грибов, продуцирующих токсины, которые угнетают и вызывают гибель растений [50, 51].

Противоречивые данные об ответных реакциях растений на нефтяное загрязнение свидетельствуют о большей значимости опосредованного влияния, так как оно, в отличие от прямого действия, обусловлено множеством экологических факторов и может значительно варьировать в зависимости от окружающих условий.

Содержание и развитие растений в присутствии нефти и нефтепродуктов приводит к нарушению их морфо-физиологической и генетической стабильности. Это проявляется во всевозможных эффектах отдаленного действия и последействий, а также в различных компенсаторных реакциях в условиях хронического загрязнения [48]. Степень выраженности нарушений увеличивается при действии нефти с высоким содержанием ароматических углеводородов. Максимальный угнетающий эффект выявлен при учете показателей развития корневой системы (смена мочковатой корневой системы на стрежневую, редукция корневых волосков, утолщение эпидермы, возрастание числа ксилемных элементов и пр.) [38, 49]. Нефть оказывает повреждающее действие и на клеточном уровне – у растений в условиях нефтезагрязнения зафиксировано увеличение содержания шиффовых оснований и уменьшение концентрации флавоноидов и фенольных соединений в клетках, снижение количества пигментов в ассимилирующих органах растений, приводящее к падению активности процессов фотосинтеза и, как следствие, минимизации прироста органического вещества [45, 46, 52–57].

Было установлено отрицательное влияние контаминации углеводородами на состояние фитоценозов, которое проявляется в снижении общего проективного покрытия, уровня видового и генетического разнообразия, продуктивности и запасов фитомассы, а также в смене одних экоморфных групп другими [55, 56, 58].

Одни и те же концентрации нефти и нефтепродуктов в одних и тех же условиях неодинаково действуют на различные растения. В результате многочисленных исследований было выявлено большое количество видов, которые можно использовать для фиторемедиации нефтезагрязненных почв. Среди них встречаются дикорастущие и окультуренные [59–61], как травянистые, так и древесные виды [62, 63].

В целом, можно утверждать, что нефть и нефтепродукты в подавляющем большинстве случаев негативно воздействуют на все свойства почвы. Под влиянием этих поллютантов происходит ухудшение ее морфологических, физико-химических и химических характеристик; уменьшение ее аэрируемости и дренажа, снижение биологической активности и способности к самоочищению и самовосстановлению; нарушение экологического равновесия в почвенном биоценозе; деградация растительного покрова и депрессия функциональной активности флоры и фауны; выведение большого количества земель из сельскохозяйственного оборота вследствие снижения или полной потери их продуктивности. В результате нарушения почвенного покрова и растительности усиливаются нежелательные природные процессы – эрозия, деградация, криогенез, которые приводят к снижению или полной потере плодородия почвы.

РЕКУЛЬТИВАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ

Естественное самоочищение почвы от антропогенного загрязнения – длительный процесс, особенно в регионах с умеренным и холодным климатом. Поэтому для ликвидации последствий нефтяного воздействия и мобилизации внутренних ресурсов экосистемы на восстановление своих первоначальных свойств и функций применяют рекультивацию. Под этим термином понимают мероприятия по предотвращению деградации земель и (или) восстановлению их плодородия посредством приведения в состояние, пригодное для использования в соответствии с целевым назначением. Сроки и методы рекультивации зависят от масштабности и характера загрязнения, давности разлива, типа загрязненной территории, степени ее биологической активности и состояния растительности на конкретном участке. Как правило, рекультивационные мероприятия проводят в два этапа: технический и биологический.

