Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 4, стр. 378-385

МЕТОДИКА

Образцы почв и донных отложений. В районе разработок ВКМС на территории промышленных площадок Березниковского калийного производственного рудоуправления “Уралкалий” (БКПРУ-3, г. Березники, Россия), были отобраны образцы шламов и почв, а также образцы донных отложений сточного канала предприятия “Промканал” (г. Березники), рассолосборника у солеотвала БКПРУ-3 и реки Зырянки, протекающей в непосредственной близости от предприятия БКПРУ-1. Определение концентрации катионов Na⁺, K⁺, Ca^2+, Mg²⁺, органических загрязнителей, а также общей минерализации в отобранных образцах (табл. 1) проводили общепринятыми методами, как описано в работе [17].

Среды и условия культивирования. Для выделения бактерий-деструкторов фталатов использовали метод накопительных культур (НК). Исследуемые образцы весом 1 г помещали в колбы объемом 250 мл со 100 мл минеральной среды Раймонда (МСР) [18] с добавлением NaCl (30 г/л) и ОФК (1 г/л) в качестве субстрата. Культивирование осуществляли в течение 2 нед. при температуре 28°С.

Чистые культуры бактерий выделяли путем высева суспензии полученных НК на агаризованную богатую среду Раймонда (БСР) с добавлением триптона и дрожжевого экстракта (5 и 2.5 г/л, соответственно) с 30 г/л NaCl. Для исследования отбирали бактерии, различающиеся морфологией колоний, которые в дальнешем проверяли на способность к росту на ОФК (1 г/л) в жидкой МСР.

ДНК-типирование. Штаммы бактерий-деструкторов ОФК, характеризующиеся одинаковой морфологией колоний и ростом в жидкой МСР с ОФК (1 г/л), определяли с использованием молекулярно-генетического метода REP-ПЦР (полимеразная цепная реакция повторяющихся экстрагенетических палиндромных последовательностей ДНК) с использованием праймеров REP 1R (5'-IIIICGICGICATCIGCC-3') и REP 2I (5'-ICGICTTATCIGGCCTAC-3') в соответствии с методикой [19]. Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1.5% агарозном геле в 1 × ТБЭ-буфере (трис-борат-ЭДТА) в течение 2 ч при напряжённости электрического поля 5.7 V/см [20].

Идентификацию бактерий. Идентификацию осуществляли на основании анализа генов 16S рРНК. Амплификацию гена 16S рРНК проводили с использованием бактериальных праймеров 27F (5'-AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3') и 1492R (5'-АСGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3') на амплификаторе My Cycler “Bio-Rad Laboratories” (США) согласно описанию [21]. Определение нуклеотидных последовательностей проводили с применением набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v. 3.1 (“Thermo Fisher Scientific”, США) на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL “Applied Biosystems” (США) согласно рекомендациям производителя.

Филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей 16S рДНК проводили с использованием программ CLUSTAL W (http://www.ebi.ac.uk/clustalw), Sequence Scanner v 2.0. Поиск гомологичных последовательностей осуществляли при использовании баз данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzBioCloud (http://www.ezbiocloud.net/identify).

Культивирование бактерий на ароматических субстратах при различном уровне осмолярности среды и рН. Рост бактерий на ОФК, ДБФ, ДЭФ и других ароматических субстратах (нафталине, бифениле, протокатеховой, салициловой, бензойной и гентизиновой кислотах) оценивали при культивировании в жидкой МСР, содержащей NaCl (30 г/л) и ароматический субстрат (1 г/л), на термошейкере при 100 об./мин и 28°С. Органические кислоты вносили в среду в виде водных растворов натриевых солей (в пересчете на кислоту – 1 г/л). Оценку роста культуры осуществляли путем измерения оптической плотности (ОП) среды на спектрофотометре UVVisible BioSpec-mini “Shimadzu” (Япония) при 600 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. При выращивании в жидких средах ОП₆₀₀ < 0.3 ед. оценивали как слабый рост, ОП₆₀₀ = (0.3 – 0.4) ед. – средний рост, ОП₆₀₀ > 0.4 ед. – хороший рост.

