Прикладная биохимия и микробиология, 2021, T. 57, № 5, стр. 432-440

СТРУКТУРНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ, СИНТЕЗ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ГРИБНЫХ ПЕПТАИБОЛОВ

Пептаиболы – самая большая группа пептаибиотиков, представляют собой антимикробные пептиды грибов, содержащие от 4 до 21 аминокислотных остатка, с молекулярной массой от 500 до 2200 Да. Бенедетти с соавт. [2, 24] в 1983 г. определили “пептаиболы” как небольшие пептиды с высоким содержанием остатков α-аминоизомасляной кислоты (Aib), в основном, с N-концевой ацетильной группой и с C-концевой модификацией в виде аминоспиртовой группы. Для них также характерно наличие дополнительных небелковых аминокислот, в частности, изовалина и 2-этилаланина. Пептаиболы классифицируются в соответствии с длиной их аминокислотной цепи: 1) пептаиболы с длинной последовательностью (18–21 аминокислотных остатков обычно с центральным расположением Pro и остатками Gln около обоих концов); 2) пептаиболы с короткой последовательностью (11–16 аминокислотных остатков, с несколькими Aib-Pro и обычно либо Ac-Aib-Asn-, либо Ac-Aib-Gln- в качестве N‑конца); 3) ультракороткие липопептаиболы (7–11 аминокислотных остатков, с высоким содержанием Gly и N-концевых аминокислотных остатков, ацилированных жирной кислотой C8–C15) [2, 4, 16]. Содержание Aib составляет примерно 40% в длинных пептаиболах и от 14 до 56% в коротких. Основа молекулы пептаибола образует спиральную структуру из-за конформационных ограничений, обусловленных многочисленными Aib.

Существует большое структурное разнообразие пептаиболов. Многие описанные соединения этой группы представляют собой гомологи, отличающиеся локальными аминокислотными заменами, например, такие как атровиридины, неоатровиридины, лонгибрахины и эмерициллипсины (рис. 1). Внутри группы у гомологов может быть разный уровень цитотоксичности и специфичности, а также разные количественные уровни и спектры антимикробной активности (от 40 до 99% сходства, в зависимости от тест-культур) [25–28].

Рис. 1.

Структура некоторых пептаиболов: А – альбупептин В [7]; Б – альбупептин D [7]; В – атровиридины A – C [7]; Г – неоатровиридины A – D [7]; Д – конингинин А; Е – конингинин Б [7]; Ж – конингинин Д [7]; З – конингинин Ф [7]; И – эмерициллипсин А [17]; К – Glu (OMe) 18-аламетицин V [7]; Л – трихобревин BIII-D [7].

Длинноцепочечные пептаиболы (до 21 аминокислотного остатка), такие как лонгибрахины, могут образовывать потенциал-зависимые ионные каналы в липидных мембранах грибных фитопатогенов, влияя на их проницаемость и приводя клетки к гибели [29, 30]. Ряд исследователей показали, что пептаиболы с короткими последовательностями также образуют потенциал-зависимые ионные каналы в липидных мембранах и взаимодействуют со специфическими молекулярными мишенями прямо или косвенно внутри клетки, моделируя различные сигнальные пути. Однако большинство исследований короткоцепочечных пептаиболов и ультракоротких липопептаиболов сосредоточено на изучении особенностей структур и гораздо меньше известно о механизме их действия внутри клетки [2, 8, 16, 29].

Синтез пептаиболов у грибов осуществляется большими многомодульными белковыми комплексами, известными как нерибосомные пептидные синтетазы (NRPS). Каждый модуль катализирует включение одной белковой или небелковой аминокислоты. Предполагается, что одна синтетаза способна продуцировать множество изоформ одного и того же пептаибола [2, 30].

Современные методы изучения механизма действия пептаиболов включают равновесный диализ, дифференциальную сканирующую калориметрию, мембранную фильтрацию, хроматографию и флуоресценцию [30], которые обычно необходимы для модификации пептида или липида. Твердотельная спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ss-ЯМР) и круговой дихроизм (CD) также были апробированы, но пока не дают очевидного представления, почему некоторые пептаиболы активны, а некоторые нет [31–35]. Ориентация и расположение пептаиболов на поверхности или в двойном слое клеточных мембран, а также взаимодействие между пептидом и липидной мембраной имеют решающее значение для понимания механизма их действия и антимикробной активности. Было показано, что аламетицин (Alm), взаимодействующий с мембраной посредством механизма бочкообразного стержня (“barrel-stave”), при котором отдельные пептиды собираются в пучки, проникающие через бислой, индуцирует реакции растения, определяющие его устойчивость к патогену [29, 33]. При более высокой концентрации Alm может проникать в апикальную меристему и клетки эпидермиса верхушек корней, но не в клетки базальной меристемы, клетки коры или корневой покров Arabidopsis thaliana. Однако если корень был предварительно обработан целлюлазой, проницаемости не наблюдалось, что доказывает индуцированную целлюлозой устойчивость и клеточно-специфическую проницаемость Alm для корней A. thaliana [32].

