1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 56, № 3, 2020

Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 3, стр. 301-304

Содержание карнозина в мышечной ткани осетровых и их гибридов

М. В. Михайлова 1, В. Н. Прозоровский 1, К. В. Золотарёв 1, *, О. М. Ипатова 1, А. Н. Михайлов 1, Е. Н. Харенко 2, А. В. Артёмов 2

1 Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича
119121 Москва, Россия

2 Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии
107140 Москва, Россия

* E-mail: fireaxe@mail.ru

Поступила в редакцию 20.11.2019
После доработки 16.12.2019
Принята к публикации 23.12.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

В работе описан и апробирован новый чувствительный метод масс-спектрометрического определения карнозина в мышечной ткани рыб, с помощью которого впервые получены значения содержания карнозина в мышцах нескольких видов рыб семейства осетровые: русский осетр, сибирский осётр, стерлядь, а также гибридов стерляди и калуги, сибирского осетра и калуги. Гибриды стерляди и калуги, вне зависимости от пола, содержали в 3.33 раза больше карнозина (p < 0.01), чем стерлядь. Ткани самок гибрида сибирского осетра и калуги содержали в 1.50 раза меньше карнозина (p < 0.1), чем самки сибирского осетра. Поскольку потребление карнозина важно для биосинтеза собственного карнозина в мышцах человека, то по пищевой ценности гибридизация стерляди с калугой целесообразнее по сравнению с исходными видами, а скрещивание сибирского осетра с калугой менее эффективно. Измерение содержания карнозина в мышечной ткани важно для оценки их пищевой ценности.

Ключевые слова: карнозин, метод определения, русский осетр, сибирский осетр, стерлядь, калуга, гибриды осетровых

Карнозин (β-аланил-L-гистидин) – дипептид, состоящий из аминокислот β-аланина и гистидина, соединенных пептидной связью, вместе с производными (анзерин, баленин, гомокарнозин) образует семейство дипептидов, выполняющих одинаковые функции и представленных в скелетных мышцах и нервной системе позвоночных. Содержание данных дипептидов в других тканях пренебрежимо мало [1, 2]. В мышечной ткани основная роль карнозина и его аналогов – поддержание pH внутри клеток (буферная функция), что особенно важно при интенсивной мышечной работе, приводящей в условиях недостатка кислорода к накоплению молочной кислоты и закислению среды. Кроме буферного действия, карнозин и его аналоги являются антиоксидантами (защищают мышечную ткань при окислительном стрессе) прямого и косвенного действия. Прямое действие состоит во взаимодействии с биологическими окислителями в в качестве восстановителя, косвенное – в предотвращении протонирования иона ${\text{O}}_{{\text{2}}}^{ - }$ с образованием OH-радикала (сильный окислитель) за счет буферного свойства дипептида. Карнозин также способен связывать ионы тяжелых металлов за счет образования донорно-акцепторных связей, продукты перекисного окисления липидов, является источником гистидина (предшественника гистамина). В нервной ткани карнозин является частью защитного механизма от некроза, вызываемого гомоцистеиновой кислотой [3].

Для большинства пептидаз карнозин, благодаря тому, что включает в себя остаток β-аминокислоты, недоступен. Разложение карнозина, поступающего с пищей, происходит в печени и крови, а также внутри клеток с помощью специальных ферментов – карнозиназ [3]. В клетках мышечной и нервной ткани происходит биосинтез карнозина из продуктов его разложения. Таким образом, основной источник карнозина в организме – карнозин, поступающий с пищей. Изучение свойств карнозина показало, что он полезен в качестве компонента пищевого рациона, а его содержание в мясных и рыбных продуктах может характеризовать их пищевую ценность. Данные о содержании карнозина в мышечной ткани представляют научную и практическую значимость при разработке продукции функционального и специализированного назначения.

В настоящее время в мировой литературе накоплены данные по значительному количеству видов рыб [1, 2]. Однако, что касается осетровых (Acipenseridae), то в литературе есть только устаревшие данные о содержании карнозина в мышцах осетра без указания конкретного вида рыбы и методики определения [4].

Цель работы − получение новых данных о содержании карнозина в мышцах рыб различных видов семейства осетровых и их гибридов.

МЕТОДИКА

В данной работе исследовали следующие виды семейства осетровые: русский осетр (Acipenser gueldenstaedtii), сибирский осётр ленской популяции (Acipenser baerii), стерлядь (Acipenser ruthenus), а также полученных в искусственных условиях гибриды стерляди и калуги (Huso dauricus) (обозначение Ст × К), гибрида сибирского осетра ленской популяции и калуги (ЛО × К).

Все особи исследуемых видов и гибридов выращивались в садках в естественном водоeме (Вологодская обл., р. Суда, Россия). Образцы мышечной ткани отбирали на анализ в июле. Для получения гибридов использовали икру половозрелых самок стерляди и сперму калуги, икру самок сибирского осетра и сперму калуги. Икру получали путeм подрезания яйцеводов с сохранением жизни производителям. Оплодотворение проводили полусухим способом. После обесклеивания икру инкубировали в специализированных аппаратах. Молодь подращивали в стандартных пластиковых бассейнах. Подрощенную рыбу пересаживали в садки для дальнейшего выращивания.