Способность бактерий к росту при разных условиях засоления (0 – 120 г/л NaCl) определяли на агаризованной БСР. Бактерии культивировали при температуре 28°С, рост оценивали через 3 сут по диаметру колоний. Колонии диаметром 0.1 см оценивали как слабый рост, диаметром от 0.1 до 0.2 см – как средний и диаметром от 0.2 см и выше – хороший рост.

Деструкция ДБФ и ДЭФ. Оценку разложения ДБФ и ДЭФ бактериями осуществляли методом ГЖХ-МС. Штаммы выращивали в жидкой МСР, содержащей 30 г/л NaCl и субстрат – ДБФ или ДЭФ (500 мг/л) в течение 72 ч при 28°С на роторном шейкере (150 об/мин). Клетки собирали центрифугированием (12 000 g, 5 мин) и отмывали МСР. Отмытые дважды клетки (20 мкл, ОП₆₀₀ = = 2.0) инокулировали в 2 мл МСР, содержащей ДБФ или ДЭФ (500 мг/л) не содержащей хлорид натрия, а также в присутствии 50, 70 и 90 г/л NaCl, и инкубировали при 28°С в течение 3 сут при аэрации на роторном шейкере (150 об./мин) [10]. Экстракцию ДБФ и ДЭФ осуществляли равным объемом гексана в течение 120 мин на шейкере при 100 об./мин. Остаточную воду удаляли из образцов путем введения безводного сульфата натрия. Анализ проводили на газовом хроматографе-масс-спектрометре “Agilent GC 7890A MS 5975C Inert XL EI/CI” (США) с кварцевой капиллярной колонкой HP-5MS SN US 15189741-1 (30 × 0.25 мм), газ-носитель – гелий (1 мл/мин), температура испарителя – 230°С, объем пробы – 0.2 мкл. Идентификацию хроматографических пиков проводили по временам удерживания и масс-спектрам (электронная библиотека масс-спектров NIST 98). Количество фталатов оценивали по площади пика по калибровочному графику.

Статистическая обработка результатов. Все эксперименты были выполнены в трехкратной повторности. Полученные данные обрабатывали с использованием программы Microsoft Excel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика образцов почв и донных отложений. При анализе отобранных в районе промышленных солеразработок (г. Березники) образцов установлено, что наиболее высокая минерализация (12.1%) и концентрация ионов Na⁺ (24 099.5 мг/кг) и K⁺ (11027.3 мг/кг) была обнаружена в образце, отобранном с поверхности шламохранилища БКПРУ‑3. Высокие показатели минерализации были определены в образце донных отложений рассолосборника (солеотвал БКПРУ-3) (табл. 1). Значительные концентрации органических загрязнителей, в частности фталатов (18.5 мг/кг), нафталина (105.1 мг/кг) и алканов (16 001.7 мг/кг), выявлены в образце, отобранном из донных отложений промышленного канала. Наиболее высокое содержание фталатов (40.3 мг/кг) обнаружено в образце донных отложений р. Зырянка: концентрация ДБФ в данном образце составляло 5.5 мг/кг, а бутилоктилфталата – 34.8 мг/кг (табл. 1).

Идентификация и субстратная специфичность бактерий-деструкторов ОФК. Из исследуемых образцов донных отложений, почвы и шламов, отобранных в районе промышленной добычи и переработки солей (г. Березники), методом накопительного культивирования было выделено 25 бактериальных штаммов, способных к росту в жидкой минеральной среде на ОФК (1 г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии (табл. 2).

Сходные по морфологическим признакам (морфология колоний) и выделенные из разных экотопов культуры были типированы методом REP-ПЦР (данные не показаны). Представители каждой геномогруппы были идентифицированы на основе анализа гена 16S рРНК. Среди изолятов выявлены представители 4 классов (Actinobacteria, Bacilli, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria) и 14 родов: Bacillus, Rhodococcus, Dietzia, Halomonas, Idiomarina, Stappia, Martelella, Erythrobacter, Alcanivorax, Marinobacter, Oceanisphaera, Pseudomonas, Nitratireductor, Breoghania (табл. 2).

