1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 57, № 5, 2021

Прикладная биохимия и микробиология, 2021, T. 57, № 5, стр. 504-518

Новые ассоциации аэробных бактерий, активно разлагающие линдан

Э. А. Назарова 1, Д. О. Егорова 1, *, Л. Н. Ананьина 1, Е. С. Корсакова 1, Е. Г. Плотникова 1

1 Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал Пермского федерального исследовательского центра Уральского отделения Российской академии наук
614081 Пермь, Россия

* E-mail: daryao@rambler.ru

Поступила в редакцию 25.03.2021
После доработки 14.04.2021
Принята к публикации 23.04.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

В результате селекции получены ассоциации аэробных бактерий, способные осуществлять разложение хлорорганического пестицида – линдана, в концентрации 0.1 г/л в минеральной среде за 30–180 сут. Установлено, что деградирующие линдан ассоциации L2-6, L3-6, L4-6, L6-6 и L4-10 характеризовались низким уровнем видового разнообразия (индекс Шеннона в пределах 1.88–2.46). В составе ассоциаций выявлены представители классов γ-Proteobacteria (рода Pseudomonas) и α-Proteobacteria (родов Novosphingobium, Sphingoauranticus, Sphingomonas, Tardibacter). Показано, что в тотальных ДНК, выделенных из бактериальных ассоциаций шестого пассажа (L2-6, L3-6, L4-6 и L6-6), присутствовали гены, обладающие 98–100% уровнем сходства с linABCX-генами, кодирующими ферменты “верхнего” пути аэробной трансформации линдана. Бактериальная ассоциация L4-10 эффективно разлагала линдан в минеральной среде (100%-ная деструкция 0.1 и 0.3 г/л линдана за 30 и 90 сут соответственно) и в модельных почвенных системах (78.1–90%-ная деструкция 0.5 г/кг линдана за 45 сут). Применение молекулярно-генетических и аналитических методов позволило предположить, что ассоциация L4-10 осуществляла разложение не только линдана, но и образующихся в процессе его метаболизма побочных хлорорганических соединений (1,3,4-трихлорбензол, 2,5-дихлорфенол). Таким образом, полученные в настоящем исследовании бактериальные ассоциации представляют интерес для разработки технологий биоремедиации территорий, загрязненных линданом.

Ключевые слова: бактериальные ассоциации, линдан, деструкция, lin-гены

Хлорорганические пестициды широко использовались в сельском хозяйстве по всему миру на протяжении нескольких десятилетий. Для удовлетворения потребностей сельхозпроизводителей хлорорганические пестициды (ХОП), такие как гексахлоран, альдрин, дихлордифенилтрихлорметилметан, линдан/гексахлорциклогексан (ГХЦГ) и некоторые другие, выпускались в промышленных масштабах. Однако к концу 20 века было установлено, что ХОП оказывают негативное воздействие на все компоненты природы, вследствие их высокой токсичности, устойчивости к физико-химическому и биологическому воздействию и способности аккумулироваться в пищевых цепях. В 2001 г. мировым сообществом принята Стокгольмская конвенция, согласно которой девять ХОП отнесены к группе стойких органических загрязнителей (СОЗ), запрещены к производству и применению, и подлежат уничтожению. В 2009 г. список СОЗ по хлорорганическим пестицидам был расширен, в него вошли все изомеры гексахлорциклогексана [1].

Линдан – γ-изомер гексахлорциклогексана (ГХЦГ), применялся как пестицид широкого спектра действия. При его промышленном синтезе получали “технический ГХЦГ”, состоящий из α-ГХЦГ (55–80% в смеси), β-ГХЦГ (5–14% в смеси), γ-ГХЦГ (8–15% в смеси) и δ-ГХЦГ (2–16% в смеси) [2]. Для обработки сельскохозяйственных территорий по всему миру было использовано более 400 тыс. т изомеров ГХЦГ, в том числе – γ-ГХЦГ/линдан [1]. Особые физико-химические свойства изомеров ГХЦГ привели к широкому распространению данных соединений в природе. Однако наиболее загрязненными участками остаются места их производства, системного применения и захоронения. Одним из мест, на территории которого на ряду с другими соединениями группы СОЗ зафиксировано наличие ГХЦГ является г. Чапаевск (ОАО “СВЗХ”, Россия) [3–5].

Одним из наиболее перспективных методов разложения ГХЦГ является бактериальная деструкция. Выделены и описаны бактериальные сообщества и индивидуальные штаммы, осуществляющие трансформацию изомеров ГХЦГ, в том числе линдана [6–12]. Большинство известных штаммов-деструкторов линдана являются представителями родов Sphingobium и Sphingomonas. Необходимо отметить, что процесс биоразложения протекает медленно, что обусловлено низкой водорастворимостью, высокой сорбционной активностью, липофильностью и токсичностью γ-ГХЦГ для живых организмов. У всех исследованных аэробных бактерий биохимический путь разложения линдана начинается с реакции гидродехлорирования и условно разделен на “верхний” и “нижний” (рис. 1). “Верхний” путь включает в себя трансформацию линдана до образования 2,5-дихлоргидрохинона под действием ферментов, кодируемых генами linABCX, “нижний” путь – разложение 2,5-дихлоргидрохинона до сукцинил-КоА и ацетил-КоА под действием ферментов, кодируемых генами linDEFGHJ [7, 9, 10, 13]. Катаболические гены деградации ГХЦГ практически идентичны у представителей различных родов бактерий, включая грамположительные группы. Рядом исследователей выдвинуто предположение о возможности горизонтального переноса lin-генов у бактерий [9, 14]. Несмотря на высокое сходство генов и ферментов деструкции линдана, скорость и эффективность трансформации данного соединения у известных штаммов существенно варьирует. Период деструкции, за который осуществляется разложение более 50% линдана от начальной концентрации (20–100 мг/л), составляет от 5 до 66 сут [15–26].

Рис. 1.

Аэробный путь бактериального разложения линдана (γ-ГХЦГ) [7, 9, 10. 13]: 1 – γ-ГХЦГ/линдан, 2 – γ-пентахлорциклогексен, 3 – 1,3,4,6-тетрахлоро-1,4-циклогексадиен, 4 – 2,4,5-трихлоро-2,5-циклогексадиен-1-ол, 5 – 2,5-дихлоро-2,5-циклодиен-1,4-диол, 6 – 2,5-дихлоргидрохинон, 7 – сукцинил-КоА, 8 – ацетил-КоА, 9 – 1,2,4-трихлорбензол, 10 – 2,5-дихлорфенол. Жирным шрифтом показаны соединения и гены, детектированные в настоящем исследовании.

Известно, что длительное присутствие загрязнителя в почве приводит к изменениям в составе и численности микробиоценоза. Доминирующую позицию занимают бактериальные штаммы, устойчивые к токсическому действию загрязнителя и способные использовать данное соединение как источник углерода и энергии [8, 12, 21, 27]. В связи с этим представляет интерес изучение микробных ассоциаций почв с территорий, длительное время загрязненных линданом и другими изомерами ГХЦГ. В настоящем исследовании почвы были отобраны с территории ОАО “СВЗХ” г. Чапаевска (Россия). На предприятии более 50 лет производили техническую смесь ГХЦГ [5].

Цель работы – получение и изучение структуры новых аэробных бактериальных ассоциаций, осуществляющих разложение линдана, анализ ключевых генов деструкции линдана, представленных в данных ассоциациях, оценка биоремедиационного потенциала наиболее активной ассоциации в модельных почвенных условиях.

МЕТОДИКА

Образцы почв были отобраны на шести участках на территории ОАО “Средне-Волжский завод химикатов” (г. Чапаевск, Россия). Отбор осуществляли согласно ГОСТ 17.4.3.01–82 [28]. Для накопительного культивирования использовали усредненную пробу почвы.

