Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 1, стр. 19-34

Важнейшим условием получения высоких урожаев сельскохозяйственных культур является интегрированная защита посевов от вредителей, болезней и сорняков, включающая организационно-хозяйственные и агротехнические мероприятия, использование биологических методов и химических средств защиты растений при сочетании профилактических и истребительных мер. Основными методами защиты растений до сих пор являются химические. Однако в последнее время в ассортименте растениеводов появились генно-модифицированные сорта, созданные на базе системы геномного редактирования CRISPR-Cas, и препараты, основанные на индукции фитоиммунных реакций растений или на механизмах РНК-интерференции целевых генов вирулентности патогена или чувствительности самого растения, что позволяет в некоторых случаях отказаться от химической защиты.

Особый интерес среди новых подходов к защите растений представляют биопрепараты, содержащие живые клетки бактерий и/или их метаболиты. Анализ метаболома таких бактерий, проявляющих высокий защитный эффект в отношении растений, свидетельствует о том, что многие из них синтезируют вещества пептидной природы, подавляющие рост и развитие родственных фитопатогенных видов или штаммов, или обладающие более широким спектром биоцидного действия (бактерицидное, фунгицидное, инсектицидное и противовирусное) [1]. Часть из них синтезируется на рибосомах с участием особых плазмид (бактериоциногенных факторов) [2], другие – нерибосомально, с участием специальных мультиферментных комплексов, названных нерибосомальными пептидными синтетазами (НРПС) [1, 3, 4]. Продукты синтеза НРПС – пептиды, согласно обзорной работы Фира с соавт. [1], подразделяются на 10 подклассов.

Многообразие липопептидов бактерий рода Bacillus. Среди указанных выше антибиотиков особый интерес представляют липопептиды бацилл. Благодаря особенностям строения эти соединения амфифильны и устойчивы к гидролизу пептидазами и протеазами, а также нечувствительны к окислению, действию относительно высоких температур. Вместе с тем, их цистеиновые остатки могут окисляться до сульфидов и/или изменять структуру до характерных внутримолекулярных C–S-связей.

Молекулы известных липопептидов содержат от 4 до 16 аминокислотных остатков в L- или D‑конфигурации [3]. Основываясь на химической структуре, липопептиды можно разделить на линейные и циклические. К циклическим относят липопептиды с молекулярной структурой, содержащей циклический компонент, сформированный карбоксильной группой С-конца пептидной цепи и аминогруппой пептидной цепи или гидроксильной группой жирной кислоты. Линейные липопептиды содержат линейно расположенные аминокислоты, соединенные друг с другом или с жирной кислотой, связанной с α-аминогруппой или гидроксильным остатком. В зависимости от структуры, циклические липопептиды подразделяются на три класса: 1) сурфактины; 2) итурины (итурин А, микосубтилин и бацилломицин); 3) фенгицины (плипастатин) [1, 4].

В 1949 г. среди метаболитов, выделяемых штаммом бактерии Bacillus (Paenibacillus) polymyxa IAM1213, был детально описан полимиксин – циклический низкомолекулярный пептид с жирнокислотным компонентом [5]. С тех пор структура и функции липопептидов, выделяемых из разных видов рода Bacillus, таких, как B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. thuringiensis, B. velezensis, а также из других бактерий, актиномицетов и грибов, активно изучается [1, 3, 6, 7].

Один и тот же штамм бактерий способен синтезировать несколько антибиотиков различных классов. Так, из почв Алжира выделены антагонистические к почвенным фитопатогенам изоляты Bacillus spp., продуцирующие сурфактин, пумалицидин, лихенизин, курстакин и различные изоформы фенгицина [8]. Выявлена закономерность в содержании сурфактинов, фенгицинов и итуринов, 6 : 37 : 57 соответственно, выделяемых штаммами B. subtilis в культуральную среду [9, 10]. Определено, что не менее 8% генома эндофитного штамма B. amyloliquefaciens FZB42 участвует в продукции вторичных метаболитов, включая бактериоцины, липопептиды и др. [11]. У штамма Bacillus tequilensis 7PJ-16 обнаружены генные кластеры, ответственные за синтез липопептидов: сурфактина, фенгицина, бациллибацина и бацилина, и бактериоцинов – субтиллина, субтилозина А [12]. В геноме штамма B. velezensis LM2303 обнаружены до 13 кластеров, ответственных за синтез таких липопептидов, как фенгицин-б, итурин, сурфактин-а, бутирозин, плантазолицин и его гиролизованный изомер, киянимицин, бацилизин, дифицидин, бациллаен и бациллаен Б [13]. В геноме штамма B. amyloliquefaciens subsp. plantarum Fito_F321, выделенного из здоровых тканей винограда Vitis vinifera сорта Merlot at Bairrada appellation (размер генома 3856229 п. н., Картахена, Португалия), определены гены, кодирующие белки, ответственные за синтез бациллаена, диацидина, микролактина, сурфактина и фенгицина [14]. У штамма Bacillus atrophaeus GQJK17, выделенного из ризосферы дерезы обыкновенной (Lycium barbarum L.), обнаружены 8 кандидатных генных кластеров, ответственных за синтез сурфактина, бацилаена, фенгицина и бациллибацина [15]. Проведение полногеномного секвенирования ряда геномов эндофитных бактерий, в частности, рода Bacillus spp., позволило определить расположение генетических кластеров, ответственных за синтез липопептидов. Так, у штамма бактерии Bacillus velezensis 9D-6 показана локализация генов бацилозин-синтетазы в зоне 174243–215661 п. н. бактериальной хромосомы, сурфактин-синтетазы – 820 469–8 85 876 п. н., а фенгицин-синтетазы – 2 364 456–2 489 567 п. н. [7].

Не менее интересен факт способности энтомопатогенных бацилл к синтезу антибиотиков, подавляющих рост и развитие фитопатогенных бактерии и грибов. Так, у энтомопатогенной бактерии B. thuringiensis pv. kurstaki обнаружены курстакины и описана структура генов, ответственных за их синтез [16]. Выявлено, что штаммы B. thuringiensis pv. kurstaki и B. thuringiensis pv. israelensis, продуцировали до 146 и 93 мг/г клеток курстакина соответственно [17]. Кроме того, из культурального фильтрата этого вида бактерии выделен и охарактеризован циклический липопептид, по химической структуре близкий к фенгицину, проявляющий, наряду с фунгицидной и бактерицидной активностями (например, против бактерий Escherichia coli и Staphylococcus epidermidis) также и инсектицидную [18].

Эти и другие данные подтверждают многообразие классов антибиотиков и их изоформ, синтезируемых представителями ризосферных и эндофитных бактерий, и перспективность их исследований с целью поиска новых эффективных антибиотических соединений. Разнообразные свойства, обнаруженные у липопептидов, позволяют активно использовать их в различных областях. Антимикробные, фунгицидные, инсектицидные, антиканцерогенные и иммуномодулирующие свойства липопептидов могут способствовать решению проблем медицины, ветеринарии, растениеводства и формирования экологически безопасной окружающей среды.

