Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 3, стр. 250-256

МЕТОДИКА

Культивирование штамма – продуцента. Штамм Emericellopsis alkalinа ВКПМ F-1428 (Hypocreales, Ascomycota) депонирован в ВКПМ, коллекции “Грибы экстремальных местообитаний” кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и коллекции продуцентов Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе, как продуцент комплекса антимикробных пептидов. Штамм E. alkalinа синтезирует комплекс липофильных соединений пептидной природы, преобладающим среди которых является липопептаибол эмерициллипсин А, обладающий антимикробным действием в отношении широкого спектра дрожжевых и мицелиальных грибов, а также грамположительных бактерий [15].

Культивирование штамма для накопления эмерициллипсина А осуществляли в стационарных условиях в течении 14 сут в колбах Эрленмейера на специализированной жидкой щелочной среде, подобранной ранее [2]. В качестве посевного материала использовали 5-суточную культуру гриба, выращенную на агаризованной щелочной среде [2]. Мицелий и споры отделяли от культуральной жидкости центрифугированием.

Выделение эмерициллипсина А. Эмерициллипсин А выделяли из культуральной жидкости по ранее разработанной схеме выделения, описанной в работах [2, 12]. Разделение активных фракций, выделение и очистку пептида проводили последовательно методами экстракции, прямо-фазной и гидрофобной хроматографии, как описано ранее. Для выделения индивидуального компонента использовали аналитическую обращено-фазовую ВЭЖХ. Обогащенный концентрат, полученный после растворения упаренного этилацетатного концентрата культуральной жидкости, наносили на колонку XBridge BEH 4.6 × 250 мм (“Waters”, Ирландия) с неподвижной фазой С18 и осуществляли фракционирование в градиенте повышения концентрации ацетонитрила в воде с добавлением 0.1% трифторуксусной кислоты: 16–28% – за 12 мин; 28–55% – за 27 мин; 55–75% – за 20 мин и 75–85% – за 10 мин, с последующим изократическим элюированием в течение 25 мин. Детектирование поглощения разделяемых веществ осуществляли при трех длинах волн (214, 247 и 280 нм). Эмерициллипсин А детектировали по поглощению при длине волны 214 нм и времени удержания согласно протоколу, описанному в работе [12].

Тест-микроорганизмы. Клинические изоляты бактерий Staphylococcus aureus (4 изолята), Enterococcus faecalis (4 изолята), E. faecium (1 изолят), Acinetobacter baumannii (2 изолята), Klebsiela pneumoniae (1 изолят), выделенные из клинического материала различных пациентов, были взяты из коллекции культур лаборатории инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, ЦНИИ эпидемиологии (Москва, Россия). Стафилококки характеризовались чувствительностью к аминогликозидам, фторхинолонам, гликопептидам и β-лактамам, за исключением пенициллинов; энтерококки – к ампициллину, ванкомицину, линезолиду, нитрофурантоину (за исключением резистентности E. faecium к ампициллину); K. pneumoniae – к цефалоспоринам, карбапенемам, аминогликозидам, фторхинолонам. Изоляты A. baumannii с множественной лекарственной устойчивостью сохраняли чувствительность только к колистину. Тест-культуры клинических изолятов Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes и Candida albicans, выделенные из биологических жидкостей особей крупного рогатого скота, были взяты из коллекции кафедры микробиологии и заразных болезней Оренбургского государственного аграрного университета.

Формирование in vitro биопленок. Тестируемые бактерии выращивали на плотной питательной среде 18 ч при температуре 37°С. Из выросших культур готовили бактериальную суспензию плотностью 0.5 мкФ в бульоне Мюллер-Хинтона, которую затем разбавляли до концентрации 10⁵ КОЕ/мл. Приготовленный инокулят тестируемых бактерий добавляли по 150 мкл в лунки 96-луночного планшета, в которые помещали стерильные тефлоновые кубики размером 4 × 4 мм для формирования на их поверхности биопленок. Инкубировали в течение 20 ч на орбитальном шейкере при скорости вращения 110 об./мин и температуре 35°С [15, 16].