Для анализа отбирали взрослых здоровых особей в количестве по 5 самцов и самок каждого исследуемого вида и гибрида. После изъятия рыбы из воды ее подвергали анестезии на льду. Образцы мышечной ткани (~1.0 г) отбирали со спинной и хвостовой части рыбы, замораживали до температуры −18°С и хранили в замороженном виде вплоть до определения карнозина.

Для анализа взвешивали 0.1 г замороженной ткани от каждого образца, помещали в микропробирку (эппендорф), заливали для экстракции 1.0 мл 0.1%-ного водного раствора муравьиной кислоты. Пробирки закрывали и помещали в водяную баню в пластиковом стакане для гомогенизации ультразвуком в гомогенизаторе “Bandelin Sonopuls HD 2200” (“Bandelin Еlectronic” GmbH & Co. KG, Германия) при мощности 95% в течение 10 мин. Из полученных гомогенатов отбирали по 0.1 мл и добавляли по 0.9 мл метанола, интенсивно встряхивали в течение 1 мин для осаждения белков, затем центрифугировали 10 мин при 6600 g. Отбирали по 0.1 мл надосадочной жидкости и добавляли по 0.9 мл 0.1%-ного водного раствора муравьиной кислоты.

Определение содержания карнозина проводили на жидкостном хроматографе “Agilent 6130” (Agilent Technologies, США) с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором. Для этого на колонку (неподвижная фаза – радикал С18 с полярной функциональной группой) вводилось по 10 мкл образца. Хроматографическое разделение образцов выполняли в изократическом режиме: подвижная фаза – раствор 10%-ного ацетонитрила и 0.09%-ной муравьиной кислоты в воде. Скорость элюирования 0.5 мл/мин. Карнозину соответствовал пик с отношением массы к заряду 227.3 в положительном режиме ионизации. Калибровку проводили, используя растворы карнозина с концентрацией в интервале 0.2–4.0 мг/л, содержащие 0.1% муравьиной кислоты.

Статистическую обработку полученных данных: вычисление среднего арифметического, среднеквадратичного отклонения, уровня значимости по распределению Стъюдента проводили с помощью программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение использованного метода определения карнозина (см. раздел Методика) с описанными ранее в литературе по интервалам концентраций карнозина, в которых наблюдалась хорошая линейность зависимости интенсивности сигнала от концентрации, показало, что метод наиболее чувствителен среди использующих масс-спектрометрический детектор и один из наиболее чувствительных методов среди описанных (табл. 1).

Таблица 1.  

Сравнение методов определения карнозина в тканях рыб c использованием жидкостной хроматографии, опубликованных ранее и использованных в работе

Тип детектора Пределы линейности сигнала, мг/л Реактив для дериватизации Источник
Масс-спектрометрический 0.2–4.0 Нет Данная статья
УФ(диодная матрица) 32.4–388.0 2,5-диметил-1-H-пиррол-3,4-дикарбальдегид [6]
УФ 10–100 Нет [7]
УФ (диодная матрица) 14–24 2,4-Динитрофторбензол [8]
УФ (диодная матрица) 0.007–3.12 Дансилхлорид [9]
УФ (диодная матрица) 30–110 2,4-Динитрофторбензол [10]
Масс-спектрометрический 1–200 Нет [11]
УФ 9.8–98 Нет [12]
УФ (диодная матрица) 13–416 Нет [13]
Масс-спектрометрический 2.3–56.5 Дабсилхлорид [14]
Импульсный амперометрический 0.023–22.6 Нет [15]

Хроматографические системы с масс-спектрометрическим детектором наиболее распространены в современной аналитической химии. Популярность данного типа систем вызвана несколькими факторами: прежде всего, многозадачность аппаратуры (любое соединение имеет массу и может ими определяться), а также относительно невысокая стоимость. В любой лаборатории хроматографическая система устанавливается не только для определения карнозина; параллельно с ним можно определять, например, аминокислоты и другие пептиды в рамках одного измерения. В связи с этим мы считаем целесообразным как сравнение данного метода с другими, где использовался масс-спектрометрический детектор, так и со всеми остальными.

Карнозин – гидрофильное соединение, поэтому в ряде опубликованных методов проводилась его дериватизация – химическая модификация вещества с целью удлинения углеродного скелета и увеличения гидрофобности, обеспечивающее большее сродство с материалами носителей или сорбентов хроматографических колонок с высокой разделительной способностью. В работе использовали колонку с полярной функциональной группой, что позволяло исключить дериватизацию и упростить метод. Кроме того использование такого носителя даёт возможность одновременно измерять концентрации и других соединений сходного строения в образце, например, других дипептидов и свободных аминокислот.

Результаты определения содержания карнозина в исследуемых образцах приведены в табл. 2. Статистическая обработка данных даeт возможность сделать следующие заключения.

Таблица 2.  