Особенности биосинтеза липопептидов бактериями. Характерной особенностью бактериальных липопептидов является их нерибосомальный синтез белковыми комплексами НРПС и содержание в структуре необычных (орнитин и др.) и D-аминокислот [19, 20]. Модульная структура НРПС в точности соответствует структуре их генов, и каждый модуль является структурным блоком для ступенчатого включения аминокислоты в пептидный фрагмент липопептида [21]. Консервативные мотивы, отвечающие за стандартные процессы аденилирования и тиолирования аминокислот, чередуются с вариабельными локусами, распознающими определенный субстрат. Модули могут быть подразделены на модули инициации и удлинения. Модули инициации обычно состоят из домена аденилирования (А), ответственного за выбор и активацию аминокислот, и домена тиоляции (Tor PCP), ответственного за тиоэтерификацию активированной аминокислоты. Домены тиоэстеразы катализируют циклизацию зрелого пептида и его высвобождение [21]. Поскольку соответствующие линейные формы циклических липопептидов биологически менее активны, считается, что циклизация уменьшает конформационную свободу и обеспечивает стабилизацию соединения, которая необходима для взаимодействия с биологической мишенью.

По структуре оперона, содержащего гены НРПС, можно точно предугадать состав синтезируемого ими конечного олигопептида. Например, оперон сурфактина состоит из четырех биосинтетических генов, три из которых отвечают за пептид-синтетазы, а четвертый кодирует белок тиоэстеразу. Первый ген, srfAA, содержащий три модуля, включает первые три аминокислоты в пептид (глутаминовая кислота, лейцин и изолейцин). Второй ген − srfAB, также содержит три модуля и включает валин, аспарагиновую кислоту и лейцин. Третий ген − srfAC, активирует лейцин и катализирует высвобождение и циклизацию пептидной цепи. Последний ген – srfAD кодирует белок, участвующий в восстановлении некорректно встроенных в структуру липопептида аминокислот во время биосинтеза пептидов [22].

За биосинтез фенгицина и плипастатина отвечает оперон fen/pps, содержащий пять генов, кодирующих трехмодульный фермент. Первые четыре гена (fenA, fenC, fenD, fenE) кодируют ферменты, интегрирующие аминокислоты в пептид. Пятый ген (fenB) кодирует белок, ответственный за включение изолейцина и, возможно, способствует закрытию кольца фенгицина [22].

Анализ профиля метаболитов бактерий рода Bacillus свидетельствует, что одни и те же штаммы могут одновременно продуцировать соединения, которые относятся к различным семействам липопептидов, а также и нескольких структурных аналогов одного конкретного липопептида. Например, бактерии B. subtilis могут продуцировать до 12 сурфактиновых аналогов, различающиеся пептидными остатками и/или их длиной и разветвлением цепи жирных кислот [23].

Подходы к получению препаратов липопептидов. Большинство бацилл выделяют липопептиды в окружающую среду, что позволяет получать их в производственных масштабах, используя биотехнологические подходы. Наиболее часто используемый способ получения липопептидов в больших количествах – подбор их продуцентов среди природных или искусственно созданных штаммов или линий. Анализ штаммов B. licheniformis, выделенных в семи разных географических зонах, выявил различие в содержании липопептидов в зависимости от места происхождения [24]. В патенте Мелентьева с соавт. [25] в качестве продуцента сурфактина предлагается штамм B. subtilis ИБ-17 с выходом антибиотика до 1798 мг/л. В работе Фахима [17] приведены результаты анализа содержания липопептидов у восьми различных видов бактерий Bacillus spp., показавшие не только разнообразие спектра синтезируемых бактериями антибиотиков, но и выявившие их продуцентов с суммарным выходом до 2000 мг/л. Например, штамм B. amyloliquefaciens S499 продуцировал до 1146 мг/л сурфактина, 228 мг/л фенгицина и 614 мг/л бацилломицина, штамм B. subtilis АТСС 21322 – 1431 мг/л сурфактина и 360 мг/л плипастатина [17].

Другим подходом к получению продуцентов липопептидов является генетическая модификация штаммов. Так, использование геномного шаффлинга позволило Цхао с соавт. [26] создать линию бактерии B. amyloliquefaciens FMB72, синтезирующих в 8.3 раз больше фенгицина, чем исходный штамм B. amyloliquefaciens ES-2-4, выделенный из растений шлемника S. baicalensis Georgi. Замена промоторной части PrepU гена фенгицин-синтетазы на гомологичный промотор гена Staphylococcus aureus позволила создать штамм BMG03 с увеличенным выходом фенгицина (плипастатина) с 91  до 507 мг/л [27]. Что интересно, у этого же штамма – суперпродуцента фенгицина, увеличился и выход сурфактина (с 1023 до 1162 мг/л) [27]. Напротив, отключение экспрессии гена сурфактин-синтетазы методом геномного редактирования CRISPR-Cas9 способствовало падению уровня концентрации фенгицина в культуральном фильтрате [28]. Полученные данные свиедтельствуют о взаимосвязи между экспрессией генов, кодирующих сурфактин- и фенгицин-синтетазы.

Усилить синтез липопептидов и/или менять их количественное соотношение можно путем подбора питательных сред и условий культивирования [17, 29]. Так, продукция сурфактинов B. subtilis увеличивалась под влиянием присутствия в среде культивирования цитратов [30], сульфатов магния и железа [31]. Для усиления продукции бацилломицина Д штаммом B. subtilis fmbJ было предложено добавление в среду культивирования 5 г/л L-глутамина и 30 г/л инулина [32]. Особое место в получении липопептидов играют условия аэрации культуральной среды, от которой, как оказалось, зависит не только количество синтезируемого целевого липопептида, но и соотношение изомеров антибиотика [17]. Продукция итурина, фенгицина и сурфактина эндофитным штаммом B. amyloliquefaciens FJAT-2349 зависела от температуры культивирования и варьировала от 0.41 до 5.89 мг/л, от 4.54 до 181.67 мг/л и от 2.05 до 19.65 мг/л соответственно. Оптимальной для культивирования этого штамма, как продуцента сурфактинов, оказалась температура 20°С [33]. Вместе с тем, штамм B. amyloliquefaciens C2LP эффективно синтезировал итурин при 27−30°С [29]. При обработке растений томатов, фасоли и цуккини клетками B. amyloliquefaciens S499 отмечено эффективное влияние на продукцию сурфактинов низких положительных температур (15°С) по сравнениию с высокими (30°С), коррелирующее с формированием полных биопленок и устойчивости растений к Phytophthora infestans, B. cinerea и Podosphaera xanthii, соответственно [34].