Технический этап рекультивации почвы. После нефтяного разлива предусматривается комплекс работ по максимальному сдерживанию распространения загрязнения, а также организация рельефа и ландшафта затронутой территории, позволяющеая максимально оперативно провести работы по ликвидации аварийной ситуации и рекультивации нарушенных грунтов. В рамках данного обзора мы не будем подробно останавливаться на этом этапе рекультивации, выполняемом с помощью механических и физико-химических методов. Недостатком первых является невысокая степень очистки, а вторых – значительные экономические, энергетические затраты и сложное аппаратурное оформление. Обе группы методов негативно воздействуют на окружающую среду, что проявляется в уничтожении плодородного слоя почвы, трансформации одних веществ в другие, вред от которых иногда оказывается еще больше, чем возможный ущерб от загрязнения нефтью, а также в образовании вторичных отходов, в свою очередь, нуждающихся в утилизации [64].

Биологический этап рекультивации. Его целью является возвращение нефтезагрязненным землям хозяйственной и экологической ценности путем улучшения их агрофизических, агрохимических, биохимических и других свойств и создания условий для последующего восстановления видового разнообразия флоры и фауны. Это достигается с помощью комплекса агротехнических, агрохимических, биотехнологических и фитомелиоративных мероприятий. Иногда для улучшения качества очистки допустимо предварительное разбавление сильно загрязненного грунта чистой почвой, песком, опилками или соломой.

Темпы биодеградации углеводородов зависят от множества факторов, и для увеличения эффективности процесса требуется оптимизация условий для роста и развития микроорганизмов и растений, для чего применяют различные агротехнические и агрохимические приемы. Например, для улучшения водно-воздушного режима рекультивируемого грунта, разрушения битумных корок на поверхности почвы и измельчения отмершей древесно-кустарниковой растительности используют такие приемы механической обработки как рыхление, фрезерование и др. Важную роль при биоразложении нефти и нефтепродуктов играет кислотность нефтезагрязненных почв [65, 66], влажность [67], температура [64, 68, 69], наличие биогенных элементов (азот, фосфор, калий) [65, 70–72].

Кроме вышеперечисленного, на процесс биодеструкции нефти в почве влияют такие факторы как деятельность эндогенной микробиоты, концентрация, химическая структура и биодоступность поллютанта, а также возраст загрязнения [64, 69].

ОЧИСТКА НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОЙ ПОЧВЫ С ПОМОЩЬЮ МИКРООРГАНИЗМОВ

Одновременно с агротехническими мероприятиями по улучшению свойств почвы или сразу после них приступают к биоремедиации, под которой понимают комплекс методов очистки, основанный на использовании биохимического потенциала биологических объектов (микроорганизмов, водорослей, высших растений, червей) для детоксикации поллютантов или снижения их концентрации в окружающей среде [73, 74]. Преимущество биоремедиационных технологий связано с возможностями живых организмов, особенно микроорганизмов, метаболизировать в той или иной степени огромное число различных органических веществ, а также с их безопасностью для экосистем и отсутствием в результате их деятельности вторичных отходов и загрязнителей [73, 75]. Кроме того, стоимость биоремедиации намного меньше по сравнению с механическими и физико-химическими способами [76]. К недостаткам биологических процессов очистки и восстановления почв относятся невысокая скорость биодеградации токсиканта и зависимость от почвенных и климатических условий.

Ведущую роль в процессе биоремедиации играют микроорганизмы, способные утилизировать углеводороды в процессе своей жизнедеятельности [74, 77–81]. Это свойство связывают с наличием у них ферментной системы оксигеназ, позволяющей им включать молекулярный кислород непосредственно в углеводород, образуя при этом окисленные соединения. В результате этого углерод из нефти и нефтепродуктов частично преобразуется в углекислый газ, метан, частично переходит в биомассу клеток, частично трансформируется в гумус и закрепляется в почве [82]. При биоремедиации нефтезагрязненных почв посредством микроорганизмов используют два основных приема [69, 83, 84]:

– биостимуляция – активация эндогенных углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) путем внесения удобрений (минеральных и органических) и агротехнических приемов (рыхление, полив, добавление структураторов и пр.);

– биоаугментация (биодополнение) – внесение культур УОМ (в основном в виде биопрепаратов). Применение интродукции целесообразно, когда численность аборигенных микроорганизмов мала или они не способны к деградации всего спектра (или его большей части) углеводородсодержащих веществ, входящих в состав загрязнителя, или процесс его разложения протекает с низкой скоростью, что характерно для регионов с холодными климатическими условиями. Также внесение дополнительного количества микроорганизмов необходимо в случаях аварийных разливов, когда местная микробиота испытывает токсический шок от залпового воздействия поллютанта. В рамках данного обзора основное внимание будет уделено именно этому направлению биоремедиации.

