Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 2, стр. 174-181

МЕТОДИКА

Для оценки накопления и разнообразия изоформ эмерициллипсинов был использован типовой штамм мицелиального гриба Emericellopsis alkalina Е101 (BKM F-4108; CBS 127350) из коллекции “Грибы экстремальных местообитаний” кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (Россия). Штамм был выделен из образца почвы с побережья содового озера Танатар (Алтайский край, Россия) [13]. В результате скрининга 64 штаммов этого вида было выявлено [14], что штамм E. alkalina Е101, наряду с изученным ранее штаммом-продуцентом E. alkalina А118 (ВКМП F-1428), был наиболее продуктивным по выходу основного компонента EmiА.

Штамм-продуцент E. alkalina Е101 выращивали на специализированной жидкой щелочной среде, подобранной ранее [15]. Для приготовления сред с различными рН использовали буферы: цитратно-фосфатный для pH 7.0, фосфатно-цитратный для pH 9.0 и карбонатно-бикарбонатный для pH 10.0. Культивирование проводили в течение 7, 14 и 21 сут стационарным способом в колбах Эрленмейера на 750 мл, глубинным способом на шейкере-инкубаторе Innova 40R (“Eppendorf New Brunswick”, США), а также в ферментере мембранно-жидкостным способом на матрице из бактериальной целлюлозы. Получали матрицы бактериальной целлюлозы культивированием штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 в стационарных условиях при температуре 27°С в течение 14 сут на жидкой среде Н-5. Полученную матрицу бактериальной целлюлозы отмывали от клеток продуцента 0.1 н раствором NaOH и дистиллированной водой, лиофильно высушивали и стерилизовали. Стационарное мемранно-жидкостное культивирование в щелочной среде осуществляли на матрице бактериальной целлюлозы в качестве подложки.

Культуральную жидкость (КЖ) отделяли фильтрацией через мембранные фильтры на воронке Зейтца под вакуумом. Затем КЖ экстрагировали этилацетатом или бутанолом в соотношении 5 : 1 3 раза. Полученные экстракты упаривали в вакууме на роторном испарителе “Rotavapor-RBüchi” (Швейцария) при 42°C досуха, остаток растворяли в водном 50%-ном этаноле и получали спиртовые концентраты.

Оценку активности в отношении условно-патогенных грибов проводили в КЖ до экстракции и после, а также в экстрактах мицелия. Антимикробную активность определяли с помощью стерильных бумажных дисков (“НИИ Пастера”, Россия), смоченных в антибиотике и высушенных в стерильных условиях. В качестве контроля использовали стандартные диски с флуконазолом для грибов (40 мкг, “НИИ Пастера”, Россия) и амоксициллином/клавулоновой кислотой для бактерий (20/10 мкг, “НИИ Пастера”, Россия). Для оценки фунгицидной активности использовали тест-штаммы: плесневый гриб Aspergillus niger INA 00760 и дрожжи Candida albicans АТСС 2091.

Антибактериальную активность оценивали по отношению к грамотрицательной бактерии Escherichia coli ATCC 25922 и грамположительной бактерии Bacillus subtilis АТСС 6633. Тест-культуру B. subtilis АТСС 6633 выращивали на среде Гаузе № 2 следующего состава (г/л): триптон – 2.5 (или бульон Хоттингера – 30 мл), пептон – 5, хлорид натрия – 5, глюкоза – 10; E. coli ATCC 25922 на среде LB (триптон-соевый агар). Культуры грибов A. niger INA 00760 и C. albicans АТСС 2091 выращивали на среде Чапека. Предварительно культуры выращивали в пробирках со скошенным питательным агаром, после чего клетки с поверхности агара суспендировали в физиологическом растворе до мутности 0.5 по стандарту McFarland (1.5 × 10⁸ КОЕ/мл) и использовали в течение 15 мин. Для посева использовали суточные культуры бактерий и пятисуточные культуры грибов и дрожжей. Все тест-культуры получены из коллекции культур “НИИНА им. Г.Ф. Гаузе”.

Полученные спиртовые концентраты объединяли, упаривали досуха на роторном испарителе (“Labconco”, США) и далее перерастворяли в 100 мкл 50%-ного этанола. Исследуемые в работе концентраты анализировали методом обращенно фазовой ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ). Анализ проводили на микроколоночном хроматографе Милихром А-02 (ЗАО “Эконова”, Новосибирск), использовали колонки из нержавеющей стали, Nucleosil-100-5-C18 (L = 75.0 мм; D = 2.0 мм; d = 5 мкм, “Macherey-Nagel”, Германия). Детектирование в ходе анализа проводили при 214 нм. Скорость потока 100 мкл/мин, температура термостатирования колонки 35°С, инжекционный объем – 15 мкл. Состав подвижной фазы: компонент А – H₂O (MQ) + + 0.02%-ная ТФУ (ВЭЖХ, “Sigma-Aldrich”, Германия), компонент Б – ацетонитрил + 0.02%-ная ТФУ. Градиент подвижной фазы от 0 до 100% Б за 40 мин и далее в изократическом режиме 4 мин при 100%-ном содержании элюента В.

Для анализа методом MALDI-TOF MS 0.3 мкл фракции ацетонитрил-вода (собранной при разделении методом ВЭЖХ) образца и 0.5 мкл 2,5-дегидроксибензойной кислоты (“Sigma-Aldrich”, Германия) раствор в 20%-ном ацетонитриле + 79.5% вода (МQ) + 0.5% ТФУ (ВЭЖХ, “Sigma-Aldrich”) в концентрации 20 мг/мл смешивали на мишени спектрометра. Запись спектров и MC-анализа проводили на MC-спектрометре MALDI-TOF (Ultrafle Xtreme, “Bruker Daltonics”, Германия) с УФ-лазером (Nd) в режиме регистрации положительных ионов с использованием рефлектрона. Точность определения массы составляла около 1 Да.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для штамма E. alkalina Е101 [14], первоначально исследовали образование эмерициллипсинов в культуральной жидкости и мицелии при нейтральных и щелочных начальных рН (7.0, 9.0, 10.0) в стационарных и глубинных условиях культивирования. Было показано, что содержание EmiA в мицелии всегда оставалось значительно ниже, чем в КЖ в одних и тех же вариантах. Для мицелия отмечено большее содержание EmiA в условиях глубинного культивирования, в то время как в КЖ выявлено большее содержание EmiA в стационарных условиях во всех исследованных вариантах, что свидетельствует о том, что в этих условиях антибиотик лучше экскретирует в культуральную жидкость.

Содержание EmiA в мицелии (0.25 мг/г) достигало максимума на 7 сут при глубинном способе культивирования при рН среды 10.0. Наиболее высокие количества EmiA в КЖ зарегистрированы на 14 сут роста при всех исследованных начальных рН среды, но при щелочных рН (9.0 и 10.0) содержание EmiA было максимально и составило 6.0–6.5 мг/л (рис. 1). Проведенный эксперимент подтвердил, что несмотря на то, что штаммы E. alkalina способны к росту и развитию в широком диапазоне рН среды (4.0–11.0) с оптимумом роста при рН 10.0 [13], EmiA лучше образуется в щелочных условиях культивирования.

Рис. 1.

Динамика образования EmiА (мг/л) при начальных рН 7.0 (1), 9.0 (2) и 10.0 (3) в мицелии (а, б) и КЖ (в, г) E. alkalina Е101 при поверхностоном (а, в) глубинном (б, г) культивировании.

Алкалофильные грибы E. alkalina, обитающие на побережьях засоленных озер, часто сосуществуют с многочисленными и разнообразными прокариотами, образующими на поверхности раздела фаз биопленки. Считается, что моделирование природных условий для продуцента может способствовать увеличению накопления целевых антибиотиков в среде [16]. Было проведено сравнение выхода EmiA при стационарном культивировании и мембранно-жидкостном, где в качестве модели природной бактериальной пленки использовали подложки бактериальной целлюлозы. Наибольшее содержание EmiA в КЖ и мицелии отмечено при стационарном мембранно-жидкостном культивировании (табл. 1). При росте на бактериальной целлюлозе в качестве подложки выход EmiА у штамма E. alkalina Е101 увеличивался в 1.7 раза по сравнению с поверхностным способом культивирования и составил 11.05 мг/л. При этом было установлено, что помимо основного целевого пептаибола EmiА синтезируются другие минорные изоформы, ранее не обнаруженные в стационарных условиях. При этом экстракт из КЖ и мицелия, полученный в мембранно-жидкостных условиях культивирования проявлял активность в отношении грамотрицательных бактерий, в то время как экстракт, полученный в условиях стационарного культивирования был не активен в отношении этих бактерий, что свидетельствовало о том, что помимо основного противогрибкового компонента в этих условиях продуцент начинал синтезировать антибактериальные соединения.

В дальнейшем была проведена оценка многообразия различных изоформ в пептидном комплексе, синтезируемом при выращивании мембранно-жидкостным способом на мембране из бактериальной целлюлозы. После проведения аналитической ОФ ВЭЖХ были собраны фракции пиков с различным временем удерживания при элюции градиентом концентрации ацетонитрила от 70 до 100% (рис. 2). При этом вблизи области локализации пиков EmiA на хроматограмме обнаруживались другие пики с большим и меньшим временем удерживания. Фракции с 1 по 17 (рис. 2) были собраны и проанализированы методом MALD-TOF-MS. Полученные массы молекулярных ионов [M + Н]⁺ компонентов фракций представлены в табл. 2.

Рис. 2.

ОФ ВЭЖХ спиртового объединенного концентрата в градиенте концентрации ацетонитрила.

Фрагментация индивидуальных пептаиболов с молекулярными массами 1022.8; 994.5 и 1036.7 позволила предположить, что для данных молекул существует несколько возможных (не менее 2) структур пептидов, соответствующих одной и той же молекулярной массе, однако это требует дальнейшего подтверждения методом ЯМР – спектроскопии (рис. 3).

Рис. 3.

Масспектры 1-8 (а) и 9-17 (б) хроматографических индивидуальных пиков концентрата, полученного в условиях мембранно-жидкостного культивирования.

Рис. 3.

Окончание.

По результатам исследования разности масс между выделенными компонентами при проведении аналитической ОФ ВЭЖХ (табл. 2) удалось обнаружить, что различие их (по массе) соответствует либо “-CH₂-”-фрагменту (M = 14 Да), либо молекуле H₂O (М = 18 Да), что представлено графически на схеме (рис. 4). Зависимость показывает молекулярные связи отдельных уже обнаруженных форм пептаиболов, а также ожидаемые молекулярные массы (выделены красным). Ввиду близости времен удерживания компонентов (табл. 2, рис. 2), а также существования цепочки связей между молекулярными массами этих компонентов (рис. 3б), можно предположить, что массы компонентов, соответствуют соединениям одинаковой химической природы. Некоторые массы пептаиболов, представленные на схеме, ранее были не только обнаружены, но и идентифицированы. Так, например, масса 1050 Да соответствует самому EmiА [10], а масса 1036.7 Да соответствует изоформе EmiB [10], масса 1032.9 Да – дегидроформе [14]. Таким образом, построенная схема связывает различные формы уже обнаруженных эмерициллипсинов А – Е, с необнаруженными ранее массами, 1004.7; 1018.7; 1046.8; 1064.8 [10], которые укладываются в общий гомологический ряд. Представленная схема масс носит предположительный характер, ввиду того, что схожесть химических форм пока не была подтверждена более точными спектральными методами. Для выделенных изоформ эмерициллипсинов с массами 1032.9, 1036.7 Да ранее была показана противогрибковая активность [10].

Рис. 4.

Схема связи масс различных молекулярных ионов, обнаруженных в ходе анализа (отмечены черным цветом). Стрелками показана связь между формами; над стрелками цифры – разность молекулярных масс между соединенными блоками. Желтые прямоугольники – формы EmiA и dEmiA (дегидроформа); красными показаны предполагаемые молекулярные массы, красные стрелки показывают (предположительно) связи форм, над стрелками указаны разность масс связанных молекулярных форм.

Таким образом, установлено, что новый мембранно-жидкостной способ культивирования продуцентов пептаиболов эмерициллипсинов приводит к увеличению многообразия синтезируемых природных форм пептидов и увеличению выхода основного соединения в 1.7 раза. Изучение потенциального разнообразия АМП, синтезируемых продуцентом на уровне первичной или пространственной структуры, может послужить стимулом к обнаружению у них других типов биологической активности и созданию новых синтетических пептидов на их основе.

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ в рамках научного проекта № 20-75-00062 (А.Е. Куварина, М.А. Суконников).