Среды культивирования. Состав сред, используемых в для выращивания бактериальных ассосиаций. Минеральная среда Раймонда (г/л): Na2CO3 – 0.1; MgSО4 ⋅ 7 H2О – 0.2; FeSО4 ⋅ 7 H2O – 0.02; MnSО4 ⋅ 7 H2O – 0.02; K2HPO4 ⋅ 3 H2O – 1.0; NaH2PO4 ⋅ 3 H2O – 1.5; NaCl – 0.8. рН 7.4 [29]. Минеральная среда К1 (г/л): K2HPO4 ⋅ 3H2O – 4.17; NaH2PO4 ⋅ 2H2O – 0.4; (NH4)2SO4 – 0.5; Ca(NO3)2 ⋅ 4H2O – 0.01; MgSO4 ⋅ 7H2O – 0.15; FeSO4 – 0.018; MnSO4 ⋅ 5 H2O – 0.032; рН 7.3 [30]. Среда Луриа–Бертани (г/л): триптон – 10; дрожжевой экстракт – 5; NaCl – 10; агар – 15 [31].

Схема селекции ассоциаций, разлагающих линдан. Селекцию осуществляли методом накопительного культивирования с последовательными пересевами (пассажами). 1 пассаж: образец почвы (1 г) помещали в колбу Эрленмейера объемом 250 мл, содержащую 50 мл минеральной среды Раймонда с 0.8 г/л NaCl [29] и 0.3 г/л линдана. Культивирование осуществляли на термостатируемой качалке Environmental Shaker-Incubator ES-20/60 (“BioSan”, Латвия) при 120 об./мин и 28°С в течение 30 сут. Последующие пассажи (2–16): содержимое колбы предыдущего пассажа отделяли от минеральной среды центрифугированием (центрифуга 3К30 “Sartorius”, Германия, 10 мин, 10 174 g). Осадок ресуспендировали в 50 мл среды Раймонда и переносили в колбу Эрленмейера объемом 250 мл содержащую 0.3 г/л линдана. Культивирование проводили как для 1 пассажа.

Выделение бактериальных ассоциаций. 10 мл бактериальной суспензии, полученной при накопительном культивировании на этапе 3, 6, 8, 10 и 16 пассажей, отделяли от почвенных частиц фильтрованием через бумажный фильтр (красная лента, “Sartorius”, Германия). Полученную бактериальную суспензию помещали в колбу Эрленмейера объемом 250 мл, содержащую 100 мл минеральной среды К1 [30] и 0.3 г/л линдана, культивировали на термостатируемой качалке Environmental Shaker-Incubator ES-20/60 (“BioSan”, Латвия) со скоростью 120 об./мин и 28°С с последовательными пересевами на среду К1 с линданом в концентрации 0.3 г/л через каждые 7 дней. Бактериальное сообщество считали стабильным, если при 5 последовательных пересевах морфологический состав и соотношение колоний (одинаковых морфотипов) не изменялись. Контроль морфологии колоний осуществляли при высеве бактериальных ассоциаций на агаризованную среду Луриа-Бертани (LB) [31] с применением классического метода серийных разведений. При этом также проводили подсчет количества колониеобразующих единиц.

Выделение тотальной ДНК. Тотальную ДНК бактериальных ассоциаций выделяли общепринятым методом [32 ] . 2 мл бактериальной культуры осаждали на центрифуге miniSpin (“Eppendorf”, Германия) при 11 200 g 10 мин. Осадок ресуспендировали в 80 мкл 0.05М NaOН. Лизис проводили путем последовательной четырехкратной экспозиции с чередованием 15 мин при температуре 95°С и 15 мин при –20°С.

Анализ методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ). Для амплификации фрагмента гена 16S рРНК, составляющего 566 п.н. по нумерации E. coli, применяли праймеры: 27F, включающий 40 п.н. GC-хвост на 5'-конце, и 518R (табл. 1) [33]. Амплификацию проводили в 50 мкл смеси, содержащей 0.25 мM дНТФ, 0.3 мкM праймера (каждого), 1.5 мМ MgCl2, 1× Green буфер для Dream Taq-полимеразы (“Thermo Fisher Scientific”, США), 2 ед. акт. Dream Taq-полимеразы (“Thermo Fisher Scientific”, США) и 2 мкл ДНК-матрицы в термоциклере My Cycler (“Bio-Rad”, США). Далее проводили электрофорез в 1.5%-ном агарозном геле в 0.5× ТВЕ-буфере при напряжении электрического поля 5.0 V/см в течение 40 мин для подтверждения присутствия продуктов специфической амплификации. ДНК была визуализирована после окрашивания бромистым этидием (0.5 мгк/мл) в проходящем УФ-свете и документирована системой Gel Doc XR (“Bio-Rad”, США).

Таблица 1.  

Кинетические параметры деструкции линдана (0.1 г/л) ассоциациями

Накопительная культура/Ассоциация* 90–100%-ная деструкция линдана, сут Зависимость концентрации линдана от времени деструкции** R2*** μ, мг/(л × сут)
L2/L2-3 150 y = –0.6818x + 104.05 0.994 0.6 ± 0.2
L2/L2-6 90 y = –1.1762x + 103.93 0.982 1.1 ± 0.1
L2/L2-8 120 y = –0.8089x + 95.644 0.996 0.8 ± 0.2
L3/L3-3 180 y = –0.567x + 108.26 0.979 0.5 ± 0.1
L3/L3-6 180 y = –0.6238x + 107.53 0.985 0.6 ± 0.1
L4/L4-3 150 y = –0.6376x + 96.273 0.988 0.6 ± 0.1
L4/L4-6 90 y = –1.1738x + 94.964 0.966 1.2 ± 0.2
L4/L4-8 45 y = –2.2333x + 98.5 0.998 2.3 ± 0.3
L4/L4-10 30 y = –3.333x + 97.0 0.989 3.3 ± 0.1
L4/L4-10**** 90 y = –3.3333x + 281.43 0.974 3.2 ± 0.1
L4/L4-16 50 y = –1.667x + 97.0 0.989 1.7 ± 0.2
L6/L6-3 180 y = –0.5553x + 98.516 0.991 0.6 ± 0.1
L6/L6-6 180 y = –0.5641x + 102.69 0.993 0.5 ± 0.1

* Вторая цифра в обозначении ассоциации соответствует пассажу в селекции; ** y – концентрация линдана, х – время деструкции; *** коэффициент достоверности аппроксимации; **** концентрация линдана 0.3 г/л.

Для образцов, в которых был получен искомый фрагмент гена 16S рРНК, проводили денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ) в 6%-ном (вес./об.) полиакриламидном геле с линейным денатурирующим химическим градиентом от 30 до 60%, где 100% составляла 7 М мочевина и 40% формамид. Разделение проводили в течение 16 ч при 45 V и 60°С на приборе DcodeTM Universal Mutation System (“Bio-Rad”, США). Гели окрашивали 15 мин в растворе бромистого этидия (0.5 мкг/мл), далее промывали в деионизированной воде в течение 10 мин, визуализировали в проходящем УФ-свете и документировали системой Gel Doc XR (“Bio-Rad”, США).

Анализ ДГГЭ-профилей осуществляли путем детекции полос в геле, используя алгоритм поиска полос пакета программ Quantity One версия 4.6 (“Bio-Rad”, США). Для расчета степеней сходства ДГГЭ-профилей использовали коэффициент Дайса, построение дендрограммы осуществляли с помощью метода UPGMA из пакета программ Quantity One версия 4.6 (“Bio-Rad”, США). Полученные ДГГЭ-профили были проанализированы с помощью индекса Шеннона-Уивера. При этом предполагалось, что одна полоса в геле (операциональная таксономическая единица, ОТЕ) соответствует одному виду, а интенсивность свечения отражает ее численность. При операциях учитывали положение полосы в геле. В анализ включали полосы, имеющие выше 0.2% от суммарной интенсивности полос дорожки.