В нашей стране разработано большое число биопрепаратов-нефтедеструкторов [85, 86], но большинство из них не применяется, некоторые не запатентованы, а по другим имеются сведения только рекламного характера. Многие биопрепараты рекомендованы не только для очистки почвы, но и для водных сред, а также для обезвреживания нефтяных шламов. Основой биопрепаратов являются один или несколько штаммов микроорганизмов-деструкторов, эффективно разлагающих углеводороды нефти. Также в состав могут входить сорбенты, носители, стабилизаторы, консерванты, ферменты, поверхностно-активные вещества, различные органические и минеральные вещества. В последнее время все чаще используют биопрепараты, состоящие из нескольких штаммов, т.к. монокультура УОМ не обладает всем набором ферментов, необходимых для полного разложения такого сложного многокомпонентного загрязнителя как нефть. К тому же, монобактериальные препараты характеризуются достаточно узким интервалом температуры, рН, солености и концентрации поллютанта, оптимальным для активности микроорганизмов. Полибактериальные препараты, содержащие штаммы, относящиеся к разным таксономическим группам и отличающиеся по скорости роста, спектру потребляемых субстратов и особенностям метаболизма, имеют более широкие адаптационные и экологические возможности. Также между членами ассоциации возможны синергетические взаимодействия. Таким образом, при применении микробных ассоциаций (консорциумов), как природных, так и искусственно разработанных, биодеградация нефти происходит полнее и за меньшие сроки [65, 87–91].

Из-за сложного состава нефти, который сильно варьирует в зависимости от месторождения, различий химических свойств нефти и нефтепродуктов, а также по причине неодинаковых природно-климатических и гидротермических условий районов добычи, переработки и хранения нефти и ее производных, невозможно создание какого-то одного универсального биопрепарата-нефтедеструктора. Поэтому работы по созданию биопрепаратов для очистки окружающей среды от углеводородного загрязнения и разработке технологий их применения по-прежнему будут оставаться актуальными.

ПРИМЕНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ С ЗАДАННЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ

Использование биосурфактантов и микроорганизмов, их продуцирующих. Основной причиной, которая затрудняет микробиологическое разложение нефтепродуктов, является гидрофобность молекул углеводородов, приводящая как к их сорбции на различных поверхностях и переходу в биологически труднодоступную форму, так и к невозможности эффективного контакта с микробными клетками, имеющими, как правило, гидрофильную внешнюю оболочку. Устранить это препятствие способны биосурфактанты – разнообразные поверхностно-активные вещества, синтезируемые микроорганизмами. Механизм их действия связан с процессами десорбции органических загрязнителей и их переводом в водную фазу и, как следствие, повышением их биодоступности для микроорганизмов, а также с модификацией внешней поверхности бактерий путем гидрофобизации для обеспечения лучшего контакта с молекулами углеводородов [92, 93].

Способность к образованию биоПАВ выявлена у широкого круга микроорганизмов – это представители родов Rhodococcus, Acinetobacter, Pseudomonas, Candida, Nocardia, Bacillus, Torulopsis, Ochrobactrum, Gordonia, Burkholderia и др. [94–102].

В отличие от своих синтетических аналогов, биосурфактанты менее токсичны, обладают высокой биоразлагаемостью и быстро элиминируются в окружающей среде, активны в меньших концентрациях, синтезируются микроорганизмами из возобновляемого сырья (например, из отходов пищевой промышленности), а также не теряют активность при экстремальных значениях температуры, солености и рН [94, 103–105]. На цену биосурфактантов очень большое влияние оказывает необходимость проведения стадии очистки биотехнологического продукта, на которую может приходиться до 60% от общей стоимости производства. Но эту высокозатратную операцию вполне можно исключить, когда биосурфактанты применяют в экологической биотехнологии или в нефтяной и нефтехимической промышленности [93, 100].