Антимикробная активность, ассоциированная с разрушением сформированных биопленок (антибиопленочная активность). Кубики, содержащие биопленки, переносили в лунки 96-луночного микротитровального планшета с 200 мкл серийных двукратных разведений АМП и инкубировали в течение 18 ч при 37°С. Для определения минимальной биоцидной концентрации пептида (МБК) в отношении дисперсных клеток биопленки оценивали самую низкую его концентрацию, которая обеспечивала выживаемость субкультуры <0.1%. С этой целью отбирали аликвоты по 10 мкл из лунок без видимого роста, проводили посев на плотные питательные среды и инкубировали в течение 20 ч при 37°C. Тефлоновые кубики промывали для удаления неприкрепленных бактериальных клеток, а затем механически разрушали биопленки на поверхности кубиков. Для определения минимальной биоцидной концентрации АМП, уничтожающей биопленку (МБКб), разрушенные биопленки рекультивировали в бульоне Мюллера-Хинтона и определяли возобновление роста бактерий [16].

Антимикробная активность in vitro, ассоциированная с подавлением формирования биопленок. Изоляты бактерий инкубировали при 37°C, 24 ч в присутствии различных концентраций эмерициллипсина A в 96-луночных планшетах, в лунки которого помещали тефлоновые кубики. Каждая лунка планшета с кубиком содержала 200 мкл инокулята плотностью 10⁵ КОЕ/мл. После инкубации отработанную среду аспирировали, а кубики промывали раствором для удаления неприкрепленных бактерий и высушивали на воздухе. Образование связанной с поверхностью кубиков биопленки анализировали путем их окрашивания 0.1% водным раствором кристаллического фиолетового в течение 5 мин и дальнейшим экстрагированием кристаллического фиолетового этанолом. Затем измеряли оптическую плотность полученных растворов при 595 нм (ОП₅₉₅). При обработке результатов оптическая плотность, полученная в результате окрашивания кубиков без биопленки, не учитывалась [16, 17].

Статистический анализ. Результаты анализа ингибирования образования биопленки представлены в виде средних значений ± стандартные отклонения. Для сравнения различий между контрольными и обработанными антимикробными биопленками использовался однофакторный дисперсионный анализ с помощью множественного сравнительного теста Бонферрони. Значение p < < 0.005 считалось статистически значимым [18].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Антибактериальная активность эмерициллипсина А. Как было отмечено ранее [12] эмерициллипсин А представляет собой пептидный антибиотик, обладающий разнонаправленным спектром антимикробного действия. Фунгицидная активность выражается в неспецифическом действии на эукариотические патогенные дрожжевые и мицелиальные виды грибов, обладающие высоким уровнем резистентности к традиционным противогрибковым препаратам группы азолов и макроциклов с клеточной мембраной. Антибактериальный эффект антибиотика менее выражен, чем антифунгальный, и имеет явно выраженную специфичность. Стоит отметить, что ингибирующее действие данного вещества направлено преимущественно на грамположительные бактерии: так, активность по отношению к S. aureus и B. cereus (4 и 16 мкг/мл соответственно) сопоставима с эффектом, достигаемым при применении ванкомицина (3 и 12 мкг/мл, соответственно) [12], тогда как клинические изоляты E. fecalis подавлялись на уровне МБК лишь при 40 мкг/мл. Характерно, что антимикробная активность эмерициллипсина А против грамотрицательных форм была гораздо менее выражена и МБК превышала 300 мкг/мл. По отношению к таким бактериям характер действия изучаемого пептидного токсина можно классифицировать как бактериостатический, не ассоциированный непосредственно с взаимодействием с клеточной оболочкой.

Влияние эмерициллипсина А на разрушение биопленок, сформированных бактериями. С целью исследования возможного механизма антибактериального действия эмерициллипсина А была проверена его активность в отношении планктонных и прикрепленных клеток у культур грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов и образованных ими биопленок (табл. 1).

Планктонные клетки тестируемых клинических бактерий показали различную чувствительность к пептиду, значения составили МБК от 12.5 до 50.0 мкг/мл, что в отдельных случаях не превышало концентрации клинически эффективных антибиотиков, за пределами которых определяется устойчивость бактерий, и рекомендованных EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing): амикацина (R > 16 мкг/мл), фосфомицина (R > 32 мкг/мл) в отношении стафилококков; нитрофурантоина (R > 64 мкг/мл) в отношении E. faecalis.