Для подготовки к секвенированию фрагменты ДНК были элюированы из геля и использованы в качестве матрицы для амплификации с праймерами 27F и 518R. Описание условий секвенирования и анализа нуклеотидных последовательностей приведены ниже.

Анализ методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Для характеристики бактериальной ассоциации L4-10 был использован метод ПЦР-РВ. При амплификации бактериальных генов 16S рРНК с матрицы тотальной ДНК были использованы праймеры Eub338 и Eub518 [34]. ПЦР-РВ проводили в присутствии красителя Sybr Green I в наборе реактивов 2X Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (“Thermo Scientific”, США) на приборе “CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection Systems” (“Bio-Rad Laboratories”, США), согласно методике [35]. Для стандартной калибровочной кривой были использованы образцы очищенной геномной ДНК штаммов Rhodococcus sp. КТ112-7 и КТ723 из коллекции Лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии “ИЭГМ УрО РАН”.

Амплификация функциональных генов деструкции линдана. Функциональные гены деструкции γ-ГХЦГ (linA, linВ, linC, linX) определяли в тотальной ДНК бактериальных ассоциаций с использованием праймеров [36, 37]. Для подбора последовательностей олигонуклеотидов к консервативным участкам гена linA были использованы программы Primer3Plus (http://primer3plus.com/) и FastPCR (http://primerdigital.com/fastpcr.html). Амплификацию проводили в конечном объеме 12.5 мкл в десятикратном буфере с добавлением 0.75 мкл 1 М раствора MgCl2, бактериальных прямого и обратного праймеров по 0.5 мкл 1 М раствора, 1.25 мкл 2.5 мМ раствора нуклеотидов, 0.3 мкл Taq полимеразы (“Синтол”, Россия) и 1 мкл ДНК-матрицы. Температурный профиль амплификации: 95°C – 3 мин, следующие 30 циклов – 95°C – 30 с, 55°C – 1 мин, 72°C – 1 мин [38]. Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в агарозном геле (концентрация агарозы 0.8%) в 1× Трис-боратном буфере (“Thermo scientific”, Литва) при напряжении 10 V/см и визуализировали в проходящем УФ-свете с использованием системы GelDoc XRtm (“Bio-Rad Laboratories”, США) после окрашивания в растворе бромистого этидия.

Секвенирование и анализ lin-генов и фрагментов генов 16S рРНК. Определение нуклеотидных последовательностей генов осуществляли с помощью набора реактивов “DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit” на автоматическом секвенаторе “Genetic Analyser 3500XL” (“Applied Biosystems”, США) согласно рекомендациям производителя. Поиск гомологичных последовательностей производили по базам данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzTaxon (https:// www.ezbiocloud.net). Для визуализации сходства путем построения эволюционного дерева использовали алгоритм UPGMA (MEGA 10.0). Нуклеотидные последовательности фрагментов lin-генов и генов 16S рРНК, полученные в настоящем исследовании, депонированы в международной базе данных GenBank. Номера, присвоенные данным последовательностям, представлены в разделе ”Результаты и обсуждение”.

Деструкция линдана. Деструкцию линдана изучали при периодическом культивировании и в опытах с отмытыми клетками. Периодическое культивирование осуществляли в колбах Эрленмейера на 100 мл, содержащих 30 мл среды К1, 0.1 или 0.3 г/л линдана и бактериальную ассоциацию в конечной концентрации 1.51 ± 0.02 × 104 КОЕ/мл. Анализ содержания линдана в среде проводили каждые 15 сут. Линдан экстрагировали хлороформом из всего объема среды в колбе.

В опытах с отмытыми клетками бактериальную культуру с оптической плотностью ОП600 = 1.0 помещали во флаконы (5 мл) с тефлоновыми крышками и вносили ацетоновый раствор линдана до конечной концентрации 0.3 г/л. Анализ содержания метаболитов осуществляли на 4, 8, 18 и 30 сут культивирования. Культивирование в обоих случаях осуществляли на термостатируемой качалке Environmental Shaker-Incubator ES-20/60 (“BioSan”, Латвия) при 120 об./мин и 28°С. Эксперименты проводили в трехкратной повторности для каждого временного отрезка.

ГХ-МС-анализ линдана и 2,5-дихлорфенола. Хлороформный экстракт культуральной жидкости предварительно обезвоживали добавлением сульфата натрия и анализировали на газовом хроматографе (“Agilent 6890/5973N”, США) с масс-селективным детектором и кварцевой колонкой “RESTEK RTx-5MS” (“Restek”, США). В качестве газа-носителя использовали гелий, скорость потока 1 мл/мин. Объем впрыска 1.0 мкл. Режим анализа линдана: температура испарителя 260°С, программирование подъема температуры от 130°С, далее 3-минутная экспозиция с последующим нагревом до 280°С со скоростью 10°С/мин. Общее время анализа 18 мин. Режим анализа 2,5-дихлорфенола: температура испарителя 220°С, начальная температура колонки 60°С (2-минутная экспозиция) с последующим нагреванием при 20°С/мин до 300°С. Общее время анализа 14 мин. Анализ хроматограмм проводили c помощью программы MSD Productivity ChemStation (“Agilent”, США). Концентрацию анализируемых веществ рассчитывали по площадям пиков в сравнении с площадью пиков контрольного образца.

Анализ метаболитов деструкции линдана. Метаболиты линдана анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе “LC-20А Prominance” (“Shimadzu”, Япония) с УФ-детектором (при 205 нм) и колонкой С18 (“Supelco”, США) в системе ацетонитрил – 0.1%-ный Н3РО4 (70 : 30). Стандартами для сравнения являлись 1,2,4-трихлорбензол, 2,5-дихлорфенол, 2,5-дихлоргидрохинон, катехол (“Sigma-Aldrich”, США), растворенные в ацетонитриле, а также минеральная среда культивирования, содержащая культуру микроорганизма, но без субстрата. Наличие ионов хлора в среде определяли по помутнению среды после реакции ионов хлора с азотнокислым серебром, в культуральной жидкости, освобожденной от клеток [30].

Модельный эксперимент по биоаугментации ассоциации L4-10 в почву, искусственно загрязненную линданом. Для модельного эксперимента использовали дерново-подзолистую почву, отобранную на территории заказника “Предуралье” (Пермский край, Россия), не загрязненную химическими органическими соединениями. В эксперименте было заложено четыре линии, в каждой линдан вносили до конечной концентрации 0.5 г/кг сухой почвы: 1) нативная почва (Пмф); 2) нативная почва, аугментированная бактериальной ассоциацией L4-10 (конечная концентрация культуры 3 × 108 КОЕ/г почвы, Пмф + L4-10); 3) стерильная почва (трехкратная стерилизация автоклавированием по 40 мин при 121°С с интервалом 24 ч, Пст); 4) стерильная почва с внесенной бактериальной ассоциацией L4-10 (конечная концентрация культуры 3 × 108 КОЕ/г почвы, Пст + L4-10). Культивирование проводили в термостате ТС-1/80 (“СПУ”, Россия) при 28°С, увлажнение почвы поддерживали внесением минеральной среды К1 до 40% влагоемкости почвы. Продолжительность эксперимента составила 45 сут. Экстракцию проводили хлороформом трехкратно с объединением фракций. ГХ-МС-анализ экстрактов проводили как описано выше. Профиль микробного сообщества получали методом ДГГЭ (как описано выше), ДНК из почвы выделяли с помощью набора FastDNA Spin Kit For Soil (“MP Biomedicals”, США) через 21 и 45 сут культивирования.