Описаны примеры успешного применения биосурфактантов для очистки песка, загрязненного моторным маслом [106]; деградации пирена [102], керосина и дизельного топлива [107, 108], сырой нефти в почве [109] и жидкой среде [110], (ПАУ) [96], в частности, таких как нафталин и фенантрен [111]. Разработано множество микробных ассоциаций и даже биопрепаратов, содержащих микроорганизмы-продуценты биоПАВ, для очистки почв и грунтов от нефтяных загрязнений [87, 112, 113].

Несмотря на многочисленные научные статьи, касающиеся биодеградации углеводородов с помощью бактерий, синтезирующих биосурфактанты, в литературе отсутствуют упоминания об успешной коммерческой биоремедиации, связанной с применением биосурфактантов. Мало что известно о продукции таких веществ микроорганизмами in situ. Большинство описанных исследований проводились в лабораторных условиях, где использовался единственный источник загрязнения. Для эффективного применения этих соединений в процессах очистки окружающей среды требуется дополнительная информация о структуре биосурфактантов, их взаимодействии с почвой и загрязняющими веществами, влиянии на аборигенную микробиоту, а также разработка методик контроля их содержания в почве и новых технологий экономически выгодного производства [95, 114].

Азотфиксирующие микроорганизмов и их роль в очистке и восстановлении окружающей среды. Скорость биодеструкции нефти и нефтепродуктов зависит от обеспеченности УОМ микроэлементами, важнейшим среди которых является азот. Для ликвидации его дефицита, возникающего при попадании нефти в почву, чаще всего используют большие объемы минеральных азотных удобрений, что является экономически невыгодным и даже экологически небезопасным [64, 115]. Поэтому представляется целесообразным внесение в загрязненную углеводородами почву штаммов бактерий, способных не только к деградации ксенобиотиков, но и к диазотрофии. К их числу относятся многие представители рода Azotobacter, которые могут усваивать углеводороды в качестве единственного источника углерода и энергии, как в присутствии связанного азота, так и при азотфиксации [116, 117]. Показано, что использование микроорганизмов, фиксирующих азот, таких как Azotobacter sp., Bacillus polymyxa и C-hroococcus sp. для ускорения биоремедиации загрязненной сырой нефтью почвы было более эффективно, чем применение комплексного минерального удобрения (N : P : K 15 : 15 : 15) [118]. Продемонстрировано, что представители родов Pseudomonas, Enterobacter, Stenotrophomonas, Bacillus, Burkcholderia, выделенные из нефтехимических шламов, обладают помимо высокой азотфиксирующей активности еще и способностью метаболизировать основные группы соединений, содержащиеся в шламе – алифатические и полиароматические углеводороды, фенолы, гликоли [119]. Предложено использовать свободноживущие азотфиксирующие бактерии родов Acinetobacter, Achromobacter, Alcaligenes и Arthrobacter, выделенные из различных образцов нефзагрязненных почв, в процессе биоремедиации в качестве биоудобрений для увеличения содержания азота, а саму сырую нефть рассматривать как источник углерода и энергии для роста диазотрофных микроорганизмов [120].

Есть сообщения о том, что в ризосфере растений, выращенных в нефтезагрязненной почве, присутствуют свободноживущие азотфиксирующие бактерии Clostridium pasteurianum, B. polymyxa, Pseudomonas aeruginosa, Azotobacter sp., Klebsiella pneumoniae и Derxia gummusa, деградирующие углеводороды [121].