Антибиопленочная активность пептида находилась в диапазоне от 50 до 200 мкг/мл для грамположительных бактерий (S. aureus, E. faecium, E. faecalis) и превышала 200 мкг/мл – для грамотрицательных (A. baumannii, K. pneumoniae), что свидетельствовало о слабом действии эмерициллипсина A на предварительно сформированные биопленки клинических грамотрицательных бактерий. Наблюдаемое повышение устойчивости бактериальных биопленок к эмерициллипсину A, по сравнению с планктонными культурами, согласуется со многими данными по резистентности биопленок к любым антимикробным агентам [15, 16]. Исследуемый антибиотик не обладал способностью к активному взаимодействию с экзополисахаридным матриксом, составляющим основу бактериальных биопленок, что, по-видимому, определяется, в первую очередь, отсутствием функциональных групп на его поверхности.

Влияние эмерициллипсина А на формирование биопленок клиническими изолятами бактерий. Установлено, что эмерициллипсин A ингибировал образование биопленок клиническими изолятами S. aureus (рис. 1). Максимальный эффект наблюдался при концентрациях пептида, соответствующих 1/2 МБК и составил от 73.2 до 97.8%, в зависимости от изолята. При концентрации 1.5 мкг/мл образование биопленки достоверно уменьшилось на 53.0, 56.0, 53.1% соответственно S. aureus 1, 2, 3. В отношении E. faecalis 6, 7, 8, 9 ингибирующий эффект наблюдался при 1/2 МБК и составил 87.6, 94.8, 69.3, 98.2% соответственно (рис. 2). Концентрации пептида в 8 раз ниже МБК способствовали уменьшению образования биопленки E. faecalis 6, 7, 8, 9 на 56.8, 68.0, 30.0, 51.4% соответственно. Для клинического изолята E. faecium и грамотрицательных бактерий A. baumannii 11, K. pneumoniae 12 достоверное ингибирование образования биопленок наблюдалось только при 1/2 МБК и составило 39.0, 53.2, 57.1% соответственно.

Рис. 1.

Анализ образования биопленки (ОП₅₉₅) штаммами S. aureus при различных концентрациях эмерициллипсина А (мкг/мл): а – S. aureus 1; б – S. aureus 2; в – S. aureus 3; г – S. aureus 4. ** Концентрации пептида, при которых наблюдались статистически значимые различия между контрольными биопленками и биопленками, образующимися в присутствии пептида (p < 0.005).

Рис. 2.

Анализ образования биопленки (ОП₅₉₅) штаммами E. faecalis при различных концентрациях эмерициллипсина А (мкг/мл): а – E. faecalis 6; б – E. faecalis 7; в – E. faecalis 8; г – E. faecalis 9. ** Концентрации пептида, при которых наблюдались статистически значимые различия между контрольными биопленками и биопленками, образующимися в присутствии пептида (p < 0.005).

Таким образом, субингибирующие концентрации эмерициллипсина А предотвращали образование бактериальных биопленок in vitro в отношении грамположительных бактерий наиболее эффективно, чем в отношении грамотрицательных, при этом наблюдалось достоверное различие как между клиническими изолятами одного вида бактерий, так и между изолятами различной видовой принадлежности.

В работе впервые показано влияние антимикробных метаболитов грибов из группы пептаиболов на способность к ингибированию патогенных форм бактерий через воздействие на образование биопленок, что является одним из ключевых факторов антибиотикорезистентности. При этом, как было отмечено ранее, наиболее выраженный эффект был продемонстрирован в отношении грамположительных форм, что определяет специфичность антибактериального действия данного пептида. Полученные результаты расширяют понимание механизмов антимикробной активности секретируемых мицелиальными грибами метаболитов и их селективное воздействие на сопутствующую микробиоту при конкурентных взаимоотношениях в сообществах.

Авторы выражают благодарность сотрудникам кафедры микробиологии и заразных болезней Оренбургского государственного аграрного университета и лично Сычевой М.В. за помощь в исследовании антимикробных свойств эмерициллипсина А.

Работа по выделению и накоплению эмерициллипсина А для биологических испытаний выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 18-74-10073), работа по культивированию продуцента при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-34-90088.