Обнаружена зависимость формирования биопленки и продукции липопептидов бактериями (как на уровне их накопления, так и экспрессии генов их синтетаз) от наличия метаболитов, выделяемых фитопатогенами или растениями, например, белковых и полисахаридных эксудатов корней [35–39]. В ризосфере наблюдали большее накопление сурфактина в сравнении с итурином и фенгицином, зависящее от набора нутриентов, от стадии колонизации ризосферы, возраста колоний [40] и температуры культивирования [34], но не всегда коррелирующее с таковой in vitro. Кроме того, изменения в спектре продукции липопептидов бактериями зависят и от возраста растений и фитогормонального баланса в растительных тканях. Так, бактерии, колонизирующие поверхность корней взрослых растений огурца, продуцировали больше итурина А, чем сурфактина, в сравнении с бактериями, колонизирующими эти же органы более молодых растений [40]. Ауксины, а также микроорганизмы – их продуценты, в том числе и фитопатогены способны снижать антибиотикпродуцирующую активность, например, у ризобактерии Serratia plymuthica A153 [37].

Способы выявления липопептидов и определения их количественного содержания. Определить, синтезируют ли виды и штаммы бактерий липопептиды, можно двумя способами: по конечному продукту синтеза и по наличию в геноме соответствующих генов НРПС. Для выявления способности бактерий к синтезу липопептидов часто применяется генетическое типирование бактерий методом ПЦР с использованием праймеров, нацеленных на консервативные участки генов, кодирующих НРПС [41–45]. Поскольку в генах НРПС целевые последовательности неоднократно повторяются, в результате ПЦР амплифицируются полиморфные фрагменты ДНК. Виды и подвиды Bacillus spp. неоднородны по набору генов НРПС. Кроме того, значительное разнообразие по изомерам липопептидов предполагает наличие в геноме бактерий различных по гомологии НРПС.

Среди генов, кодирующих НРПС, наиболее изучены семейства синтетаз сурфактина, фенгицина и итурина. Сурфактины известны в основном своей сурфактантной активностью, а также, как было показано, проявляют гемолитические, противовирусные и антибактериальные свойства, но имеют ограниченную противогрибковую активность. Рунгшаванг с соавт. [21] продемонстрировали, что продукт гена sfp имеет широкую субстратную специфичность, позволяющую осуществлять посттрансляционную модификацию как пептидилового, так и ацильного концов пептида.

Ген B. subtilis ZK8 (кат. NCBI − KT750873), кодирующий фосфопантетинил-трансферазу, имеет наибольшее сходство (98−100%) с гомологичными генами штаммов B. subtilis subsp. krictiensis (KC454625), B. subtilis (AF233756 и AB971633), B. subtilis 916 (FJ919233), B. amyloliquefaciens MH71 (KJ452562), B. amyloliquefaciens JT84 (KX346253), B. amyloliquefaciens C6a (KM886934), B. amyloliquefaciens Lx-11 (JN086145), B. amyloliquefaciens (JX684070), Microbacterium oxydans B2 (KP868622). С.K. Гонд с соавт. [42] показали, что эндофитные штаммы B. amyloliquefaciens и B. subtilis продуцируют данный фермент. Ген B. subtilis RP24 (D21876), кодирующий итурин А-синтетазу, гомологичен (98−99%) гену фосфопантетинил-трансферазы B. subtilis HSN48 (MF681694), B. subtilis B3 (AY040867) и B. amyloliquefaciens JT84 (KX346253).

Итурины представлены семейством циклических липопептидов, содержащих 7 аминокислот. Его представители обладают высокой противогрибковой активностью, благодаря тому, что гидрофобные остатки молекулы встраиваются в цитоплазматическую мембрану клеток и автоматически собираются, образуя ионный канал, тем самым вызывая утечку цитоплазмы. Однако они обладают ограниченной противовирусной и антибактериальной активностью. Ген итурин B-синтетазы (JN093026) гомологичен (98−99%) с генами MG009461 Bacillus siamensis, EU263005 штамма B. subtilis MH25 и гена AY137375 B. subtilis, кодирующего бациломицин.

Фенгицины менее гемолитичны, чем сурфактины или итурины, и обладают сильной фунгицидной активностью. Ген AJ011849 штамма B. subtilis F29-3, кодирующий фенгицин-синтетазы, обладает гомологией (78−99%) с генами фенгицин-синтетазы B. subtilis NCD-2 (GQ906579), B. subtilis RMB5 (KM459608), B. subtilis BS6 (JN801145), B. subtilis NS1 (KM459605), B. subtilis BS2 (JN801144), B. subtilis BS8 (JN801143), B. subtilis NS2 (KM459606), B. subtilis S4 (KM459607), Bacillus tequilensis SV104 (KX099390). Фенгицин – как продукт впервые выделен из штамма B. subtilis F-29-3 [46].

Кроме методов оценки наличия генов НРПС в бактериальном геноме и соответственно их экспрессионной активности, существуют биохимические и физико-химические способы выделения липопептидов и их идентификации в среде культивирования бактерий. Для этого используют следующие методы.

1. Весовой (гравиметрический) анализ, основанный на полном (количественном) выделении какого-либо компонента из анализируемого образца и последующем точном его взвешивании. Метод весового анализа устанавливает концентрацию растворов антибиотиков, применяемых для других методов количественного анализа.

2. Спектрофотометрическое измерение концентрации пептидов в растворах при длине волны 210 нм [47].

3. Колориметрические методы, когда о концентрации липопептидов судят по интенсивности поглощения света продуктами взаимодействия их с реактивом Фолина−Чокалтеу [48], либо с красителем бромтимоловым синим [49] для обнаружения липидов и фосфолипидов.

4. Метод тонкослойной хроматографии с последующим проявлением хроматограмм специфическими красителями [50].

В качестве еще одного быстрого и эффективного подхода к отбору продуцентов сурфактинов и оценки их функциональной активности предлагают использовать способность липопептидов вызывать лизис эритроцитов и образовывать мицеллы с липидами [51]. Так, сурфактин среди всех известных липопептидов характеризуется как самый сильный сурфактант, снижающий поверхностное натяжение воды от 72 до 27 мН м^–1 с критической концентрацией мицелл 10^–5 М [52]. При этом он демонстрирует и очень высокую способность к самоорганизации, образуя сферические мицеллы и более крупные агрегаты при очень низких концентрациях.

Для выделения липопептидов наиболее часто применяют их осаждение подкислением культуральной среды до рН 2 [33] с последующим перерастворением в небольшом количестве дистиллированной воды, нейтрализацией рН и добавлением метанола (до 60–80%). Следующим по частоте применения методом для получения липопептидов является метод их экстракции бутанолом, основанный на способности липопептидов растворяться в спиртах и других органических растворителях [53]. Благодаря тому, что бутанол с водой образует две фазы почти не смешивающихся жидкостей, он часто используется для экстракции липопептидов и других липид-содержащих соединений перед их анализом методом ВЭЖХ. Согласно данным литературы [54], при выделении этим способом удается извлечь до 95% от всех секретируемых бактериями липопептидов, тогда как классическим осаждением кислотой – не более 60%. Однако при выделении из больших объeмов культуральной жидкости этот метод используют редко. Для получения отдельных фракций липопептидов могут применяться различные виды жидкостной колоночной хроматографии: гель-хроматография на колонках с сефадексом LH-20, высокоэффективная жидкостная хроматография на колонках Zorbax SB-C₁₈ с применением в качестве мобильной фазы ацетонитрила и уксусной кислоты либо еe галоген-производных [42]. Для идентификации изомеров и установления их молекулярной структуры липопептиды анализируют методом масс-спектрометрии [1, 35, 42].