Пьета Е. с соавт. [33] описали порообразование Alm в монослое липидов 1,2-димиристоил-n-глицеро-3-фосфохолин/фосфоглицерин (DMPC/PG) с использованием электрохимической сканирующей туннельной микроскопии (EC-STM). Липиды PG составляют мембранную архитектуру грамположительных бактерий, а отрицательно заряженные головки PG обеспечивают электростатический поверхностный потенциал, способствующий внедрению амфипатического Alm в мембрану [16]. Также было показано, что другой пептаибол, трихоконин VI, вызывает изменение проницаемости мембран грибов и дезинтеграцию субклеточных структур, влияет на проницаемость митохондриальной мембраны и продукцию внутриклеточных АФК, индуцирует экспонирование фосфатидилсерина и, в конечном итоге, запускает метакаспазно-независимый апоптоз в Fusarium oxysporum [34, 35]. Лизио с соавт. [36] показала на пептидомиметических фолдамерах, что пространственная структура пептаибола является ключевой особенностью для проникновения в мембрану, и, предположительно, именно поэтому пептаиболы с низким содержанием Aib практически не могут нарушать ее целостность.

Полусинтетические аналоги на основе пептаибола трихогина, выделенного из Trichoderma sp., были разработаны и синтезированы для повышения их растворимости в воде и повышения антифунгальной активности в отношении экономически важного грибного патогена растений Botrytis cinerea. Эти молекулы имели одиночные аминокислотные замены, преимущественно Gly/ Lys, расположенные внутри спиральной структуры [10]. Было показано, что подобная модификация увеличивала амфифильность пептидов и не приводила к критическим изменениям трехмерной ориентации. Что касается функциональных аспектов, большинство синтезируемых аналогов пептаиболов показали увеличение эффекта ингибирования в отношении B. cinerea [19, 20].

ПЕПТАИБОЛЫ С АНТИФУНГАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Многие авторы указывают на антифунгальную активность пептаиболов, но в большинстве случаев эта активность проявляется в отношении грибов – фитопатогенов растений, которая в настоящее время активно изучается для внедрения этих соединений в качестве биофунгицидов [28–32, 34, 35, 37, 38]. Гораздо меньше исследований проведено в направлении изучения активности пептаиболов по отношению к клиническим изолятам патогенных микроскопических грибов [16, 39]. Такие недавно описанные соединения, а также спектр их антифунгальной активности представлены в табл. 1.

Атровиридины A – C и неоатровиридины A – D представляют собой 20- и 18-мерные пептаиболы Trichodermа atroviride, обладающие антимикробной активностью не только в отношении фитопатогенных грибов, но и в отношении Candida albicans. Гептаибин подавляет рост Aspergillus fumigatus, C. albicans и C. neoformans. Лонгибрахины A-II-b проявляли ингибирующую активность в отношении условно-патогенного A. fumigatus [11]. Гипориенталин А, аналог пептаибола лонгибрахина-А-II, проявлял выраженную активность по отношению к клиническим изолятам C. albicans с минимальными ингибирующими концентрациями (МИК) от 2.49 до 19.66 мкМ, что сравнимо с таковой у антифунгального препарата амфотерицина В. Это указывает, что гипориенталин А подходит для лечения кандидоза [25, 40]. Септоцилиндрины А и В структурно родственны хорошо изученному пептаиболу аламетицину. Эти соединения проявляют умеренную активность в отношении C. albicans [41, 42]. Трихофумины A – D различаются своей способностью влиять на морфогенез Phoma destructiva [43]. Трибакопин AV, полученный из T. lixii, эндофита из Bacopa monnieri, является новым пептаиболом с уникальной последовательностью (Ac-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Pro-Leu-Aib-Val-Gln-OH). Было обнаружено, что этот пептаибол обладает активностью в отношении C. albicans при МИК 25 мкг/мл [34]. Четыре новых пептаибола с 11 аминокислотными остатками, альбупептины A – D, были выделены из мицелиальной культуры Gliocladium album KSH 719. Альбупептины B и D относятся к редкому классу пептаиболов, которые содержат оба стереоизомера изовалина (Iva) – D- и L-конфигурации. Альбупептины проявили умеренную активность в отношении B. cinerea и условно-патогенных Aspergillus sp. Примечательно, что эффект ингибирования роста B. cinerea увеличивался с увеличением количества присутствующих остатков Iva (IC50: один остаток Iva = 49.6 мкг/мл; два остатка Iva = 38.9 мкг/мл; три остатка Iva = 35.2 мкг/мл; четыре остатка Iva = 24.5 мкг/мл). Альбупептин A также не обладал значительной активностью в отношении Phytophthora infestans (IC50, 100 мкг/мл), а соединения B – D проявили только незначительную активность (IC50: два остатка Iva = = 97.6 мкг/мл; три остатка Iva = 84.7 мкг/мл; четыре остатка Iva = 84.3 мкг/мл) [18].