Имеются сведения о том, в прибрежных и пустынных почвах Кувейта, особенно в тех, что имеют давнюю историю нефтяного загрязнения, присутствуют в больших количествах бактерии (10⁷–10⁸ КОЕ/г), обладающие целым комплексом свойств, таких как способность к деградации нефти, фиксации азота и устойчивость к ртути. Наибольший интерес среди них представляют штаммы Pseudomonas stutzeri, P. pseudoalcaligenes, P. рutida, Citrobacter freundii, Citrobacter sp., Exiguobacterium aurantiacum, которые предлагается использовать для биоремедиации пустынной нефтезагрязненной почвы, крайне бедной азотом [122].

В лабораторных опытах по биоремедиации почвы, загрязненной сырой нефтью, установлена высокая эффективность деградации поллютанта диазотрофными бактериями Paenibacillus polymyxa, P. lautus, Bacillus sp. и Brevibacillus agri [123]. Были проведены успешные эксперименты по интродукции в нефтезагрязненную почву свободноживущих азотфиксирующих бактерий, выделенных из мест, длительно контаминированных нефтью и нефтепродуктами. Предложено использовать эти микроорганизмы для обработки бедных азотом почв, загрязненных углеводородами [124].

Психротолерантные микроорганизмы для очистки от нефтяного загрязнения в условиях умеренного и холодного климата. Значительное число нефтедобывающих предприятий России сосредоточено на севере европейской части страны и в Западной Сибири в зоне умеренного и холодного климата. В этих регионах самоочищение почво-грунтов от нефтяного загрязнения с помощью эндогенной углеводородокисляющей микробиоты лимитируется неблагоприятными почвенно-климатическими факторами – низкими среднегодовыми температурами, слабым влиянием физико-химических факторов разложения (солнечное излучение, интенсивность испарения летучих фракций углеводородов), малым содержанием питательных веществ, повышенной концентрацией соли, недостатком аэрации и др. Кроме того, характерной чертой северных экосистем является наличие многолетнемерзлых пород, небольшая мощность гумусового горизонта, невысокая биологическая активность почв, относительная обедненность видового состава растений, микроорганизмов и почвенных животных. В таких условиях наиболее эффективным приемом очистки является внесение психротолерантных (психроактивных) микроорганизмов, способных расти при низкой положительной температуре, приспособленных к сезонным колебаниям температур и обладающих достаточной деструктивной активностью по отношению к поллютантам. Интродукция таких микроорганизмов позволит продлить период биорекультивации на несколько месяцев.

В нашей стране разработке способов биоремедиации с помощью психротолерантных микроорганизмов уделяется большое внимание. Так, например, в ходе масштабного скрининга выделено 220 штаммов УОМ, из которых отобрано 15 наиболее эффективных психротолерантных штаммов, образующих биоэмульгаторы и способных к деградации высоких концентраций нефти и нефтепродуктов (до 30%) в присутствии соли в температурном диапазоне от 4 до 42°С при значениях рН 4–10. Штаммы принадлежат к родам Rhodococcus, Pseudomonas, Acinetobacter, Micrococcus и Serratia. На основе различных комбинаций этих микроорганизмов разработаны биопрепарат “МикроБак” и микробная ассоциация “ВиO” для биоремедиации почв и водных экосистем [112, 113, 125, 126].

Из природных биоценозов Сибири выделены 424 штамма психротолерантных и галотолерантных (5–10% NaCl) микроорганизмов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов при низких положительных температурах. Из наиболее эффективных штаммов-деструкторов нефтепродуктов Yarrowia lipolytica, Enterobacter sp., Acinetobacter junii, A. calcoaceticus, Pseudomonas sp. были составлены различные ассоциации, которые можно использовать для разработки препаратов для биоремедиации почвы и воды в регионах с холодным климатом [127–129].