Биоцидные свойства липопептидов. Большой интерес ученых вызывает широкий спектр биоцидного (бактерицидного, фунгицидного, инсектицидного) действия липопептидов [1, 4]. Эти свойства связывают с их способностью нарушать проницаемость бактериальной цитоплазматической мембраны, формировать в ней поры и разрушать ее [1, 9]. Таксономическая избирательность и механизмы образования пор в плазмалемме различны для липопептидов разных семейств, что обуславливает их разную биологическую активность [55, 56].

Показана способность итурина и сурфактина, выделенных из штамма B. subtilis OG, разрушать клеточные стенки бактерий Xanthomonas campestris pv. campestris и Xanthomonas axonopodis pv. citri, вызывающих бактериозы и рак цитрусовых, соответственно [55]. С использованием линий B. subtilis, диких и дефицитных по продукции липопептидов, показано, что итурин, но не сурфактин и фенгицин, важный компонент антибактериальной активности [57]. С синтезом изоC₁₅[Leu⁷] сурфакттина связывают антибактериальные свойства эндофитного штамма B. velezensis 9D-6, ассоциированного с корнями растений, по отношению к B. cereus, Clavibacter michiganensis, Pantoea agglomerans, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris и Xanthomonas euvesicatoria, и антигрибные по отношению к Alternaria solani, Cochliobolus carbonum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Gibberella pulicaris, Gibberella zeae, Monilinia fructicola, Pyrenochaeta terrestris и Rhizoctonia solani [7]. Формируемые на поверхности корней арабидопсиса с участием сурфактина биопленки штамма B. subtilis 6051 ответственны за ингибирование роста патогена Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 [58]. Это было доказано с использованием мутантной линии М1 штамма B. subtilis 6051 с подавленным синтезом сурфактина. Близкие по структуре к сурфактинам и итуринам липопептиды были ответственны за формирование фунгицидной активности у штамма B. subtilis ИБ-54 − антагониста почвенных микромицетов [25, 59]. Доказано участие сурфактина и фенгицина, но не бациллаена, синтезируемых B. mojavensis [60] и B. amyloliquefaciens LL3 [61], в формировании биопленки и устойчивости растений, например, к грибам A. flavus [62] и Fusarium graminearum [63], кроме того, в многократном снижении уровня микотоксинов [45, 64].

Еще в конце 80-х гг. прошлого столетия было установлено, что штамм B. subtilis NK-330, ингибирующий рост грибов Aspergilus flavus и A. parasiticus, способен подавлять продукцию ими афлатоксина при совместной культивации на кукурузе и арахисе в условиях лаборатории, что не проявлялось в полевых условиях [65]. Особый интерес представляет то, что в деградации микотоксинов, например, гриба A. flavus R5, активное участие принимали бактериальные оксидоредуктазы, вовлеченные в биосинтез бацилина [45]. Оценка фунгицидных свойств изолятов Bacillus spp., выделенных из ризосферы кукурузы, по отношению к возбудителям фузариоза (корневых гнилей) выявила высокоэффективные штаммы, среди которых штамм NWUMFkBS10.5, идентифицированный как B. velezensis, продуцировал комплекс липопептидов трех классов [66]. Точно также, штаммы B. velezensis Y6 и F4, выделенные из почв провинции Гуанжоу (Китай), характеризующиеся как комплексные продуценты липопептидов, сдерживали развитие бактерии R. solanacearum и гриба F. oxysporum [36]. Другой, ассоциированный со злаковыми растениями, штамм B. velezensis LM2303, проявлял высокую фунгицидную активность против возбудителя фузариоза колоса F. graminearum [67]. Липопептиды эндофитного штамма B. amyloliquefaciens FJAT-2349 обладали биоцидной активностью в отношении возбудителя бактериального вилта томатов R. solanacearum FJAT-91, как в условиях in vitro, так и in planta [33].

Итурины и бацилломицины, несмотря на то, что имеют ограниченную антибактериальную активность, характеризуются биоцидной активностью в отношении широкого спектра видов грибов [15, 56, 68]. Итурин, синтезируемый штаммом B. subtilis KS03, in vitro ингибировал рост возбудителя антракноза Gloeosporium gloeosporioides [69]. Высокая антагонистическая активность против гриба Pythium aphanidermatum, как in vitro, так и in vivo обнаружена у штамма B. subtilis BBG100, гиперсинтезирующего микосубтилин на растениях томатов [70]. Кao с соавт. [36] показали, что итурин B, продуцируемый B. subtilis SQR9, стимулировал устойчивость растений огурца к F. oxysporum f. sp. cucumerinum. Обработка растений огурца этими бактериями значительно, на 68% в сравнении с контролем, уменьшала поражение фузариозом и способствовала росту растительной массы. Итурин в значительной степени ингибировал рост мицелия гриба F. oxysporum и уменьшал число проросших спор до 83.6% по сравнению с контролем. Штамм бактерий Bacillus BH072, синтезирующий итурин A, проявлял антагонизм по отношению к грибам Aspergillus niger, Pythium sp. и Botrytis cinerea [42]. Существенную роль итурины B. velezensis (Y6 и F7) играли в проявлении антифунгальной активности в отношении грибов R. solanacearum и F. oxysporum [36], а также Valsa mali, F. oxysporum и F. verticilloides [15]. Антифунгальную активность итуринов, синтезируемых бактериями Bacillus, объясняют способностью их взаимодействовать со стеринами, фосфолипидами и олеиновой кислотой мембран грибных клеток [41].

В работе [57] показано, что бацилломицин и фенгицин, выделенные из клеток штамма B. subtilis UMAF6614, проявили более высокую биоцидную активность против грибных и бактериальных патогенов дыни, по сравнению с сурфактином. Бацилизин, синтезируемый бактериями B. megaterium, приводил к образованию вздутий на кончиках растущих гиф фитопатогенных грибов Alternaria alternate, Drechlera oryrae и F. roseum, а продуцируемый клетками B. pumilis приводил к таким же эффектам у возбудителя ржавчины злаков Puccinia recondita [71]. Отмечается, что подавление бактериями B. subtilis GM5 развития гриба F. oxysporum на стадиях прорастания спор, формирования ростковых трубок обусловлено наличием у бактерий сурфактина и фенгицина, вызывающих аномальное ветвления гиф и их аномальное развитие [44, 72]. Под действием метаболитов бактерий рода Bacillus подавлялось прорастание спор фитопатогенных грибов, на мицелии образовывались вздутия, нарушалось функционирование мембран клеток мицелия, увеличивалась их проницаемость [44, 71, 73], а впоследствии уменьшалась спорулирующая активность, например, как у гриба A. flavus [45].