Содержание карнозина в мышечной ткани осетровых и их гибридов*

Объект Пол Содержание карнозина, мг/г ткани Источник
Гибрид Ст × К ♂ 1.716 ± 0.305 Данная статья
Гибрид Ст × К ♀ 1.416 ± 0.224
Гибрид Ст × К (среднее по всем особям) Смесь 1.566 ± 0.290
Стерлядь Смесь 0.470 ± 0.103
Гибрид ЛО × К ♂ 2.358 ± 0.359
Гибрид ЛО × К ♀ 1.454 ± 0.282
Сибирский осeтр ♀ 2.176 ± 0.185
Русский осeтр ♀ 2.012 ± 0.251
Гибрид К × Ст Нет данных 1.56 [5]
Осeтр (без уточнения вида) Нет данных 2.50 [4]

* Результаты представлены как среднее арифметическое ± среднеквадратичное отклонение.

− Не обнаружено значимых различий по содержанию карнозина в мышцах особей гибрида стерляди и калуги разного пола (интервалы значений перекрываются). Для сравнения со стерлядью было целесообразно использовать среднее значений разных особей данного гибрида (третья строка табл. 2).

− Сравнение содержания карнозина в мышечной ткани гибрида Ст × К и стерляди показало, что в мышцах гибрида содержалось в 3.33 раза больше карнозина (при уровне значимости p < 0.01 согласно распределению Стьюдента).

− Выявлены существенные различия по содержанию карнозина между особями разного пола (самцами и самками) гибрида ЛО × К: мышцы самцов содержали в 1.62 раза больше карнозина (p < 0.05).

− При сравнении содержания карнозина в мышцах самки гибрида ЛО × К с самкой сибирского осетра можно заключить, что в мышцах гибрида содержалось в 1.50 раза меньше карнозина (p < 0.1).

− Не было обнаружено значимых различий в содержании карнозина в тканях самок близкородственных видов осетра – русский осетр и сибирский осетр ленской популяции (интервалы значений перекрываются).

В табл. 2 также представлены опубликованные ранее данные по другим видам и гибридам осетровых. В частности, гибрид, при получении которого использовалась икра калуги и сперма стерляди (К × Ст), содержал примерно столько же карнозина, как и рассмотренный в данной работе гибрид Ст × К, однако авторы [5] приводят данные только по одной особи гибрида К × Ст.

Если рассматривать содержание карнозина как существенный фактор пищевой ценности, то можно заключить, что гибридизация стерляди с калугой целесообразнее по сравнению с чистым родительским видом (стерлядью) по пищевой ценности мышечной ткани, а использование гибрида сибирского осетра с калугой по сравнению с осетром в технологическом аспекте является менее эффективным.

Работа выполнена в рамках “Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013–2020 гг.”.

Список литературы

  1. Abe H. Histidine-related ipeptides: Distribution, Metabolism, and Physiological Function // Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, V. 4. / Eds. Hochachka and Mommsen. Amsterdam: Elsevier Science B.V., 1995. P. 309–333.

  2. Boldyrev A.A., Aldini G., Derave W. // Physiol Rev. 2013. V. 93. Issue 4. P. 1803–1845.

  3. Болдырев А.А. // Биохимия. 2012. Т. 77. № 4. С. 403–418.

  4. Boldyrev A.A., Severin S.E. // Adv. Enzyme Regul. 1990. V. 30. P. 175–188.

  5. Давлетшина Т.А., Шульгина Л.В. // Рыбпром. 2010. № 1. С. 47–50.

  6. Gatti R. // Chromatographia. 2015. V. 78. Issue 15–16. P. 1095–1099.

  7. Abdelkader H., Swinden J., Pierscionek B.K., Alany R.G. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2015. V. 114. P. 241–246.

  8. Khalikova M.A., Satinsky D., Solich P., Zinchenko A.A., Zhilyakova E.T., Novikov O.O. // Anal. Methods. 2014. V. 6. Issue 5. P. 1475–1481.

  9. Szterk A., Roszko M. // J. Liq. Chromatogr. Related Technol. 2014. V. 37. Issue 5. P. 664–680.

  10. Gatti R., Andreatta P., Boschetti S. // J Chromatogr A. 2013. V. 1298. P. 95–102.

  11. Peiretti P.G., Medana C., Visentin S., Giancotti V., Zunino V., Meineri G. // Food Chem. 2011. V. 126. Issue 4. P. 1939–1947.

  12. Han M.-N., Chen X.-H., Qi Q.-G., Ji X.-Y., Bi K.-S. // Chinese Pharmaceutical Journal. 2009. V. 44. Issue 14. P. 1111–1113.

  13. Tian Y., Xie M., Wang W., Wu H., Fu Z., Lin L. // Eur Food Res Technol. 2007. V. 226. Issue 1–2. P. 311–314.

  14. Chen Y.-H., Lin Y.-P., Liou S.-E., Chen C.-C. // Int. J. Food Sci. Technol. 2007. V. 42. Issue 5. P. 593–600.

  15. Nardiello D., Cataldi T.R.I. // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1035. Issue 2. P. 285–289.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал