Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 1, стр. 35-38

МЕТОДИКА

В работе использовали акриламид, п-нитроанилид N-α-бензоил-D,L-аргинина (БАПА) и декстран с ММ 125000 Да (“Serva”, Германия), трипсин, панкреатический ингибитор трипсина (ПИТ), ингибитор трипсина из сои (СИТ), родамин-В-изотиоцианат и флуоресцеин-изотиоцианат на цеолите (“Sigma”, США), утиный овомукоид (ОМ, ММ 31000 Да) (“Белмедпрепараты”, Беларусь), сефадексы G-25 и G-100 (“Pharmacia”, Швеция). N-aкрилоилгидроксифталимид (АГФИ) синтезировали по методике [8].

Родамин- (РТ) и флуоресцеинмеченный трипсин (ФТ) получали реакцией трипсина с родамин-В- или флуоресцеин-изотиоцианатом на цеолите. Раствор отфильтровывали от цеолита и отделяли от непрореагировавшего красителя на сефадексе G-25.

Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре F-4000 (“Hitachi”, Япония).

Иммобилизацию трипсина на декстране проводили по методике [9]. При этом для иммобилизации была использована смесь РТ и ФТ (мольное соотношение 2 : 1). Продукты иммобилизации отделяли от непрореагировавших компонентов гель-фильтрацией на сефадексе G-100.

Иммобилизацию аналогичной смеси РТ и ФТ на полиакриламиде осуществляли взаимодействием свободных аминогрупп молекул фермента с предварительно синтезированным активированным сополимером акриламида и АГФИ. Молекулярную массу полимеров оценивали методом визкозиметрии [10].

Амидазную активность нативного и иммобилизованного трипсина определяли, измеряя степень гидролиза БАПА по методу Какадэ [11]. Активность фермента выражали в %, принимая за 100% активность нативного фермента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для выяснения роли конформационного состояния макромолекулы полимера-носителя в проявлении активности иммобилизованным ферментом были использованы два полимера: природный полисахарид – декстран, и карбоцепной синтетический полимер – полиакриламид. В растворе макромолекула полиакриламида находится в конформации статистического клубка, в котором внутримолекулярная концентрация собственных звеньев не превышает 1 мас. %. [12]. Макромолекула декстрана имеет более плотную упаковку и форму жесткого клубка [13].

Для иммобилизации на декстране фермент предварительно окисляли перйодатом калия. Продукт окисления содержал 51 ± 6 альдегидных групп, которые определяли спектрофотометрически с помощью 4-амино-3-гидразино-5-меркапто-1,2,4-триазола [14]. Взаимодействием альдегидных групп декстрана с аминогруппами трипсина и восстановлением азометиновой связи боргидридом натрия были получены и выделены производные декстрана, каждая макромолекула которого содержала в среднем от одной до семи молекул трипсина.

Иммобилизацию меченного трипсина на полиакриламиде проводили, используя сополимеры акриламида и АГФИ, имеющие молекулярную массу 104 000–107 000 Да. Изменением концентрации взаимодействующих соединений были получены и выделены производные, каждая молекула которых содержала в среднем от одной до шести молекул фермента.

Результаты изучения активности иммобилизованного трипсина по отношению к низко- и высокомолекулярным субстратам приведены в табл. 1. Из табл. 1 видно, что изменение природы полимерной цепи лишь в незначительной степени влияло на активность иммобилизованного трипсина по отношению к низкомолекулярному субстрату – БАПА. Так, активность трипсина, иммобилизованного на декстране, составляла 69–80% от активности нативного фермента, а трипсина, связанного с полиакриламидом – 66–74%. При этом активность фермента практически не зависела от количества его молекул, связанных с носителем. Следовательно, при иммобилизации трипсина на обоих носителях не создавалось значительных стерических препятствий для взаимодействия активных центров соседних молекул фермента с субстратом.

Иная картина наблюдалась при изучении активности иммобилизованного трипсина по отношению к высокомолекулярным соединениям. Эту активность оценивали, изучая состав комплексов трипсина с панкреатическим ингибитором (ММ 6500 Да), ингибитором из сои (ММ 21 000 Да) и овомукоидом (ММ 31 000 Да). Все эти ингибиторы подавляли активность трипсина путем образования комплекса с константой связывания порядка 10¹⁰ М^–1 [15].

Из данных табл. 1 видно, что в этом случае активность иммобилизованного трипсина определялась природой используемого носителя и количеством связанных с ним молекул фермента. Если это количество невелико (1–2 молекулы трипсина на одну макромолекулу носителя), то активность иммобилизованного трипсина практически не зависела от природы носителя и слегка уменьшалась (с 66–70 до 45–51% от активности нативного фермента) с увеличением молекулярной массы ингибитора с 6500 до 31 000 Да.

Конформационное состояние полимера носителя начинало проявляться при увеличении числа связанных с полимером молекул трипсина. Активность иммобилизованного на полиакриламиде трипсина (Т-ПАА) оказалась значительно ниже, чем активность фермента, иммобилизованного на декстране (Т-Д). При этом, чем выше молекулярная масса ингибитора, тем больше была эта разница.

В предыдущих работах [1–3] было высказано предположение, что такое снижение активности может быть обусловлено белок-белковыми взаимодействиями, характерными для поведения белков в растворе, то есть внутримолекулярной ассоцицией связанных с молекулой полимера белковых глобул. Для проверки этого предположения в данной работе был использован метод флуоресцентной спектроскопии (рис. 1).

Рис. 1.

Зависимость интенсивности флуоресценции (отн. ед.) при 518 нм смеси ФТ и РТ (1) и ФТ и РТ, иммобилизованных на декстране (2) и на полиакриламиде (3), от концентрации фермента (соотношение ФТ и РТ – 1 : 2).

На рис. 1 приведена зависимость интенсивности флуоресценции водных растворов, полученных при смешивании ФТ и РТ (1) и при иммобилизации этой смеси на декстране (2) и полиакриламиде (3), от концентрации фермента. Видно, что интенсивность флуоресценции ФТ, иммобилизованного совместно с РТ на декстране, была несколько ниже, чем раствора смеси ФТ и РТ, то есть происходила передача части энергии с донора (Ф) на акцептор (Р). В существенно большей степени эффект понижения интенсивности флуоресценции был характерен для ФТ, иммобилизованного совместно с РТ на полиакриламиде. Эти результаты свидетельствовали о том, что при иммобилизации образовывались ассоциаты ФТ и РТ, в которых расстояние между метками оказывалось значительно меньше среднего расстояния, рассчитанного для равномерного распределения белковых глобул [16]. В наибольшей степени этот эффект наблюдался для трипсина, иммобилизованного на гибком носителе, полиакриламиде. Жесткая структура глобулы декстрана препятствовала сближению иммобилизованных на ней молекул фермента, что и обеспечивало их доступность даже для относительно высокомолекулярного ингибитора.

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что конформация макромолекул полимера-носителя является одним из основных факторов, определяющих активность иммобилизованного белка по отношению к высокомолекулярным субстратам. Так, молекулы белка, иммобилизованные на гибком носителе, образовывали ассоциаты, создавая тем самым стерические препятствия для взаимодействия с высокомолекулярным субстратом. Жесткие цепи носителя предотвращали такую ассоциацию, обеспечивая доступность его активных центров для высокомолекулярных субстратов. Для низкомолекулярных субстратов такая ассоциация не являлась определяющей и молекулы белка сохраняли высокую активность после иммобилизации на носителе, как с гибкой, так и жесткой цепью. Полученные результаты открывают еще одну возможность регулирования специфичности действия ферментов путем подбора носителя с разной гибкостью полимерной цепи.

Работа выполнена в рамках Государственного задания ИНХС РАН.