Микробная ассоциация ДТА-1, составленная из психротолерантных УОМ родов Pseudomonas, Enterobacter, Bacillus и Acinetobacter, рекомендована для создания на ее основе биопрепарата-нефтедеструктора для очистки северных территорий [130]. Кроме микробных композиций для целей экологической биотехнологии предлагаются и индивидуальные запатентованные штаммы-нефтедеструкторы, относящиеся к различным родам: Pseudomonas [131], Exiguobacterium [132], Bacillus [133], Rhodococcus [134, 135], Arthrobacter [136] и др. В Уфимском институте биологии УФИЦ РАН был открыт и таксономически узаконен новый вид микроорганизмов Pseudomonas turukhanskensis. Типовой штамм P. turukhanskensis ИБ 1.1 является психротолерантным и служит основой коммерческого биопрепарата “Ленойл”® – NORD, СХП (сухая препаративная форма), предназначенного для очистки почв от нефти и нефтепродуктов в условиях Западной Сибири [137, 138].

Микробно-растительные ассоциации как перспективное направление экологической биотехнологии. Одним из приемов стимуляции разложения нефти в почве является применение микробно-растительных комплексов. В основе их действия лежит ризодеградация – деструкция токсикантов ассоциированными с корнями растений микроорганизмами [139–142]. Корни растений обеспечивают поверхности для прикрепления микроорганизмов и выделяют экссудаты – внеклеточную жидкость, содержащую ферменты, сахара, аминокислоты, органические кислоты, стимуляторы роста, различные вторичные метаболиты и т.д. Их наличие создает оптимальные условия существования и размножения микроорганизмов, количество которых в ризосфере намного выше, чем в окружающей почве [49, 143]. Кроме того, корни подготавливают питательные компоненты и другие субстраты, повышая эффективность их усвоения и, по возможности, при помощи экссудатных ферментов, осуществляя деградацию органических субстратов, находящихся в почве, в более низкомолекулярные и легкоусвояемые микроорганизмами соединения. Последние, в свою очередь, увеличивают катаболическую активность в прикорневой зоне и могут усиливать рост растений путем выделения различных биологически активных веществ (фитогормонов, витаминов, вторичных метаболитов и пр.), улучшения фосфорного и азотного питания и повышения стрессоустойчивости, а также опосредованной стимуляции за счет антагонизма в отношении фитопатогенных агентов [144–147]. В основном в прикорневой зоне растений, произрастающих в почвах, загрязненных углеводородами, встречаются представители родов Pseudomonas, Arthrobacter, Flavobacterium, Bacillus, Achromobacter, Rhizobium. Микробно-растительные ассоциации и симбиозы, обладающие гибким метаболизмом и уникальными ферментными системами, имеют большие преимущества при выживании в неблагоприятных условиях окружающей среды, обусловленные не только повышенной толерантностью к ксенобиотикам, но и способностью к активному удалению токсикантов из сферы обитания [148–150]. Используя микробно-растительные взаимодействия можно ускорить очистку и восстановление почв, загрязненных не только нефтью и нефтепродуктами, но и ПАУ (полициклические ароматические углеводороды), синтетическими ПАВ (поверхностно-активные вещества), хлор-, нитро- и фосфорорганическими соединениями, а также другими органическими поллютантами [49, 139, 143, 151–154].

Разработаны эффективные биоремедиационные комплексы для очистки почвы от нефти, состоящие из микроорганизмов Azospirillum braselense SR80, продуцирующих индолилуксусную кислоту (ИУК), смеси бобовых и злаковых культур [155, 156]; Candida maltosa 569 и люцерны [157]; бактерий P. aeruginosa AS03 или P. aeruginosa NA108, обладающих антигрибной активностью, и чайных растений [158]; R. erythropolis CD106 и райграса [159]; R. erythropolis ВКМ Ас-2017Д и люцерны или пшеницы [160]; Acinetobacter sp. S-33 и люцерны [161]. Хорошие результаты были достигнуты при очистке песка, загрязненного фенантреном, с помощью комплекса бактерий Sinorhizobium meliloti P221, синтезирующих ИУК, и смеси бобовых и злаковых растений [162]. Инокуляция семян растений диазотрофной бактерией P. stutzeri KOS6 – деструктором углеводородов и продуцентом ИУК, способствует увеличению длины корней и роста побегов растений, общей биомассы в условиях развития на нефтехимическом шламе, содержащем тяжелые металлы, а также приводит к снижению в нем содержания поллютантов [163].