Статистическая обработка данных. Все эксперименты проведены в трехкратной повторности. Анализ осуществляли с помощью программы STATISTICA 6.0. Для описания результатов исследования применяли стандартные методы параметрической статистики: рассчитывали среднее арифметическое (M), стандартное отклонение (SD). Сравнение двух групп проводили при помощи двустороннего критерия Стьюдента. Критический уровень значимости принимался в данном исследовании 0.05. Рассчитывали эффективность деструкции линдана (1), скорость деструкции (μ) (2), зависимости концентрации линдана от времени инкубации выражали в виде уравнение первого приближения с учетом коэффициента достоверности аппроксимации (R2).

(1)
${\text{Д}}\,\,(\% ) = 100--({{({{С}_{{\text{t}}}} \times 100)} \mathord{\left/ {\vphantom {{({{С}_{{\text{t}}}} \times 100)} {{{C}_{0}}}}} \right. \kern-0em} {{{C}_{0}}}}),$
где Д – эффективность деструкции (%); Сt – концентрация линдана через определенный промежуток времени; C0 – концентрация линдана в начальный момент времени;
(2)
$\mu = {{({{С}_{0}}--{{C}_{i}})} \mathord{\left/ {\vphantom {{({{С}_{0}}--{{C}_{i}})} {({{t}_{i}}_{{}}--{{t}_{0}})}}} \right. \kern-0em} {({{t}_{i}}_{{}}--{{t}_{0}})}},$
где C0 – концентрация линдана в начальный момент времени, мг/л, Сi – концентрация линдана в конечный момент времени, мг/л, ti – конечный момент времени, сут, t0 – начальный момент времени, сут.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Селекция аэробных бактериальных сообществ, разлагающих линдан. Для проведения селекции бактериальных сообществ были использованы шесть почвенных образцов, длительное время загрязненных смесью ГХЦГ и других соединений группы стойких органических загрязнителей. Из четырех образцов были получены накопительные культуры, содержащие в своем составе ассоциации аэробных бактерий, осуществляющих разложение линдана/γ-ГХЦГ (табл. 1). Бактериальные ассоциации, обозначенные L2-3, L3-3, L4-3 и L6-3, которые были выделены с третьего пассажа селекции, характеризовались низкой активностью биодеградации. Период разложения 0.1 г/л линдана составлял 5–6 мес. Скорость деструкции линдана у ассоциаций L3-6 и L6-6, несмотря на более длительный срок селекции (шестой пассаж), не изменилась. Напротив, анализ кинетических параметров деструкции линдана у ассоциаций L2-6 и L4-6 показал, что 90–100%-ное разложение субстрата достигалось в 1.7 раза быстрее (табл. 1). Дальнейшая селекция привела к повышению деградативного потенциала только в случае бактериального сообщества накопительной культуры L4. На этапе 8 пассажа селекции временные интервалы, необходимые для разложения линдана ассоциацией L4-8, сократились в 1.9 – 2.0 раза по сравнению с ассоциацией 6 пассажа селекции (табл. 1). Последующую селекцию проводили, используя накопительную культуру L4. Сравнение биодеградативной активности у ассоциаций 10 и 16 пассажей (L4-10 и L4-16) показало, что наиболее перспективная для дальнейшего изучения бактериальная ассоциация сформировалась на этапе 10 пассажа селекции (табл. 1). Следует отметить, что выделенные в настоящем исследовании бактериальные ассоциации, превосходят по кинетическим параметрам ассоциацию бактерий рода Streptomyces [20, 21, 23, 39] и близки по активности биодеградации со штаммами Bacillus sp. HP-9, HP-10 и НР-13 [18]. Штаммы-деструкторы Streptomices sp. M7 и Chromohalobacter sp. LD2 осуществляли 49–89%ую деструкцию 10–50 мг/л линдана за 4–7 сут, однако не описана их активность при более высоких концентрациях линдана [15, 16]. Полученные результаты позволяют предположить, что селекция в лабораторных условиях в присутствии высоких концентраций линдана, приводила к формированию бактериальных ассоциаций, обладающих высоким линдан-деградирующим потенциалом, на основе почвенных микробных сообществ.

Структура ассоциаций, деградирующих линдан. Для исследования состава полученных стабильных бактериальных ассоциаций 6 пассажа был проведен ДГГЭ-анализ тотальной ДНК (рис. 2). Установлено, что ассоциации L2-6, L3-6, L4-6 и L6-6 характеризовались уникальным составом с низким уровнем сходства друг с другом (рис. 2). Для анализа видового состава был использован индекс Шеннона-Уивера (табл. 2). Наибольшее значение выявлено в ассоциации L3-6, а наименьшее – в ассоциации L4-6. В целом, значения индекса Шеннона-Уивера у исследуемых ассоциаций находятся в диапазоне, характерном для сообществ с низким разнообразием видового состава. Полученные значения индекса Шеннона-Уивера в 1.5–2.0 раза ниже, чем данный показатель у бактериальных ассоциаций, выделенных из почв и донных отложений Китая и Тайваня, загрязненных пестицидами, в том числе линданом [40, 41]. Известно, что селекция с применением в качестве лимитирующего фактора одного химического соединения приводит к снижению биоразнообразия в бактериальных сообществах [42]. Вероятно, этим может быть обусловлено низкое видовое разнообразие в сформировавшихся при селекции на линдане бактериальных ассоциациях.

Рис. 2.

Дендрограмма, построенная методом UPGMA, на основании анализа сходства ДГГЭ-профилей исследуемых ассоциаций. В узлах кластеров приведены значения уровня сходства (%). Цифрами на геле обозначены фрагменты ДНК, для которых установлена нуклеотидная последовательность (табл. 3).

Таблица 2.  

Индексы биоразнообразия ассоциаций, полученных после селекции на линдане (6 пассаж), оцененные по ДГГЭ-профилям

Бактериальная ассоциация Индекс Шеннона–Уивера (H) Количество
операциональных
таксономических единиц (ОТЕ) 		Индекс
выравненность (ЕН)
L2-6 2.2645 13 0.882
L3-6 2.466 19 0.837
L4-6 1.885 11 0.786
L6-6 2.337 17 0.825

Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК, полученных при ДГГЭ-анализе ассоциаций L2-6, L3-6, L4-6 и L6-6 показал, что доминирующее положение занимают представители Proteobacteria (табл. 3). Полученный результат согласуется с результатами работы [27], показавшими, что в почвах, загрязненных ГХЦГ, ДДТ и Эндосульфаном, значительная доля микробного сообщества представлена бактериями филума Proteobacteria. В ассоциациях L2-6, L3-6, L4-6 и L6-6 выявлены представители рода Pseudomonas (класс γ-Proteobacteria) и рода Tardibacter (класс α-Proteobacteria) (табл. 3). Штамм Tardibacter chloracetimidivorans JJ-A5T, наибольшее сходство с которым выявлено у представителей исследуемых ассоциаций, был выделен из сельскохозяйственной почвы в Корее и использовал гербицид алахлор (хлорорганическое соединение) в качестве единственного источника углерода [43]. Как отмечалось ранее, одними из наиболее широко известных представителей бактерий-деструкторов линдана были штаммы родов Sphingobium и Sphingomonas [6–9]. В составе исследуемых ассоциаций, за исключением ассоциации L3-6, также присутствовали представители рода Sphingomonas (класс α-Proteobacteria) (табл. 3). Кроме того, в составе ассоциации L4-6 найдены представители рода Novosphingobium (класс α-Proteobacteria), а в составе ассоциации L6-6 – Sphingoauranticus (класс α-Proteobacteria) (табл. 4). Таким образом, ассоциации L2-6, L3-6, L4-6 и L6-6 характеризовались не только количественными различиями в своем составе, но и качественными.