Было установлено, что штаммы PP22-1, PD10-1, PD11-42, выделенные из разных экотопов, близкородственные виду Rhodococcus jialingae имеют идентичные REP-PCR профили, однако отличались по способности к утилизации нафталина и бифенила (табл. 3). Штамм Rhodococcus sp. PP22-1 обладал наиболее широкой субстратной специфичностью и был способен, кроме деструкции фталатов (ОФК, ДБФ, ДЭФ), к росту на бензоате, салицилате, гентизате, нафталине и бифениле. Грамотрицательные штаммы Martelella sp. PSH17-4, Halomonas sp. PG1 также осуществляли разложение различных ароматических соединений, используя их в качестве субстратов (табл. 3). Штаммы PB8-4 и PD11-41, проявляющие наибольшее филогенетическое сходство с видом Erythrobacter citreus (99.53 и 99.3%, соответственно), принадлежали к разным геномогруппам по результату анализа REP-PCR и росли на различных по химической природе субстратах (ДБФ, ДЭФ, нафталин, гентизат). Штаммы PD13-22, PB8-2, PD11-22, близкородственные виду Bacillus vietnamensis и выделенные из донных отложений промканала, реки Зырянка и ризосферной почвы, образуют одну геномогруппу. В тоже время данные штаммы отличались по способности к утилизации ароматических субстратов (ДБФ, ДЭФ, нафталина, салицилата, бензоата) (табл. 3).

Отношение бактерий-деструкторов ОФК к засолению и рН среды. Большинство изолированных штаммов-деструкторов ОФК были способны к росту как в среде без добавления соли, так и при повышенном засолении среды (до 90–120 г/л NaCl) (табл. 4) и были отнесены к галотолерантным микроорганизмам [22]. Штамм Idiomarina sp. PSH17-1 (наибольшее сходство по гену 16S рРНК с Idiomarina fontislapidosi F23^T), изолированный из шламохранилища соледобывающего предприятия, не был способен к росту без NaCl в среде культивирования.

Все изоляты росли в диапазоне рН 6–8. Штаммы Oceanisphaera sp. PP23-2 и Rhodococcus sp. PP22-1 – алкалофильные бактерии, способные к росту при рН среды выше 9. Штаммы Dietzia sp. 1BR, Rhodococcus sp. PD10‑1, Idiomarina sp. PD10-2 и Martelella sp. PSH17-4 росли на БСР при рН 5.0.

Деструкция ДБФ и ДЭФ. Восемь штаммов-деструкторов ОФК активно росли на ДБФ и ДЭФ, используя эти субстраты в качестве единственного источника углерода и энергии (табл. 3). Эти штаммы исследовали более подробно. Показано, что отобранные штаммы-деструкторы способны к росту на протокатеховой кислоте (ПКК) – основном метаболите, образующемся при деструкции ОФК (табл. 3). Из литературных источников известно, что дальнейшее разложения ПКК осуществляется при расщеплении ароматического кольца по мета- или орто-пути до основных метаболитов клетки [1, 14].

Было изучено влияния засоления среды на деструкцию ДБФ и ДЭФ у активных бактерий-деструкторов (табл. 5, 6). Показано, что большинство штаммов (Halomonas sp. PG1, Pseudomonas sp. PG2, Oceanisphaera sp. PP23-2, Dietzia sp. 1BR, Rhodococcus sp. PP22-1) в течение 72 ч утилизировали от 90.6 до 98.6% ДБФ в среде без добавления соли и при содержании NaCl в среде 50 г/л. Повышение содержания NaCl в среде до 70 г/л существенно не влияло на деструкцию ДБФ данными штаммами. У штамма Oceanisphaera sp. PP23-2 повышение концентрации соли приводило к снижению степени деструкции ДБФ до 79.6 и 75.7% при 70 и 90 г/л NaCl соответственно. Утилизация ДЭФ этими штаммами составляла от 62.0 до 79.0% при содержании NaCl в среде до 70.0 г/л (табл. 6). Существенное снижение степени разложения ДЭФ для исследуемых штаммов наблюдалось при концентрации NaCl 90 г/л (до 46–65%).