В микробно-растительные комплексы для биоремедиации почв могут входить не только индивидуальные штаммы, но и их композиции. На основе уже упомянутого консорциума “ВиО”, состоящего из плазмидосодержащих углеводородокисляющих бактерий R. erytropolis S26, A. baumannii 1B, P. putida F701, A. baumannii 7 создана микробная ассоциация “ВиО”-ячмень [126, 164]. Предложена микробно-растительная ассоциация, в которой в качестве фитоэкстрагента используется люцерна посевная, а микробный компонент состоит из штаммов азотфиксирующих бактерий Sinorhizobium meliloti S3 и фосфатмобилизующих Serratia plymuthica 57. Оба штамма также продуцируют ИУК [165]. Разработан комплекс для биоремедиации, включающий микроорганизмы биопрепарата-нефтедеструктора “Деворойл” (представители родов Rhodococcus, Pseudomonas, Candida) и многолетние травянистые растения (тимофеевка или клевер) [166]. Проверена эффективность применения для биремедиации ассоциации на основе Pseudomonas delhiensis B-11400, клубеньковых бактерий Rhizobium lotus RL-5 и растений лядвенца [167].

Исследована возможность повышения эффективности очистки почвы от нефтезагрязнения при использовании трансгенных растений и их комплекса с микроорганизмами. При совместном применении трансгенной люцерны с геном rhlA, ответственным за синтез биосурфактанта рамнолипидной природы, и Candida maltosа степень деградации поллютанта повысилась до 86% [168].

Как видно из приведенных примеров, в настоящее время активно проводится изучение потенциала микробно-растительных комплексов для очистки почвы от нефтяного загрязнения. Дальнейшие исследования взаимного влияния поллютанта, аборигенных или интродуцированных микроорганизмов-деструкторов и растений-ремедиантов будут способствовать созданию надежных и высокоэффективных технологий биоремедиации окружающей среды.

* * *

Загрязнение экосистем нефтью является глобальной экологической проблемой и будет оставаться таковой еще очень долгое время. Это связано с тем, что указанные вещества служат основным источником энергии на планете, а также со способностью углеводородов достаточно быстро распространяться во всех природных средах. К настоящему времени накоплен большой массив сведений о воздействии таких поллютантов на различные природные объекты. Показано, что контаминация углеводородами в целом отрицательно влияет на весь комплекс морфологических, физико-химических и биологических свойств почвы, определяющих ее плодородие и экологические функции. Попадание нефти приводит к изменению численности популяций и структуры биоценозов. В ряде случаев, в малых концентрациях она способна стимулировать активность некоторых почвенных ферментов, усиливать рост и развитие определенных видов микроорганизмов и растений.

Самоочищение окружающей среды от нефтяного загрязнения – достаточно длительный процесс, особенно в регионах с холодным климатом, поэтому необходимо применение методов очистки, среди которых наиболее экологически безопасными и экономически целесообразными являются биоремедиационные, базирующиеся на возможности живых организмов (растений, животных, микроорганизмов) использовать нефть и нефтепродукты в процессе своей жизнедеятельности. Основную роль в этом играют микроорганизмы, окисляющие углеводороды до конечных продуктов – углекислого газа и воды. Применение микроорганизмов, обладающих помимо способности к деградации поллютантов дополнительными свойствами, например такими, как продукция биосурфактантов, снижающих гидрофобность молекул углеводородов, способность к диазотрофии и обогащению рекультивируемой почвы азотом, приспособленность к низким положительным температурам и образование биоремедиационных комплексов с растениями, является перспективным направлением экологической биотехнологии. Несмотря на большое количество уже разработанных биопрепаратов-нефтедеструкторов, работы в этом направлении по-прежнему актуальны, что связано со сложностью и многокомпонентностью состава нефти и нефтепродуктов, а также с неодинаковыми природно-климатическими условиями районов добычи и переработки.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ № 18-29-05025/18.