Недавно Марик с соавт. [1, 10] идентифицировали две новые группы пептаиболов из грибов рода Trichoderma. Конингиопсины были получены из T. koningiopsis. Они структурно близки к триконингину KAV, который характеризуется наличием колеблющихся правых и левых спиральных конформаций. Ингибирующей активности экстрактов пептаибола на клинических дрожжах не было выявлено, тогда как условно-патогенные мицелиальные грибы проявляли значительную чувствительность [10]. Пептаиболы с последовательностью из 19 аминокислотных остатков – бревицелсины, продуцируемые тремя видами (T. flagellatum SzMC 22608, T. sinensis SzMC 22609 и T. parareesei SzMC 22615), проявляли ингибирующее действие на условно-патогенные мицелиальные грибы [1].

Минимальные ингибирующие концентрации для сферостильбеллинов A и B были установлены в размере 2.0 M для каждого из них в отношении C. neoformans, 1.0 M для A. fumigatus и 4.0 и 2.0 M, соответственно, для C. albicans. Хотелось бы отметить, что при этих концентрациях клетки макрофагов мыши оставались неизмененными [44]. Наконец, последняя группа пептаиболов включает в себя эмерициллипсины A – E из алкалофильного гриба Emericellopsis alkalina, продемонстрировавших многообещающую антифунгальную активность в отношении клинических изолятов Aspergillus terreus 1133m, A. fumigatus 163m, A. ochraceus 497m, Saccharomyces cerevisiae 77m и Cryptococcus laurentii с множественной лекарственной устойчивостью к флуконазолу и амфотерицину В [17, 39, 45, 46].

ПЕПТАИБОЛЫ С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ И ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЯМИ

Некоторые пептаиболы также рассматриваются и в качестве основы для разработки противоопухолевых препаратов (табл. 1). Действительно, они проявляют избирательную цитотоксичность в отношении раковых клеток, которые отличаются физическими свойствам мембраны по сравнению со здоровыми клетками [46, 49]. Исследование пептидного комплекса из штамма Trichoderma arundinaceum MSX70741 привело к выделению трех новых пептаиболов с противоопухолевой активностью [50]. Цитотоксическая активность новых соединений оценивалась на линиях раковых клеток человека: HCT 116 и DLD-1 (рак толстого кишечника), HT-29 (раковые клетки эпителия кишечника), SW948 (карцинома толстого кишечника), Hep-G2 и Huh-7 (гепатоцеллюлярные карциномы), HeLa (аденокарцинома). Трихобревин BIII-D проявлял умеренную активность против клеток HCT 116 и HT-29 со значениями IC50 6.8 и 6.7 мМ, соответственно, и не проявлял активности в отношении клеточных линий гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) и аденокарциномы [51]. Glu (OMe) 18-аламетицин F50 был наиболее активным соединением со значениями IC50 от 2.5 до 6.5 мМ, у него отсутствовала селективность в отношении различных клеточных линий. Для 11 пептаиболов, о которых сообщалось ранее, выявлено, что их биоактивность коррелирует с гидрофобностью [52]. Айерс с соавт. [3] исследовали активность нескольких пептаиболов, полученных из экстрактов грибов порядка Hypocreales. Они смогли показать, что аламетицин, атровиридин, трихоконин и лонгибрахин проявляют не только цитотоксичность, но и избирательность в отношении раковых клеток. Ши с соавт. [26] обнаружили, что клетки ГЦК более чувствительны к трихоконину VI из Trichoderma pseudokoningii, чем нормальные клетки печени. Трихоконин VI вызывал апоптозную и аутофагическую гибель клеток ГЦК, что указывает на потенциал пептаиболов в качестве новых противораковых агентов. Липопептаибол эмерициллипсин А проявил избирательную цитотоксическую активность в отношении двух клеточных линий: HepG2 и Hela (EC50 2.8 и 0.5 мкМ соответственно). Эмерициллипсин А проявлял меньшую цитотоксическую активность, чем доксорубицин (EC50 14 и 0.34 мкМ соответственно), следовательно, он менее токсичен для нормальных клеток, чем последний (~40 раз), но оказывает более сильное цитотоксическое действие на линии опухолевых клеток [20, 49]. Пептаибол гипориенталин А синтезируется штаммом T. orientale, выделенным из средиземноморской морской губки Cymbaxinella damicornis. Цитотоксичность гипориенталина А оценивали на клеточной линии Vero. Было обнаружено, что при концентрации 33.84 мкМ он подавлял жизнеспособность клеток более чем на 90% [6]. Т. Марик с соавт. [1] исследовали частично очищенный экстракт пептаибола из T. reesei QM9414. Они показали, что он ингибирует сперматозоиды кабана и клетки PK-15 почек свиней при концентрации раствора пептаибола 8 мкг/мл, что вызвало опасения по поводу возможной токсичности in vivo. Дегенколб с соавт. предположили, что токсичность пептаиболов может быть ниже порога действия на человека [53].