У штамма Rhodococcus sp. PD10-1 показатели утилизации ДБФ были выше при содержании соли в среде 50 и 70 г/л − (90 и 98.9% соответственно), по сравнению с экспериментом, где соль не добавляли, или вносили 90 г/л NaCl (78.2 и 80% соответственно). Наиболее высокие значения утилизации ДЭФ для данного штамма наблюдали в присутствии 50 и 70 г/л NaCl (65.0 и 68.6% соответственно).

Штаммы-деструкторы рода Martelella демонстрировали более низкие показатели деструкции обоих субстратов по сравнению со степенью деструкции фталатов другими штаммами, как при отсутствие соли в среде культивирования, так и при всех исследуемых повышенных концентрациях (табл. 5, 6).

Способность к утилизации ДБФ и ДЭФ показана для различных по таксаномической принадлежности бактерий. Так, описана способность Acinetobacter lwoffii к полной деградации ДБФ (20 мг/л) в течение 5 сут, штамма Bacillus sp. SASHJ – к утилизации ДБФ (100 мг/л) в течение 3 сут, а также штамма Serratia marcescens C9 – к деструкции ДБФ (100 мг/л) за 3 сут [1, 24, 25]. Для ряда грамотрицательных штаммов описана способность к утилизации ДЭФ, в частности, для штамма Sphingomonas sp. C28242 − к деструкции ДЭФ (450 мг/л) в течении 120 ч [6], для штамма Acinetobacter sp. JDC-16 − в течении 28 ч [26]. Полная деструкция ДБФ и ДЭФ (300 мг/л) в течении 30 ч описана для штамма Variovorax sp. BS1 [27]. Исследуемые в работе штаммы утилизировали сложные эфиры фталевой кислоты − ДБФ и ДЭФ при их концентрации в среде 500 мг/л как в отсутствие соли, так и в присутствии 90 г/л NaCl в среде культивирования, что позволило отнести их к эффективным деструкторам фталатов, адаптированным к росту и потреблению этих субстратов в условиях высокого засоления среды. Разложение фталатов в условиях повышенной солености среды описано всего для нескольких бактерий − у штамма Sphingobium sp. TJ, утилизирующего ДБФ (500 мг/л) при содержании до 40 г/л NaCl в среде, а также для штамма Rhodococcus sp. YC-YT1, способного к росту на диэтилгексилфталате в присутствии 0–120 г/л NaCl [8, 16]. Кроме того, в литературе не представлено данных о способности бактерий родов Idiomarina и Oceanisphaera к росту на ОФК и ее производных. В единичных сообщениях приводятся данные о способности бактерий родов Halomonas и Martelella к деструкции ОФК [23], но не исследованы физиологические и молекулярно-биологические особенности разложения этих соединений.

Таким образом, выделенные из техногеннозагрязненных/засоленных образцов (почв, донных отложений водных объектов и шламохранилищ, расположенных на территории соледобывающего предприятия) бактерии-деструкторы фталатов (ОФК, ДБФ, ДЭФ) характеризовались таксономическим разнообразием, обладали широкой субстратной специфичностью, способностью к эффективной утилизации ДБФ и ДЭФ при повышенном засолении среды. Выявленные особенности этих бактерий указывают на их перспективность для применения в качестве биологических объектов при разработке новых методов биоремедиации засоленных почв, загрязненных фталатами.

Работа выполнена в рамках государственного задания, номер госрегистрации темы: 01201353247, а также при финансовой поддержке РФФИ и Министерства образования и науки Пермского края в рамках научного проекта № 16-44-590968 р_а.