Выявлено, что эффективность действия штаммов B. subtilis NCD-2 против возбудителя ризоктониоза хлопчатника R. solani [74], D1/2 против возбудителя фузариоза зерновых культур F. graminearium [75], BS155 против Magnaporthe grisea [76] и GA1 против серой гнили яблок (гриб B. cinerea) [77] определяется наличием фенгицинов. Важно при этом заметить, что синтез бактериями B. subtilis GA1 фенгицина индуцировался в плодах, инфицированных грибом, но не в сильно пораженных [77]. Показано, что в антагонизме четырех штаммов B. subtilis по отношению к возбудителю болезни листьев дыни – грибу Podosphaera fusca ключевую роль играли липопептиды семейств итуринов и фенгицинов [73], а в защите бобовых растений от фитопатогена Pythium ultimum – фенгицины, продуцируемые B. subtilis [3]. Интересно, что фенгицин, выделенный из штамма B. thuringiensis CMB26, проявлял высокую токсичность не только в отношении возбудителя антракноза перца − гриба Colletotrichum gloeosporioides, но и гусениц капустной белянки (Pieris rapae crucivora) [78].

Наряду с проявлением антифунгальной активности четырех штаммов B. subtilis по отношению к возбудителю мучнистой росы огурца обнаружена их активность против возбудителей гнилей – бактерий X. campestris и Pectobacterium carotovorum [58]. При этом отмечено, что антифунгальная активность проявляется благодаря наличию липопептидов трех классов и сурфактина, и итурина, и фенгицина. Вместе с тем антибактериальную активность проявлял исключительно итурин [58]. В другой работе [79] после оценки in vitro и in vivo способности тунисского штамма B. subtilis синтезировать итурин и оказывать фунгицидный эффект предложено использовать его в качестве потенциальной основы нового препарата для защиты растений.

Способность подавлять рост 12 видов фитопатогенных грибов, в том числе из родов Alternaria, Botrytis, Sclerotinia, а также возбудителей серой гнили томатов и мучнистой росы огурца и тыквы, проявляли клетки штамма бактерий B. amyloliquefaciens CNU114001 и итурин, выделенный из среды их культивирования [80]. Обнаружено, что итурин А, фенгицин и сурфактин ответственны за антагонистический эффект штаммов B. amyloliquefaciens S13-3 по отношению к возбудителю антракноза земляники [81], штаммов MEP2 18 и ARP23 – к стеблевой гнили сои [41], а штамма Р-РСВ004 – семи фитопатогенов цитрусовых, поражающих плоды при хранении [82]. Из них итурин был самым сильным ингибитором роста возбудителей болезней in vitro [82]. Cурфактины штамма B. amyloliquefaciens, изолированного из апельсиновых деревьев, ингибировали рост гриба F. oxysporum [83], а итурин, плипастатин (стереоизомер фенгицина) и сурфактин штамма B. amyloliquefaciens S76-3, выделенного из колосьев пшеницы – рост гриба F. graminearum [84]. Показано, что у бактерий штамма B. amyloliquefaciens SQR9 ведущую роль в подавлении F. oxysporum играет бацилломицин D [12]. Ассоциированные с растениями штаммы B. amyloliquefaciens MEP218 и ARP23, продуцирующие набор липопептидов, подавляли in vitro и in vivo рост гриба Sclerotinia sclerotiorum [41]. Другой штамм этой бактерии NJN-6 продуцировал три гомолога итуринов и два гомолога фенгицинов, которые подавляли рост гриба F. oxysporum [84].

Схожесть природы ингибирующего эффекта самих клеток Bacillus spp. SS-12.6 и экстракта липопептидов, полученного из культурального фильтрата, по отношению к пятнадцати видам грибов, поражающих лекарственные растения, подтверждает ключевую роль липопептидов в антифунгальном действии штамма [85]. Точно также, антифунгальный эффект по отношению к грибу S. sclerotiorum штаммов бактерий Bacillus sp. B19, Bacillus sp. P12 и B. amyloliquefaciens B14, выделенных из почв провинции Сальта (Аргентина) и стимулирующих рост растений фасоли сорта Алюбия, связан с синтезом ими липопептидов, особенно в составе консорциума [86]. Выяснилось, что штаммы с более высоким содержанием липопептидов и широким спектром их изомеров обладали более сильным аддитивным или синергическим антагонизмом в отношении патогенной микрофлоры [6, 87].

Интересные результаты получены при исследовании бактерий, у которых природная способность синтезировать те или иные липопептиды была искусственно отключена [28, 45, 88]. Так, с использованием штаммов B. subtilis BBG231 (srfAA-) и BBG232 (srfAC-), мутантных по гену, кодирующему сурфактин-синтетазу, а также штаммов BBG235 и BBG236 с подавленным синтезом полинуклеотид-фосфорилазы (polynucleotide phosphorylase, PNPase) показано, что эти ферменты важны в синтезе фенгицина, а их дефицит снижает антигрибковую активность штаммов по отношению к B. cinerea [88]. С использованием бактериальных линий B. subtilis UTB1 с искусственно нарушенной экспрессией бацилозин-синтетазы обнаружено многократное снижение фунгицидной активности по отношению к грибу A. flavus, а также восстановление его спорулирующей активности [45]. Такие линии бактерий слабее разрушали афлатоксины гриба A. flavus. Линии бактерий B. subtilis HS3 с нарушенным синтезом фенгицина и сурфактина (∆sfp), полученные методом геномного редактирования с использованием системы CRISPR-Cas9, теряли антифунгальную активность по отношению к грибам Rhizoctonia solani и F. culmorum [28].