Таблица 3.

Сравнение фрагментов гена 16S рРНК с гомологичными нуклеотидными последовательностями, представленными в базе EzTaxon (https://www.ezbiocloud.net)

Ассоциация Номер фрагмента ДНК (ДГГЭ), номер в GenBank Типовой штамм, номер в GenBank Сходство, % Количество нуклеотидов
L2-6 10, MW132971 Pseudomonas monteilli NBRC 103158T, (BBIS01000088) 100 402
12, MW132972 Pseudomonas alloputida Kh7T, (LT718459) 100 420
13, MW132973 Tardibacter chloracetimidivorans JJ-A5T, (CP018221) 93.2 458
14, MW132974 Sphingomonas polyaromaticivorans B2-7T, (EF467848) 95.97 398
L3-6 1, MW132965 Pseudomonas alkylphenolica KL28T, (CP009048) 100 419
  2, MW132966 Pseudomonas putida NBRC14164T, (AP013070) 99.77 450
3, MW132967 Pseudomonas sichuanensis WCHPs060039T, (QKVM01000121) 100 350
4, MW132968 Pseudomonas asplenii ATCC 23835T, (LT629777) 100 448
5, MW132969 Pseudomonas hutmensis xwS2T, (QJRG01000049) 99.78 432
9, MW132970 Tardibacter chloracetimidivorans JJ-A5T, (CP018221) 99.47 392
L4-6 15, MW132975 Tardibacter chloracetimidivorans JJ-A5T, (CP018221) 99.42 349
16, MW132986 Pseudomonas laurylsulfatiphila AP3-16T, (KY462012) 99.56 432
17, MW132987 Pseudomonas putida NBRC14164T, (AP013070) 99.54 465
18, MW132976 Novosphingobium bradum SIM-24T, (LN890294) 92.84 464
19, MW132977 Sphingomonas astaxanthinifaciens DSM22298T, (JONN01000001) 99.5 408
L6-6 21, MW132980 Pseudomonas laurentiana GLS-010T, (KY471137) 99.5 493
  24, MW132979 Pseudomonas putida NBRC14164T, (AP013070) 99.56 457
25, MW132980 Pseudomonas asplenii ATCC 23835T, (LT629777) 100 449
26, MW132981 Pseudomonas hutmensis xwS2T, (QJRG01000049) 100 453
27, MW132982 Pseudomonas panipatensis Esp-1T, (jgi.1118294) 100 484
28, MW132983 Sphingoauranticus capsulatus YLT33T, (KT321369) 98.5 411
29, MW132984 Tardibacter chloracetimidivorans JJ-A5T, (CP018221) 99.51 404
30, MW132985 Sphingomonas polyaromaticivorans B2-7T, (EF467848) 99.10 410
Таблица 4.  

Сравнение нуклеотидных последовательностей фрагментов генов деструкции линдана, амплифицированных с тотальной ДНК бактериальных ассоциаций, с гомологичными последовательностями из базы данных GenBank

Фрагмент гена ДНК-матрица ассоциации (размер анализируемого фрагмента, п.н), номер в GenBank Наиболее близкие гомологичные последовательности из GenBank, номер в GenBank Сходство, % Ссылка
linA*   L2-6 (382), MW150971 linA, Sphingobium indicum B90A, (CP013070.1) 99 [44]
L3-6 (397), MW150972 linA, Sphingobium japonicum UT26S, AP010803.1 98 [36]
L4-6 (389), MW150970 linA, Sphingomonas paucimobilis B90, AY150580.3 100 [45]
linA** L6-6 (215), MW150973 linA, uncultured organism, clone mgA6R1, EU863849.1 100 н.о.***
linB L6-6 (437), MW150974 linВ, Sphingobium sp. TKS, CP005087.1 100 [46]
linC L2-6 (384), MW150975 linC, Sphingobium sp. S8, MN649846.1 99 н.о.
L3-6 (448), MW150976 linC, Sphingobium sp. MI1205, CP005192.1 100 [47]
L4-6 (304), MW150977 linC, Sphingobium indicum B90A, CP013071.1 99 [44]
L6-6 (438), MW150978 linC, Sphingobium sp. TKS, CP005088.1 100 [46]
linX L2-6 (523), MW1509783 linX, Sphingobium sp. S6, MN649857.1 100 н.о.
L3-6 (621), MW150984 linX, Sphingomonas sp. MM-1, CP004038.1 98 [48]
L4-6 (665), MW150985 linX, Sphingobium sp. S8, MN649848.1 99 н.о.
L6-6 (667), MW150986 linX, Sphingobium sp. TKS, CP005088.1 100 [46]

* Праймеры, подобранные в настоящем исследовании; ** праймеры, представленные в [36], *** н.о. – не опубликовано, данные GenBank.

Гены деструкции линдана в ассоциациях, выделенных с 6 пассажа селекции. Для исследования генетических систем разложения линдана в исследуемых бактериальных ассоциациях были использованы олигонуклеотидные праймеры, специфичные к генам linABCX, кодирующим ферменты “верхнего” пути деструкции ГХЦГ (рис. 1). С матриц тотальных ДНК ассоциаций L2-6, L3-6, L4-6 и L6-6 были получены ПЦР-продукты ожидаемого размера (табл. 4). В результате анализа нуклеотидных последовательностей полученных фрагментов ДНК, было установлено, что в ассоциациях присутствуют гены lin-оперона, характеризующиеся высоким уровнем сходства с lin-генами штаммов-деструкторов линдана (табл. 4). Молекулярно-генетический анализ фрагмента гена, амплифицированного с ДНК ассоциаций L2-6, L3-6, L4-6 и L6-6 с праймерами, специфичными к гену linA, показал высокий процент сходства с генами, кодирующими дегидрохлориназу известных штаммов-деструкторов линдана родов Sphingobium и Sphingomonas, а также некультивируемой бактерии, выделенной из почв, загрязненых линданом (табл. 4). Секвенирование фрагментов ДНК, полученных с праймерами, специфичными к гену linB, позволило установить нуклеотидную последовательность только для фрагмента с ДНК ассоциации L6-6, которая имела 100%-ное сходство с аналогичным геном деструктора Sphingobium sp. TKS (табл. 4). Уровень сходства фрагментов генов, амплифицированных с применением праймеров, специфичных к генам linC и linX, составил 98–100% с генами дегидрогеназ штаммов рода Sphingobium, за исключением фрагмента гена ассоциации L3-6, для которого наиболее близким был ген linX штамма Sphingomonas sp. MM-1 (табл. 4).

Необходимо отметить, что, несмотря на то, что нуклеотидные последовательности функциональных генов определялись в тотальной ДНК сообщества, результаты секвенирования показали, что в образцах присутствуют однородные матрицы ДНК. Известно, что lin-гены “верхнего” пути штаммов-деструкторов линдана Sphingobium indicum B90A, Sphingobium francense Sp+ и Sphingobium japonicum UT26, а также 12 штаммов семейства Sphingomonadaceae, изолированных в Германии, имеют высокий уровень сходства. Так, для гена linA данный показатель составил 100%, для гена linB – 97 – 98%, для гена linC – 99%. Две копии гена linX (linX1 и linX3) штамма S. indicum B90A на 99% идентичны гену linX штамма S. japonicum UT26, тогда как ген linX2 штамма S. indicum B90A совпадает с геном linX только на 66% [10, 49]. При этом был установлен горизонтальный перенос lin-генов в микробном сообществе [10, 49].

Было показано, что в исследуемых ассоциациях присутствуют представители семейства Sphingomonadaceae (табл. 3). Полученные результаты позволили предположить, что в исследуемых ассоциациях присутствуют гены, обусловливающие разложение линдана по “верхнему” пути, характерные для бактерий семейства Sphingomonadaceae.

Характеристика биодеградативного потенциала ассоциации L4-10. В результате селекции из накопительной культуры L4 на 10 пассаже была получена бактериальная ассоциация L4-10, характеризующаяся более высокими кинетическими параметрами разложения линдана, чем у остальных ассоциаций, полученных в настоящем исследовании (табл. 1). Удельная скорость деструкции составила 3.3 ± 0.1 мг/(л × сут), что превышало скорость разложения линдана известными ассоциациями, в состав которых входили бактерии родов Streptomices и Paenibacillus, и водоросль рода Scenedesmus [22, 50], а также индивидуальными штаммами родов Bacillus, Sphingobium и Streptomices [18, 19, 26]. За 30 сут ассоциация L4-10 осуществляла разложение линдана на 99.8% и достигла численности 1.02 ± 0.03 × 106 КОЕ/мл. Методом ПЦР-РВ было обнаружено наличие бактериальных генов 16S рРНК в количестве 3.29 × 106 (±1.0 × 104) копий гена на 1 мл культуры, что согласовывалось с данными, полученными при подсчете культивируемых бактерий в составе ассоциации. Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии в ассоциации L4-10 некультивируемых форм бактерий. Увеличение численности на два порядка относительно начальной (1.51 ± 0.02 × 104 КОЕ/мл) позволило предположить, что бактериальная ассоциация не только разлагала линдан, но и использовала его в качестве ростового субстрата.

Следует отметить, что индекс сходства ДГГЭ-профилей (по генам 16S рРНК) ассоциаций L4-10 и L4-6 составил 98.2%, при этом значения индекса Шеннона незначительно различались (табл. 2, 5). Полученные результаты позволили предположить, что в процессе селекции состав основных групп бактерий не изменялся, и в составе ассоциации L4-10 присутствовали бактерии рода Pseudomonas (класс γ-Proteobacteria) и родов Novosphingobium, Tardibacter и Sphingomonas (класс α-Proteobacteria), однако изменялось их соотношение в сообществе.

Таблица 5.  

Индексы биоразнообразия исследованных образцов, оцененные по ДГГЭ-профилям

Модельная почвенная система* Индекс Шеннона–Уивера (H) Количество операциональных
таксономических единиц (ОТЕ) 		Индекс выравненность (ЕН)
L4-10 2.229 17 0.786
Пмф (0) 2.686 18 0.929
Пмф (45) 2.181 14 0.826
Пмф+ L4-10 (21) 1.878 7 0.965
Пмф+ L4-10 (45) 1.921 8 0.924
Пст (0) 1.449 5 0.901
Пст (45) 0 1 0
Пст+ L4-10 (21) 2.469 13 0.962
Пст+ L4-10 (45) 2.425 14 0.919

* L4-10 – исследуемая ассоциация, Пмф (0) и Пмф (45) – автохтонная микрофлора нестерильной почвы в начале (0 сут) и конце (45 сут) эксперимента, Пст (0) и Пст (45) – ДНК стерильной почвы в начале (0 сут) и конце (45 сут) эксперимента, Пмф + L4-10 (21) и Пмф + L4-10 (45) – почвенная микрофлора, аугментированная ассоциацией L4-10 на 21 и 45 сут эксперимента, Пст + L4-10 (21) и Пст + L4-10 (45) – стерильная почва, аугментированная ассоциацией L4-10 на 21 и 45 сут эксперимента.

В результате ВЭЖХ и ГХ-МС анализа культуральной жидкости показано, что при трансформации линдана ассоциацией L4-10 образуются побочные продукты, характерные для классического “верхнего” пути бактериальной деструкции, 1,2,4-трихлорбензол (1,2,4-ТХБ) и 2,5-дихлорфенол (2,5-ДХФ) (рис. 1, 3). Динамика изменения концентрации данных соединений в процессе разложения линдана свидетельствовала о возможной их трансформации бактериальными штаммами, входящими в ассоциацию L4-10. В литературе описаны штаммы и бактериальные сообщества почв и донных отложений, способные разлагать 1,2,4-ТХБ или 2,5-ДХФ, но для них не описана активность деградации линдана [51–53].

Рис. 3.

Динамика образования и трансформации побочных продуктов биодеструкции линдана в процессе его разложения бактериальной ассоциацией L4-10: 1 – 1,2,4-трихлорбензол, 2 – 2,5-дихлорфенол.

При культивировании ассоциации L4-10 в минеральной среде К1, содержащей 0.3 г/л линдана было установлено, что кинетические параметры деструкции соответствуют аналогичным показателям при культивировании данной ассоциации в минеральной среде с 0.1 г/л линдана (табл. 1). Период достижения 100% деструкции 0.3 г/л линдана увеличивался пропорционально содержанию субстрата и составил 90 сут. Таким образом, повышение концентрации линдана в среде культивирования не приводило к ингибированию деградативной активности исследуемой ассоциации.

Биоаугментация ассоциации L4-10 в почву, искусственно загрязненную линданом. Одним из перспективных направлений в биоремедиации загрязненных линданом территорий является реализация метода биоаугментации аэробных бактериальных сообществ, обладающих способностью к деструкции этого токсиканта. В рамках настоящего исследования были созданы модельные почвенные системы, позволяющие оценить перспективность применения бактериальной ассоциации L4-10 в качестве агента биоремедиации.

Установлено, что внесение бактериальной ассоциации приводило к существенному повышению эффективности разложения линдана в почве (табл. 6). Наиболее эффективно процесс биодеструкции протекал в стерильной почве, содержащей ассоциацию L4-10. Уровень деструкции достигал 90% за 45 сут. Присутствие почвенной микрофлоры оказывало негативное воздействие на деградацию линдана ассоциацией L4-10. К концу эксперимента в модельной системе биотрансформация линдана составила 78.1%. Следует отметить, что в модельных системах, не содержащих ассоциацию L4-10, разложение линдана не происходило (система со стерильной почвой), либо протекало медленно (система с нативной почвой) (табл. 6). В литературе описано, что биоаугментация различных линдан-загрязненных почв бактериальными ассоциациями обусловливает разложение линдана на 55–87%, а индивидуальным штаммом-деструктором Sphingobium sp. BHC-A на 67.7–96.3% [13, 20, 23, 54, 55]. Кинетические параметры деструкции в биоаугмениторованных почвах в 3–5 выше, чем в почвах без внесения бактериальных агентов [11, 23]. В настоящем исследовании установлено, что аналогичные параметры различаются на 2 порядка (табл. 6). Таким образом, внесение ассоциации L4-10 существенно повышало эффективность биоремедиации почвы, загрязненной линданом.

Таблица 6.  

Кинетические параметры деструкции линдана (0.5 г/кг) в почве

Модельная почвенная система Убыль линдана через 45 сут, % Удельная скорость деструкции,
мг/(кг × сут) 		Зависимость концентрации линдана от времени деструкции* R2**
Пст + L4-10 90.0 ± 0.2 10.1 ± 0.2 y = –9.9112x + 468.05 0.948
Пмф + L4-10 78.1 ± 0.1 8.67 ± 0.01 y = –8.6982x + 511.36 0.991
Пмф 0.60 ± 0.05 0.067 ± 0.002 y = –0.0671x + 500.14 0.977
Пст 0 0 н/о* н/о

* y – концентрация линдана, х – время деструкции; ** коэффициент достоверности аппроксимации; *** н/о – не определяется.

С использованием метода ПЦР-ДГГЭ были изучены изменения в составе бактериального сообщества в модельных почвенных системах (рис. 4, табл. 5). UPGMA-анализ показал, что образцы формируют два кластера: первый – бактериальные сообщества не загрязнённой почвы, второй – бактериальные сообщества модельных систем, содержащих линдан. Уровень сходства между данными кластерами составил 8%. Внутри второго кластера также можно выделить подразделение на две группы, сходство между которыми составляло 40%: 1) бактериальные сообщества, сформировавшиеся на основе нативного почвенного микробиоценоза и в результате взаимодействия данного микробиоценоза с внесенной ассоциацией L4-10 в процессе ремедиации, 2) бактериальная ассоциация L4-10 и ее адаптация в стерильной линдан-загрязненной почве. Наиболее сильные изменения в составе ассоциации L4-10 происходили в почве, содержащей микрофлору. Можно предположить, что в данном случае, помимо присутствия в почве более доступных питательных веществ, чем линдан, существенную роль играли конкурентные взаимодействия между биоаугментироваными и автохтонными микрорганизмами. Частичное вытеснение внесенных бактериальных штаммов в процессе биоремедиации загрязненных линданом почв было отмечено при биоаугментации штаммов Sphingobium francense Sp+ и Acinetobacter sp. (pRLG) в нестерильную почву [55].

Рис. 4.

Дендрограмма, построенная с применением метода UPGMA, отображающая сходство ДГГЭ-профилей модельных почвенных систем. В узлах кластеров приведены значения уровня сходства (%). Обозначения см. табл. 5.

Внесение линдана отрицательно сказывалось на разнообразии микробного сообщества почвы (табл. 5). К концу эксперимента отмечалось снижение значения индекса Шеннона на 0.5 единицы. Анализ динамики микробного разнообразия в биоаугментированных модельных системах выявил разнонаправленное изменение показателей. В случае применения стерильной почвы отмечалось незначительное повышение разнообразия (на 0.2 единицы), что обусловлено более равномерным распределением численности между бактериальными группами, присутствующими в ассоциации L4-10 (индекс выравненности >0.9). Увеличение микробного разнообразия было отмечено в ряде исследований по биоремедиации почв, загрязненных линданом, ДДТ, фенантреном и ПХБ [40, 42, 56]. Напротив, в случае биоаугментированных модельных систем, содержащих почвенную микрофлору, отмечено снижение индекса Шеннона на 0.7–0.8 единицы от показателей автохтонного почвенного микробного сообщества, и на 0.3–0.4 единицы от показателей ассоциации L4-10. В работе [41] также отмечена отрицательная динамика (снижение значения индекса Шеннона на 0.1–1.7 единицы, индексов ACE и Chao1 в 1.5–2.0 раза) в разнообразии микробного сообщества линдан-содержащей почвы в процессе биоремедиации. Следует подчеркнуть, что при биоаугментации индивидуальных штаммов-деструкторов, отмечено “плавающее” значение индекса Шеннона для микробного сообщества почв, загрязненных линданом, в течение 50 дней [55]. По-видимому, в биоаугментированных модельных почвенных системах протекают сложные процессы адаптации внесенных бактериальных ассоциаций.

Таким образом, в результате проведенных исследований, из почв, загрязненных хлорорганическими соединениями, после селекции с применением линдана получены ассоциации аэробных бактерий, обладающие различной способностью к биодеградации гербицида. Показано, что в их составе представлены бактерии родов Pseudomonas (класс γ-Proteobacteria), Novosphingobium (класс α-Proteobacteria), Sphingoauranticus (класс α-Proteobacteria), Sphingomonas (класс α-Proteobacteria), Tardibacter (класс α-Proteobacteria). Установлено, что в тотальных ДНК, выделенных из ассоциаций L2-6, L3-6, L4-6 и L6-6, присутствуют гены, обладающие высоким уровнем сходства (98–100%) с генами linABCX “верхнего” пути аэробного разложения линдана. Бактериальная ассоциация L4-10 наиболее эффективно осуществляла биодеструкцию линдана (90–100%-ное разложение за 30 сут), а также образующихся при этом побочных хлорароматических соединений. Показано, что внесение данной ассоциации в загрязненную линданом почву приводило к ее эффективной ремедиации (78.1 – 90%-ная деструкция линдана за 45 сут). Полученные результаты позволили предположить, что бактериальные ассоциации L2-6, L3-6, L4-6, L6-6 и L4-10 можно использовать при разработке биотехнологий, направленных на восстановление почв, загрязненных линданом.

В работе использовали оборудование молекулярно-генетической лаборатории кафедры ботаники и генетики растений Пермского государственного национального исследовательского университета, а также ЦКП “Исследования материалов и вещества” ПФИЦ УрО РАН.

Работа выполнена в рамках НИОКР АААА-А19-119112290009-1 “Молекулярные механизмы адаптации микроорганизмов к факторам среды”

Список литературы

  1. Vijgen J., Abhilash P.C., Li Y.F., Lal R., Forter M., Torres J., Singh N., Yunus M., Tian C., Schäffer A., Webwr R. // Environ. Sci. Pollut. Res. 2011. V. 18. P. 152–162. https://doi.org/10.1007/s11356-010-0417-9

  2. Vijgen J., de Borst B., Weber R., Stobiecki T., Forter M. // Environ. Pollut. 2019. V. 248. P. 696–705. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2019.02.029

  3. Егорова Д.О., Шестакова Е.А., Первова М.Г., Плотникова Е.Г. // Вестник Пермского университета. 2014. № 4. С. 64–72.

  4. Назаров А.В., Егорова Д.О., Макаренко А.А., Демаков В.А., Плотникова Е.Г. // Экология человека. 2016. № 3. С. 3–8.

  5. Revich B., Aksel E., Ushakova T., Ivanova I., Zhuc-henko N., Klyuev N., Brodsky B., Sotskov Y. // Chemosphere. 2001. V. 43. № 4–7. P. 951–966.

  6. Alvarez A., Benimeki C.S., Saez J.M., Fuentes M.S., Cuozzo S.A., Polti M.A., Amoroso M.J. // Int. J. Mol. Sci. 2012. V. 13. № 11. P. 15086–15106.

  7. Camacho-Pérez B., Ríos-Leal E., Rinderknecht-Seijas N., Poggi-Varaldo M. // J. Environm. Managem. 2012. V. 95. P. S306–S318.

  8. Kumar D., Pannu R. // Bioresour. Bioprocess. 2018. V. 5. P. 29. https://doi.org/10.1186/s40643-018-0213-9

  9. Lal R., Pandey G., Sharma P., Kumari K., Malhotra S., Pandey R., Raina V., Kohler H.P., Holliger C., Jackson C., Oakeshott J.G. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010. V. 74. № 1. P. 58–80.