Из библиотеки соединений Университета Оклахомы (Natural Products Discovery Group) были протестированы 52 пептаибола и липопептаибола на цитотоксическую активность в отношении гепатоцитов человека HepG2. Пять новых пептаиболов, аналогичных структуре трихорзина (Trichorzin NPDG A – E) и восемь новых пептаиболов, аналогичных структуре гарцианина (Harzianin NPDG A-H) из T. harzianum, подавляли рост клеток со значениями IC50 0.42 и 1.14 мкг/мл [54]. В рамках этого обширного исследования было собрано и охарактеризовано 30 новых пептаиболов и липопептаиболов, среди которых особенно стоит отметить гарцианин NPDG I. Было показано, что его показатель ЕС50 в отношении полирезистентных простейших Plasmodium falciparum линии Dd2 – 0.10 мкМ. Отмечено также отсутствие общей токсичности в отношении HepG2 при самых высоких испытанных концентрациях (HepG2 EC50 > 25 мкМ, индекс селективности >250) [54]. Велутибол А, новый пептаибол, содержащий 14 остатков аминокислот, был выделен из психрофильного гриба T. velutinum, обнаруженного в Гималаях. Была установлена его цитотоксическая активность в отношении линий раковых клеток. Анализ клеточного цикла был проведен на клетках миелоидного лейкоза человека (HL-60) и выявил образование апоптозных телец в клетках и повреждение их ДНК в зависимости от дозы [55]. Новый пептаибол RK-026A, полученный из Trichoderma sp. показал значения цитотоксичности IC50 от 0.7 до 4.1 мкг/мл (1.5–8.1 мкг/мл) в отношении клеток K562, при этом отмечалась немедленная гибель раковых клеток [56]. Уникальное разнообразие синтезируемых химических соединений грибов расширяет наши представления о возможностях применения пептаиболов.

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ФАРМАКОЛОГИИ

Открытие новых пептаиболов среди продуцентов микроскопических грибов из морских глубин, из грибов, обитающих в холодных и засоленных почвах, а также из других уникальных экстремальных местообитаний расширяет возможности поиска новых пептидных антибиотиков из природных источников. В этот обзор мы включили информацию о некоторых недавно описанных пептидах, выделенных из экстремофильных грибов. Наличие Aib, придающего устойчивость к протеазам патогена, делает эти эксклюзивные пептидные антибиотики предпочтительными для фармакологических исследований. Несомненно, они будут играть важную роль в дальнейших разработках лекарственных соединений.

Лечение лейшманиоза с использованием пептаиболов – антиамоебина и сузукациллина А показало новые возможности для использования синергетических подходов к лечению с минимальным риском [56]. Новые антимикробные липопептаиболы эмерициллипсины могут стать альтернативой антифунгальным препаратам для терапии инвазивного микоза при аспергиллезе и криптококкозе с множественной лекарственной устойчивостью. Активность эмерициллипсина А в отношении резистентных патогенных клинических изолятов грибов была на уровне амфотерицина В. Кроме того, он показал низкую цитотоксическую активность по отношению к нормальной линии HPF, но обладал селективностью к раковым клеткам, в частности, по отношению к клеточным линиям K-562 и НСТ-116. При этом он не проявлял гемолитической активности по отношению к эритроцитам человека [39, 46].

Хорошо известно, что основным молекулярным механизмом действия пептаиболов является мембранно-активный механизм, а линейная полипептидная цепь образует пространственную спиральную структуру. Можно предположить, что все пептаиболы с антифунгальной активностью также обладают цитотоксической активностью в отношении раковых клеток, что, однако, требует экспериментального подтверждения [42, 57, 58]. Доступность сложных биохимических методов и активное использование биоинформатики для открытия новых молекул и расшифровки их структуры, моделирование синтетических пептидов, использование синергетических эффектов двух или более пептаиболов для успешного лечения заболеваний открывают новые возможности для дальнейших исследований этой группы соединений.

Работа поддержана грантом РФФИ № 20-04-00992.