Комплексный анализ антифунгальной активности сурфактинов, выделенных из бактериальных культур B. amyloliquefaciens KB3 и B. subtilis QST-713 (коммерческий продукт Cease “Bioworks Inc.”, США), выявил антагонизм против грибов R. solani, Phytophthora capsici, Colletotrichum coccodes и F. oxysporum in vitro и in planta [89], а липопептидов B. velezensis LM2303 − против возбудителя фузариоза колоса − F. graminearum [67]. Липопептиды штамма Bacillus methylotrophicus (syn. B. velezensis) XT1 CECT 8661 проявляли высокую эффективность защиты плодов томатов, винограда и клубники от возбудителя серой гнили B. cinerea при хранении [72], а штамма B. subtilis GA1 − яблок [77]. Основываясь на антифунгальных свойствах липопептидов, которые они проявляют в относительно низких концентрациях (до 5 мг/л), обусловленных в том числе эффектом ПАВ, их рекомендуют в качестве усилителей некоторых антибактериальных препаратов. Так, использование красного антибактериального пигмента продигиозина в сочетании с сурфактином − серраветтин W1 бактерий Serratia marcescens оказалось более эффективным при подавлении роста бактерии Corynebacterium glutamicum, по сравнению с применением компонентов по отдельности [90]. Совместное применение микосубтилина (1.4 мг/л) и сурфактина (1.4 мг/л) позволяло на 82% подавить рост гриба Zymoseptoria tritici на растениях пшеницы сорта Dinosor [91]. Интересно, что в других сочетаниях липопептиды, например, микосубтилин + сурфактин + фенгицин, или суфактин + фенгицин, проявляли защитный эффект в более высоких концентрациях. В работе [6], показано, что выделенные из культуры B. subtilis микосубтиллин в сочетании с фенгицином или субтилином проявляли синергический фунгицидный эффект против гриба F. oxysporum f. sp. iridacearum, вызывающего гнили кореневищ ириса, уже в концентрации 5 мг/л, что почти в 100 раз меньше рекомендуемой дозы системного фунгицида Topsin M (“Nippon Soda Co.”, Япония). Кроме того, есть информация о сенсибилизирующей активности липопептидов, выделенных из культуры B. amyloliquefaciens JCK-12 при использовании химических фунгицидов, контролирующих развитие фузариоза колоса F. graminearum [87].

Показано, что липопептиды бацилл обладают избирательной инсектицидной активностью. Так, ряд изомеров сурфактина, выделенных из культурального фильтрата штамма B. clausii DTM1, проявляли инсектицидную активность против тлей, но не против личинок капустной моли Plutella xylostella и кукурузного жука Diabrotica balteata, а также гербицидую активность против мятлика однолетнего, но не арабидопсиса [23]. При этом у изоC₁₃[Leu⁷] сурфактина обнаружена инсектицидная активность и в отношении личинок капустной моли. О способности сурфактинов бактерий B. amyloliquefaciens G1 эффективно защищать растения от тлей сообщалось в работах [92, 93], а ларвицидную активность против гусениц мельничной огневки Ephestia kuehniella выявили у сурфактинов бактерий B. subtilis SPB1 [94]. При оценке способности трех изомеров сурфактина C₁₄[Leu⁷], C₁₄[Val⁷] и C₁₅[Leu⁷] проявлять инсектицидную активность против персиковой тли Myzus persicae, было обнаружено, что замена лейцина на валин в структуре липопептида приводит к ухудшению соответствующего показателя [95]. Несомненный интерес представляют и данные о способности сурфактинов штамма B. subtilis subsp. subtilis (VCRC B471) уменьшать численность личинок комаров [96]. Многократное уменьшение массы личинок листовой кукурузной совки Spodoptera fruigiperda и увеличение показателя их смертности обнаружены при инокуляции растений бактериями B. amyloliquefaciens, выделенными из семян хосты сорта “Blue Umbrella” [97]. Сурфактины, выделенные из культурального фильтрата штамма B. amyloliquefaciens AG1, были эффективны в подавлении развития личинок египетской хлопковой совки Spodoptera littoralis и томатной минирующей моли Tuta absoluta [98]. Показано, что они вызвали у насекомых нарушение работы кишечника и при этом не конкурировали с инсектотоксином Vip3Aa16 B. thuringiensis за рецепторы, аддитивно усиливая инсектицидную активность при совместном применении [98], что предполагает возможное использование консорциума подобных штаммов или даже их метаболитов в качестве эффективного инсектицидного препарата. Нарушение работы кишечника личинок колорадского жука Leptinotarsa declemlineata после кормления растениями картофеля, предварительно инокулированными продуцирующим сурфактин штаммом эндофитной бактерии B. subtilis 26Д, наблюдалась также в работах [99, 100].

Помимо прямого биоцидного действия сурфактины и фенгицины B. subtilis предотвращают адгезию конкурентных организмов на поверхности корней растений [56]. Гонд c соавт. [43] показали, что эндофитные штаммы B. amyloliquifaciens и B. subtilis, продуцирующие сурфактин-синтетазу, а также культуральные фильтраты бактерий, ингибировали развитие гриба F. moniliforme как в условиях in vitro, так и на растениях кукурузы in vivo. Продуцирующий сурфактин и лихенизин штамм B. licheniformis GL174 подавлял рост грибов Phaeoacremonium aleophilum, Botryosphaeria spp. и B. cinereа как в культуре in vitro, так и in vivo на растениях винограда [101].

Перспективность применения бактерий для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и улучшения их качества может быть связана не только с биоцидными свойствами, но и способностью разрушать метаболиты фитопатогенов, например микотоксины, токсичные не только для растений, но и человека. В качестве примера можно привести представителей Bacillus spp., у которых при культивировании in vitro была выявлена высокая афлатоксин-деградирующая активность B. subtilis UTBSP1, Bacillus sp. TUBF1, B. licheniformis CFR1, а также бактерию Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus [65]. Интересен также штамм В. subtilis-2006В – основа коммерческого препарата “Микосубтил”, способный к деструкции в кормах до 95% афлатоксина В1 гриба A. flavus и T-2 токсина F. sporotrichiella [102].

Антивирусная активность бактериальных метаболитов. Информация о вирицидной активности метаболитов (липопептидов) ризосферных и эндофитных бактерий, в том числе рода Bacillus, весьма противоречива. Сообщается, что в растениях томатов, обработанных клетками B. subtilis М-22, наблюдалось значительное усиление развития некрозов и накопление вирусных частиц, вызывающих мозаику табака, в сравнении с контрольными растениями [103].

В тоже время, накапливаются многочисленные сведения об эффективной защите растений от вирусов препаратами на основе ризосферных и эндофитных бактерий и их метаболитов. Так, еще в 1965 г. Манн [104] обратил внимание на уменьшение степени поражения растений табака вирусом мозаики (ВТМ) после обработки растений культурой клеток и культуральной жидкостью бактерий B. uniflagellatus. Препарат, содержащий консорциум штаммов (PGPMC-1) B. licheniformis MML2501 + Bacillus sp. MML2551 + Pseudomonas aeruginosa MML2212 + Streptomyces fradiae MML1042, существенно уменьшал поражение растений подсолнечника вирусом некроза [105], а добавление к нему штаммов Streptomyces sp. PM5 и Trichothecium roseum MML005 усиливало этот защитный эффект [106]. Обработка консорциумом штаммов B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34 и B. pumilus T4 семян папайи и томатов способствовала в дальнейшем защите растений от вирусов кольцевой пятнистости и хлоротичной пятнистости соответственно [107]. Джетианон с соавт. [108] показали, что применение комплексного препарата “PGPR mixture”, содержащего клетки B. amyloliquefaciens IN937a и B. pumilus IN937b, защищало растения огурца от вируса мозаики. Применение препаратов, содержащих бактерии Bacillus spp., уменьшало степень поражения томата вирусом крапчатой мозаики, как в полевых условиях, так и в условиях закрытого грунта [109]. Предобработка почвы перед посевом табака бактерией Pseudomonas putida A3 уменьшала степень поражения растений вирусом ВТМ по сравнению с контролем без обработки почвы, а также обработкой почвы после посева. Комплексная оценка изолятов Bacillus spp., выделенных из ризосферы и тканей растений хлопчатника, по способности защищать от табачного стрик вируса выявила, что обработка растений суспензионной культурой эффективно уменьшала титр вирусов в растительных тканях [110]. Ризосферные бактерии B. amyloliquefaciens FZB24 и FZB42, внесенные в почву, способствовали меньшему проявлению симптомов вируса мозаики на листьях табака и уменьшению титра вируса в растительных тканях [111]. Применение бактерий штамма B. amyloliquefaciens MBI600, основы биофунгицида Serifel^® (“BASF”, Германия), эффективно защищало растения томата от вируса пятнистого увядания, а картофеля – от вируса Y [112].

Таким образом, в научной литературе накопилось довольно много данных о позитивном эффекте бактерий и их метаболитов в защите растений от вирусной инфекции. Механизмы защиты растений от вирусной инфекции с участием стимулирующих рост растений микроорганизмов и их метаболитов могут быть различными. Во-первых, бактерии (метаболиты) непосредственно сами могут связывать и разрушать вирусные частицы, что может быть следствием синтеза бактериями протеаз, нуклеаз и липопептидов [113]. Так обнаружено, что клетки P. putida A3 непосредственно разрушают частицы вируса в течение 30 мин в соке из листьев табака, инфицированных ВТМ [114]. Во-вторых, биоцидная активность липопептидов [93] предполагает, что они способны проявлять вирицидность опосредовано, так как бактерии (фитопатогенные), простейшие, грибы, нематоды и насекомые-фитофаги могут быть векторами-переносчиками большого числа вирусных инфекций растений. Например, обнаружено, что изолят B. subtilis ВS3A25 и его культуральный фильтрат сдерживали развитие вируса мозаики огурца на растениях томата посредством угнетения развития переносчика этого заболевания – бахчевой тли Aphis gossipi [115]. Продуцирующие сурфактин бактерии B. subtilis BMG02 эффективно защищали растения томатов от мозаики [27], что может быть связано с аффицидностью этого липопептида [92, 93]. Показано, что многократное уменьшение степени поражения свеклы ризоманией, вызываемой вирусом некротического пожелтения жилок (BNYVV), при обработке растений клетками бактерией B. amylolequifaciens было связано со значительным уменьшением численности плазмодиофорового псевдогриба Polymyxa betae – переносчика этого вируса, а также экспрессией растительных генов, кодирующих защитные белки, например, PR-8 и NPR-1 [116]. В-третьих, ассоциированные с растениями бактерии, могут эффективно защищать их от вирусов через активацию системной устойчивости хозяина различными микробными паттернами, в том числе и липопептидами [111, 112].

Липопептиды и фитоиммунитет. В потоке работ, характеризующих способность бактерий индуцировать защитные системы растений, особый интерес представляет информация о регуляции липопептидами функционирования компонентов фитозащитной системы. Способность липопептидов регулировать различные системы иммунитета растений доказывается различными методами, например с помощью: 1) сравнительного анализа свойств штаммов и линий с различным статусом накопления тех или иных липопептидов; 2) изменений условий совместного культивирования растений и эндофитных бактерий [34]; 3) целенаправленного нарушения структуры конкретных генов, ответственных за синтез липопептидов, с использованием векторов, например содержащих CRISPR-Cas9 [28] или транспозон Tn10 [53], приводящих к подавлению продукции этих антибиотиков.

Иммунная система животных и защитная система растений распознаёт бактериальные липопептиды благодаря их взаимодействию с рецепторными белками плазмалеммы, в том числе Toll-подобными рецепторами, относящимися, например, у животных к подгруппе “TLR2" (TLR1, TLR2 и TLR6) [117]. В растениях арабидопсиса интерлейкин-подобные рецепторы TIR, содержащие нуклеотидсвязывающий сайт и рецепторы, содержащие богатые лейцином повторности, участвовали в системной индуцированной устойчивости, активированной клетками B. cereus AR156, против гнили, вызываемой P. syringae pv. tomato (Pst) DC3000 [118].

Ассоциированные с растениями микроорганизмы (Pseudomonas sp. и Bacillus sp.) индуцируют фитоиммунную систему хозяев через механизм запуска жасмонат-этиленового сигнального пути, опосредованного сигнальным белком NRP-1, с участием бактериальных детерминантов, в том числе и липопептидов [87, 99]. Показано, что штамм B. subtilis BBG111 запускает устойчивость к возбудителю ризоктониоза R. solani в ризосфере риса, по меньшей мере, благодаря секреции фенгицина и сурфактина, вызывая реакцию сверхчувствительности и гибель клеток, причем иммунные реакции развиваются по жасмонат/этилен-, АБК- и ауксинзависимым сигнальным путям, что блокирует рост и развитие патогена на ранней стадии патогенеза [119].

Штамм B. subtilis 168 – продуцент сурфактина и фенгицина, усиливал устойчивость растений томатов и фасоли к грибу B. cinerea, посредством активации ферментов липоксигеназного пути [3], ответственных за синтез жасмоновой кислоты, регулирующей системно индуцированную устойчивость. Сурфактин индуцировал СИУ к болезням у растений фасоли, дыни, томата, табака и винограда, тогда как фенгицин – защитный ответ у картофеля, томатов и табака [120]. Обработка корней томатов липопептидом массетолид А из бактерии P. fluorescens повышала устойчивость листьев растений к оомицету P. infestans [20]. Клетки бактерий B. amyloliquefaciens 5113, продуцирующие сурфактин, индуцировали устойчивость растений рапса к грибу B. cinerea [121], также как бактерии B. amyloliquefaciens FZB42 − устойчивость растений латука к R. solani через жасмонат/этилен-зависимый сигнальный защитный путь экспрессии гена PDF 1.2 [122]. Рекомбинантные штаммы B. amyloliquefaciens FZB42, дефицитные по синтезу сурфактина (CH1), а также и сурфактина, и фенгицина, и бацилломицина Д (CH5) теряли способность индуцировать устойчивость растений салата к ризоктониозу [122].

Известно, что в культуре растительных клеток фенгицины индуцировали экспрессию генов, кодирующих ферменты фенолпропаноидного пути [56], а сурфактины − зависимое от ионов Са²⁺ подщелачивание среды, активную продукцию H₂O₂ [57] и ряд компонентов оксилипиновой сигнальной защитной системы [35, 123]. До недавнего времени было принято считать, что способностью вызывать устойчивость растений к болезням обладают только два семейства циклических липопептидов – сурфактины и фенгицины, однако недавние исследования доказывают наличие таких свойств и у итуринов [120, 124].

Показано, что в запуске защитной антибактериальной активности линий B. subtilis против листовой пятнистости и гнили тыквенных, соответственно вызываемых бактериями X. campestris pv. cucurbitae и P. carotovorum subsp. carotovorum важен итурин [57]. Микосубтилин, относящийся к группе итуринов, запускал защитные реакции у растений винограда [120], а липопептиды B. methylotrophicus XT1 CECT 8661 активировали антиоксидантную защитную систему плодов томата, винограда и клубники при хранении, что, по мнению авторов работы, является важным компонентом в последующей их защите от серой гнили [72]. Опрыскивание плодов цитрусовых культурой клеток штамма B. amyloliquefaciens DH-4, продуцирующего комплекс липопептидных метаболитов, эффективно защищало их от поражения грибом Penicillium digitatum [13].

Запускаемая эндофитами и их метаболитами устойчивость сохраняется в растениях долгое время, описывается в научной литературе термином “прайминг” и эффективно функционирует против патогенов даже в условиях хранения [125], наряду и с прямым биоцидным действием штаммов и их метаболитов на патогенов [126]. Она проявляется в каскадном раннем, быстром и многократном накоплении уровня активных форм кислорода в начале инфицирования, в запуске экспрессии редокс-чувствительных трансфакторов и генов PR-белков, а также в регуляции взаимодействия сигнальных путей. Так, обработка томата клетками ризобактерии P. putida LSW17S индуцировала быстрое накопление транскриптов PR-генов и продукцию Н₂О₂ в инфицированных P. syringae pv. tomato DC3000 растениях, что ингибировало развитие патогена. Уменьшение степени развития гриба Rhizopus stolonifer на плодах персика, обработанных клетками B. cereus AR156 и B. subtilis SM21, было связано с генерацией Н₂О₂, увеличением экспрессии генов хитиназы, β-1,3-глюканазы и фенилаланин-аммиак-лиазы и активностью их белковых продуктов [118]. Штаммы B. subtilis BSCBE4 и P. chlororaphis PA23 повышали активность пероксидазы и полифенолоксидазы в проростках перца, инфицированных Pythium aphanidermatum [110]. Обработка томата клетками B. thuringiensis сероваров fukuokaensis B88-82, sotto RG1-6, indiana RG5-17, israelensis, japonensis N141 и tohokuensis уменьшала степень поражения растений патогеном Ralstonia solanacearum, вызывающим вилт, что сопровождалось дифференциальной активацией в растениях генов PR-1, кислой хитиназы и глюканазы, ответственных за салицилатный путь развития защитных реакций [127].

Выявлено, что регуляторная активность самих клеток бактерий и метаболитов B. amyloliquefaciens FZB42 [128] и B. cereus AR156 [129] связана со способностью ингибировать, с участием растительных малых РНК miR846 и miR825/825 соответственно, естественный механизм РНК-интерференции генов супрессоров жасмонатной защитной системы. Анализ экспрессии малых РНК miR167 и miR393 в растениях табака, инокулированных бактерией B. subtilis ATCC21332 и, впоследствии, инфицированных клетками патогена Agrobacterium tumefaciens IBRCM10701, выявил дифференциальный характер этого процесса, связанный с многократным транзиторным накоплением этих РНК в инфицированных, но не бактеризованных растениях, который предотвращался в бактеризованных [130]. Авторы [130] выдвигают предположение, что в этой регуляторной системе, индуцирующей накопление флавоноидов, участвуют липопептиды B. subtilis.

Например, известно, что под влиянием ризосферных бактерий и их метаболитов в растениях экспрессируются гены, кодирующие защитные белки класса PR-4 и PR-10 [43, 131] с противовирусной активностью и, в том числе рибонуклеазной активностью. Маурхофер с соавт. [132] показали системное накопление салициловой кислоты и экспрессию защитных белков PR-1 в растениях табака под влиянием бактерий P. fluorescens CHA0, сопровождающуюся уменьшением степени инфицирования вирусом табачной мозаики. Выдвигается предположение, что и сами бактерии P. fluorescens могут синтезировать салициловую кислоту, наряду с низкомолекулярными липопептидами, например, псевдобактином [133]. Несмотря на то, что полученные данные предполагают участие псевдомонад в защите растений и через путь системной индуцированной устойчивости, опосредованный липопептидами, связанный с генерацией активных форм кислорода и запускающийся салициловой кислотой, использование клеток бактерий P. fluorescens, мутантных по синтезу этой сигнальной молекулы и псевдобактина, не доказало это предположение [133].

Это противоречит информации о том, что обработка томата клетками B. amyloliquefaciens MBI600 индуцировала устойчивость растений к вирусам пятнистого увядания томатов и Y-вирусу картофеля, сопровождающуюся экспрессией генов салицилат-индуцированного пути [112]. Важно отметить, что накопление PR-белков под влиянием эндофитных бактерий, например штамма B. amyloliquefaciens 5B6, сопровождалось уменьшением степени поражения растений вирусной инфекцией [131]. Показано, что в многократном снижении степени поражения растений свеклы ризоманией, вызываемой вирусом некротического пожелтения жилок (BNYVV), при обработке растений бактерией B. amylolequifaciens важную роль играет экспрессия генов защитных белков PR-8, NPR-1 [116].

Снижение пораженности растений банана вирусом Banana bunchy top virus (BBTV) с конечной эффективностью до 80% под влиянием обработки консорциумом ризосферной бактерий Pseudomonas fluorescens Pf1 и эндофитного штамма Bacillus spp. EPB22 и их метаболитов коррелировало с активацией пероксидазы, полифенолоксидазы и фенилаланин-аммиаклиазы, а также накоплением фенольных соединений [134]. Устойчивость к вирусу мозаики растений табака под влиянием бактерии Paenibacillus lentimorbus B-30488 была связана с экспрессией генов патоген-индуцируемых белков, генерацией активных форм кислорода и накоплением лигнина [135]. Берис с соавт. [112] объясняют формирование устойчивости томатов к вирусу пятнистого увядания и вирусу картофеля Y под влиянием бактерий, ассоциированных с растениями, сочетанной индукцией экспрессии генов защитных белков, преимущественно салицилатного и, частично, жасмонатного сигнальных путей. Бактерии B. subtilis BMG02, продуцирующие сурфактин, формировали устойчивость растений томата к вирусу мозаики ToMV и экспрессию генов, кодирующих фенилаланин-аммиаклиазу и 1,3-глюканазу [27]. Авторы полагают, что защитные системы, индуцируемые бактериями, запускаются с участием генов как салицилатного, так и жасмонатного сигнальных путей.

В последнее время стали появляться работы, свидетельствующие об эффективном развитии иммунной реакции растений под влиянием бактерий и их метаболитов в ответ на заселение растений насекомыми. Так, показана дифференциальная индуцированная экспрессия защитных генов в иммунизированных B. velezensis YC7010 растениях риса после заселения дефальцидами Nilaparvata lugens Stål. [136]. Доказано, что в индукции бактериями устойчивости растений риса к дефальцидам участвует циклический липопептид бацилопептин.