  10. Nagata Y., Endo R., Ito M., Ohtsubo Y., Tsuda M. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 76. P. 741–752. https://doi.org/10.1007/s00253-007-1066-x

  11. Raimondo E.E., Aparicio J.D., Briceño G.E., Fuentes M.S., Benimeli C.S. // J. Soil Sci. Plant Nutrit. 2019. V. 19. P. 29–41. https://doi.org/10.1007/s42729-018-0003-7

  12. Sahoo B., Chaudhuri S. // Environ. Sustainability. 2019. V. 2. P. 97–106.

  13. Chuang S., Wang B., Chen K., Jia W., Qiao W., Ling W., Tang X., Jiang J. // Sci. Total Environ. 2020. V. 746. 140992. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.140992

  14. Pearce S.L., Oakeshott J.G., Pandey G. // G3. Genes. Genomes. Genetics. 2015. V. 5. № 6. P. 1081–1094.

  15. Bajaj S., Sagar S., Khare S., Singh D.K. // Int. Biodeterior. Biodegrad. 2017. V. 122. P. 23–28. https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2017.04.014

  16. Benimeli C.S., Castro G.R., Chaile A.P. // Int. Biodeterior. Biodegrad. 2007. V. 59. № 2. P. 148–155. https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2006.07.014

  17. Kumar D., Kumar A., Sharma J. // Bioresour. Bioprocess. 2016. V. 3. P. 53. https://doi.org/10.1186/s40643-016-0130-8

  18. Pannu R., Kumar D. // Biocat. Agricult. Biotech. 2017. V. 11. P. 97–107. https://doi.org/10.1016/j.bcab.2017.06.009

  19. Pesce S.F., Wunderling D.A. // Int. Biodeterior. Biodegrad. 2004. V. 54. № 4. P. 255–260.

  20. Raimondo E.E., Saez J.M., Aparicio J.D., Fuentes M.S., Benimeli C.S. // Chemosphera. 2020. V. 238. 124512. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2019.124512

  21. Saez J.M., Aparicio J.D., Amoroso M.J., Benimeli C.S. // Proc. Biochem. 2015. V. 50. № 11. P. 1923–1933.

  22. Saez J.M., Benimeli C.S., Amoroso M.J. // Chemosphera. 2012. V. 89. № 8. P. 982–987.

  23. Saez J.M., Bigliardo A.L., Raimondo E.E., Briceño G.E., Polti M.A., Benimeli C.S. // Ecotoxicol. Environm. Safety. 2018. V. 156. P. 97–105. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2018.03.011

  24. Saez J.M., García V.C., Benimeli C.S. // Ecotoxic. Environm. Safety. 2017. V. 144. P. 351–359. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2017.06.026

  25. Salam J.A., Das N. // World J. Microbiol. Biotechnol. 2014. V. 30. P. 1301–1313. https://doi.org/10.1007/s11274-013-1551-6

  26. Zheng G., Selvam A., Wong J.W.C. // Int. Biodeterior. Biodegrad. 2011. V. 65. № 4. P. 612–618.

  27. Regar R.K., Gaur V.K., Bajaj A., Tambat S., Manickam N. // Sci. Total Environ. 2019. V. 681. P. 413–423. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2019.05.090

  28. Методы почвенной микробиологии и биохимии: Учеб. пособие / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1991. 304 с.

  29. Raymond R.L. // Develop. Industrial Microb. 1961. V. 2. P. 23–32.

  30. Zaitsev G.M., Tsoi T.V., Grishenkov V.G., Plotnikova E.G., Boroni A.M. // FEMS Microbiol. Lett. 1991. V. 81. № 2. P. 171–176.

  31. Bertani G. // J. Bacteriol. 1951. V. 62. № 3. P. 293–300.

  32. Short protocols in molecular biology. 3rd ed. / Eds. F.M. Ausbel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl N.Y.: John Wiley & Sons, 1995. 450 p.

  33. Tiirola M.A., Männistö M.K., Puhakka J.A., Kulomaa M.S. // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. № 9. P. 173–180.

  34. Fierer N., Jackson J.A., Vilgalys R., Jackson R.B. // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. № 7. P. 4117–4120.

  35. Jurelevicius D., Alvarez V.M., Peixoto R., Rosado A.S., Seldin L. // Appl. Soil Ecol. 2012. V. 55. P. 1–9. https://doi.org/10.1016/j.apsoil.2011.12.008

  36. Thomas J.-C., Berger F., Jacquier M., Bernillon D., Baud-grasset F., Truffaut N., Norm P., Vogel T.M., Simonet P. // J. Bacteriol. 1996. V. 178. № 20. P. 6049–6055.

  37. Cérémonie H., Boubakri H., Mavingui P., Simonet P., Vogel T.M. // FEMS Microbiol. Lett. 2006. V. 257. № 2. P. 243–252

  38. Manickam N., Mau M., Schlömann M. // Appl Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 69. № 2. P. 580–588.

  39. Raimondo E.E., Saez J.M., Aparicio J.D., Fuentes M.S., Benimeli C.S. // J. Environ. Menegm. 2020. V. 276. 111309. https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2020.111309

  40. Chang S.-C., Wu M.-H., Chen T.-W. // J. Soils Sedim. 2021. V. 21. № 1. P. 469–486. https://doi.org/10.1007/s11368-020-02789-8

  41. Zhao Y., Zhang Y., Wang J., Hou Q., Liu W., Wu Y., Christie P. // J. Soils Sedim. 2020. V. 20. № 1. P. 2155–2165. https://doi.org/10.1007/s11368-020-02593-4

  42. Schwarz A., Adetutu E.M., Juhasz A.L., Aburto-Medina A., Ball A.S., Shahsavari E. // Microb. Ecol. 2018. V. 75. № 4. P. 888–902. https://doi.org/10.1007/s00248-017-1094-8

  43. Lee H., Kim D., Park S. // J. Microbiol. 2018. V. 56. № 5. P. 324–330. https://doi.org/10.1007/s12275-018-7455-2

  44. Anand S., Sangwan N., Lata P., Kaur J., Dua A., Singh A.K., Verma M., Kaur J., Khurana J.P., Khurana P., Mathur S., Lal R. // J. Bacteriol. 2012. V. 194. № 16. P. 4471–4472.

  45. Kumari R., Subudhi S., Suar M., Dhingra G., Raina V., Dogra C., Lal S., van der Meer J.R., Holliger C., Lal R. // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. № 12. P. 6021–6028.

  46. Tabata M., Ohhata S., Kawasumi T., Nikawadori Y., Kishida K., Sato T., Ohtsubo Y., Tsuda M., Nagata Y. // Genome Announc. 2016. V. 4. № 2. E00247-16.

  47. Tabata M., Ohhata S., Nikawadori Y., Sato T., Kishida K.,Ohtsubo Y., Tsuda M., Nagata Y. // Genome Announc. 2016. V. 4. № 2. E00246-16.

  48. Tabata M., Ohtsubo Y., Ohhata S., Tsuda M., Nagata Y. // Genome Announc. 2016. V. 1. № 3. E00247-13. https://doi.org/10.1128/genomeA.00247-13

  49. Lal R., Dogra C., Malhotra S., Sharma P., Pal R. // Trends Biotechn. 2006. V. 24. № 3. P. 121–130.

  50. Kumari M., Ghosh P., Swati, Thakur I.S. // Biores. Technol. Reports. 2020. V. 10. 100415 https://doi.org/10.1016/j.biteb.2020.100415

  51. Dong W.H., Zhang P., Lin X.Y., Zhang Y., Tabouré A. // Sci. Total Environm. 2015. V. 505. P. 216 – 222. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2014.10.002

  52. Fang l., Qin H., Shi T., Wu X., Li Q.X., Hua R. // J. Hazard. Mater. 2020. V. 388. 121787. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2019.12178753

  53. Wang F., Grundmann S., Schmid M., Dörfler U., Roherer S., Munch J.C., Hartmann A., Jiang X., Schroll R. // Chemosphere. 2007. V. 67. № 5. P. 896–902.

  54. Abhilash P.C., Srivastava S., Singh N. // Chemosphere. 2011. V. 82. № 1. P. 56–63.

  55. Benimeli C.S., Fuentesa M.S., Abate C.M., Amoroso M.J. // Int. Biodeterior. Biodegrad. 2008. V. 61. № 3. P. 233–239.

  56. Zhang X., Nesme J., Simonet P., Frostegård Å. // Res. Microbiol. 2012. V. 163. № 3. P. 200–210.

  57. Tu Ch., Ma L., Guo P., Song F., Teng Y., Zhang H. // Chemosphere. 2017. V. 189. P. 517–524. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2017.09.091

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал