Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 2, стр. 182-190

МЕТОДИКА

Штаммы и ферментные препараты. В работе были использованы штаммы гриба Penicillium canescens – продуценты рекомбинантных эндоА Aspergillus niger (штамм РСА-эндоА, [5]), экзоА P. canescens (РСА-экзоА, [6]), АКГ P. canescens (РСА-АКГ, [7]), АФ P. canescens (АФ Pс, РСА-АФ, [7]), пектинлиазы А (ПЛ) P. canescens (РСА-ПЛ, [8]), штаммы гриба P. verruculosum В1-537 [9, 10] и F10 [11] – продуценты целлюлаз (целлобиогидролазы I, ЦБГ и эндоглюканазы II, ЭГ) и рекомбинантной β-глюкозидазы (БГ) A. niger соответственно, а также штамм гриба A. foetidus 70а (Af-70а) [12] – продуцент АФ A. foetidus (АФ Af).

Ферментные препараты (ФП) были получены путем лиофильного высушивания КЖ штаммов на лиофильной сушке Benchtop 6K ES (“SP Scientific/Virtis”, США).

Гомогенные ферменты были выделены из перечисленных выше ФП по методикам, описанным в работах [5–11]. Выделение АФ Af описано в настоящей работе.

Реагенты. Для создания буферных смесей использовали реактивы фирм “Bio-Rad” (США), “Panreac” (Германия), “Helicon” и “Реахим” (Россия).

Для определения активностей ферментов в качестве субстратов использовали арабинаны линейный (ЛАра) и разветвленный (РАра) из сахарной свеклы – все “Megazyme” (Австралия); Na-соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), цитрусовый пектин со степенью этерификации около 70%, п-нитрофенил-α-арабинофуранозид (пНФАФ), п-нитрофенил-β-глюкопиранозид (пНФГл) – “Sigma” (США); микрокристаллическую целлюлозу (ТУ 20.16.59-001-40693384-209) производства “Кристацелл” (Россия).

При ферментативном гидролизе в качестве субстратов использовали РАра, СЖ и ЯВ.

Сухой СЖ (“Агрин”, Россия) был измельчен до частиц 0.5–1.0 мм на мельнице MF10 basic (“IKA Werke”, Германия). ЯВ (содержание сухих веществ 17%) были получены перетиранием плодов яблок сорта “Мельба” на бытовой шнековой соковыжималке (“Scarlett”, Россия) с отделением сока.

Определение активностей ФП. За 1 ед. активности принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоль продукта за 1 мин.

Активности по отношению к полисахаридным субстратам (концентрация 5 г/л в реакционной смеси) определяли по начальным скоростям образования восстанавливающих сахаров (ВС) при рН 5.0 и 50°С методом Шомоди–Нельсона [13].

Активности по отношению к п-нитрофенильным производным сахаров (0.9 мМ в реакционной смеси) определяли по скорости образования п-нитрофенола при рН 5.0 и 50°С [13].

Лиазную активность определяли по изменению оптической плотности при 232 нм, регистрирующей накопление 4,5-ненасыщенного продукта трансэлиминирования пектина [14].

Содержание белка в ФП определяли методом Лоури, используя БСА в качестве стандарта. Концентрацию гомогенных ферментов оценивали по оптической плотности при 280 нм, используя рассчитанные по аминокислотной последовательности коэффициенты экстинкции.

Электрофорез в 12%-ном ПААГ с Na-ДДС (ЭФ-ПААГ) проводили на приборе MiniProtein (“Bio-Rad”, США) согласно руководству к прибору. Содержание отдельных белков в ФП оценивалось методом денситометрии.

Биоконверсия растительного сырья. Биоконверсию субстратов проводили под действием гомогенных ферментов или их смесей, при суммарном содержании белка 0.1 при гидролизе РАра и 2 мг/г субстрата при гидролизе СЖ и ЯВ или 0.001 и 0.2 мг/мл реакционной смеси соответственно. Гидролиз проводили в пластиковых пробирках объемом 2 мл (объем реакционной смеси 1.5 мл) в термостатируемом шейкере Biosan TS-100 (“Biosan”, Латвия) в присутствии 0.1 г/л антибиотика ампициллина (РУП “Белмедпрепараты”, Республика Беларусь) при рН 5.0 и 40°С. Концентрация субстрата составляла 10 (в случае РАра) или 100 г/л (в случае СЖ и ЯВ) в пересчете на сухое вещество.

В ходе гидролиза отбирали аликвоты, в которых определяли концентрацию ВС (методом Шомоди–Нельсона). Качественный и количественный состав низкомолекулярных сахаров определяли с помощью ВЭЖХ-системы Agilent 1100 (“Agilent”, США) на колонке Диасфер-110-Амин (5 мкм, 4.0 × × 250 мм). В качестве элюента использовали смесь ацетонитрил–вода 75 : 25 при скорости элюции 1 мл/мин, объем анализируемого образца 10–100 мкл.

Глубину гидролиза субстратов рассчитывали исходя из содержания в них полисахаридов [3, 4]. Величину коэффициента синергизма (КС) рассчитывали как отношение экспериментально полученного значения концентрации продукта гидролиза (ВС) при совместном действии ферментов к теоретически рассчитанному, последнее определяли как сумму концентраций ВС, полученных при действии отдельных ферментов с учетом доли каждого фермента в смеси.

Очистка АФ Af хроматографическими методами. Получение гомогенного фермента проводили с помощью жидкостной хроматографической системы NGC Chromatography Systems (“Bio-Rad”, США) со спектрофотометрическим детектором. На первой стадии ФП (10 мг белка) наносили на анионообменную колонку Source 15Q (“Pharmacia”, Швеция), уравновешенную 0.02 М бис-трис-HCl буфером с рН 6.8. Связавшиеся с сорбентом белки элюировали линейным градиентом NaCl от 0 до 0.4 М со скоростью 1 мл/мин.

На следующем этапе очистки использовали гидрофобную хроматографию на колонке Source 15 Isopropyl (объем 1 мл, “Pharmacia”, Швеция). Во фракцию, содержащую исследуемый фермент, добавляли при перемешивании сухой (NH₄)₂SO₄ до концентрации 1.7 М. Затем образец наносили на колонку, уравновешенную 0.02 М Na-ацетатным буфером, содержащим 1.7 М (NH₄)₂SO₄. Элюцию проводили в обратном градиенте концентрации (NH₄)₂SO₄ от 1.7 до 0 М со скоростью 1 мл/мин.

Для дальнейшей работы фракции, содержащие очищенные белки, обессоливали на колонке с биогелем Р4, уравновешенной 0.05 М Na-ацетатным буфером с рН 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Очистка ферментов и анализ их специфичности. Выделение эндоА, экзоА, АКГ, АФ Pc, ПЛ, ЦБГ, ЭГ и БГ из соответствующих ФП проводили согласно методикам, описанным в работах [5–11]. Для очистки АФ Af использовали двухстадийную схему, включающую анионообменную с последующей гидрофобной хроматографией. На первой стадии фракция, содержащая АФ Af, была собрана при концентрации NaCl 0.2 М, на второй стадии – при 0.7 М (NH₄)₂SO₄.

Во всех случаях гомогенность очищенных белков составляла более 90% согласно данным ЭФ-ПААГ (рис. 1). Их идентификация была осуществлена на основании результатов масс-спектрометрического анализа трипсиновых гидролизатов [15]. Активности очищенных ферментов к ряду субстратов представлены в табл. 1.

Рис. 1.

Электрофорез в ПААГ с Na-ДДС очищенных ферментов: 1 – экзоА, 2 – эндоА, 3 – АФ Af, 4 – АКГ, 5 – АФ Pc, 6 – ЭГ, 7 – БГ, 8 – ЦБГ, 9 – ПЛ. М-маркеры, указаны молекулярные массы стандартных белков.

ЭндоА обладала высокой активностью при использовании в качестве субстрата ЛАра (52 ед./мг) и низкой при использовании РАра (4 ед./мг). ЭкзоА проявляла высокую активность по отношению к ЛАра (117 ед./мг) и крайне низкую к РАра (5 ед./мг) и пНФАФ (0.3 ед./мг). В отличие от эндоА и экзоА АКГ, АФ Pc и АФ Af проявляли крайне низкую активность к ЛАра, обладая при этом высокой активностью к РАра и/или к пНФАФ: активности АКГ к РАра и к пНФАФ составляли 28 и 13 ед./мг соответственно, активности АФ Pc и АФ Af по отношению к РАра – 2 и 11 ед./мг соответственно, к пНФАФ – 16–18 ед./мг. На основе данных о субстратной специфичности и результатов масс-спектрометрического анализа АФ Pc была отнесена к типу А, АФ Af – к типу В.

Изучение синергизма при гидролизе РАра под действием арабиназ. Было изучено синергетическое взаимодействие между эндоА и ферментами экзо-типа действия: экзоА, АФ Af, АФ Pc и АКГ. Для этого подготовлены смеси ферментов, в которых доля эндоА составляла 20, 40, 60 или 80%. С помощью этих смесей, а также индивидуальными ферментами был проведен гидролиз РАра (исходная концентрация 10 г/л). В табл. 2 представлены концентрация ВС после 24 ч гидролиза и значения КС.

Индивидуальная эндоА практически не гидролизовала РАра: концентрация ВС после 24 ч гидролиза составила 0.4 г/л. Также невысокая концентрация ВС (менее 1 г/л) наблюдалась при действии индивидуальных экзоА и АФ Pc, а также их смесей с эндоА. Наибольшую концентрацию ВС (4.8 г/л) наблюдали для смеси эндоА и АКГ при содержании ферментов 40 и 60% соответственно. При этом рассчитанное значение КС составило 2.8. Менее эффективной оказалась смесь эндоА с АФ Af при содержании ферментов 20 и 80% соответственно: концентрация ВС и значение КС составили 2.7 г/л и 2.2 соответственно. Следует отметить, что индивидуальные АКГ и АФ Af были способны активно гидролизовать РАра: после 24 ч гидролиза концентрация ВС составила 2.6 и 1.4 г/л соответственно, в обоих случаях единственным продуктом гидролиза была арабиноза.

Таким образом увеличить доступность основной цепи арабинана для эндоА могли только АКГ и АФ Af – ферменты, обладающие способностью не только гидролизовать олигомерные субстраты, но и отщеплять боковые заместители в РАра. Так как смеси эндоА с экзоА или АФ Pc были малоэффективны, далее они не рассматривались как возможный компонент оптимального ферментного комплекса.

Подбор ферментов для гидролиза ЯВ. Следует отметить, что содержание ВС в исходных ЯВ было высоким – 50 г/л (при исходной концентрации субстрата в реакционной смеси 100 г/л по сухой массе). При этом основными сахарами были фруктоза и глюкоза: 35 и 14 г/л соответственно.

В соответствии с полученными результатами среди экзоарабиназ были выбраны наиболее активные ферменты и оптимальное соотношение ферментов эндо- и экзо-типов – это смеси эндоА + + АФ Af (в соотношении 20 : 80) и эндоА + АКГ (40 : 60). Был проведён гидролиз ЯВ (табл. 3) в течение 48 ч индивидуальными ферментами и подобранными смесями.

Можно однозначно выделить АФ Af как наиболее эффективный фермент при гидролизе ЯВ. Концентрация ВС после 48 ч гидролиза в присутствии только этого фермента АФ Af составила 65 г/л, а в присутствии смеси эндоА + АФ Af – 93 г/л (КС 1.5). Основными продуктами гидролиза были фруктоза и глюкоза (65 и 25 г/л соответственно), а также присутствовала арабиноза (3.4 г/л). Гидролиз в присутствии АКГ и ее смеси с эндоА по выходу ВС уступал даже АФ Af.

Для эффективного гидролиза растительного сырья ферментная смесь должна содержать целлюлазы ЦБГ, ЭГ, БГ в оптимальном соотношении, обеспечивающем наибольшую скорость превращения субстрата в нужные продукты [16]. В работе были использованы очищенные ЦБГ (активность по отношению к МКЦ 0.65 ед./мг), ЭГ (активность по отношению к КМЦ 33 ед./мг) из P. verruculosum как ключевые ферменты целлюлазного комплекса гриба, выделенные из ФП В1-537 по методикам, описанным в работах [9, 10], а также БГ A. niger (активность по отношению к п-НФГл 105 ед./мг), выделенная из ФП F10 по методике [11]. Оптимальное соотношение между ЦБГ и ЭГ составляло 4 : 1, как было показано в работе [16]. Для устранения ингибирования ЦБГ продуктом реакции (целлобиозой) в реакционную смесь вносили БГ в соотношении ЦБГ : БГ 9 : 1 [10]. В итоге была использована смесь целлюлаз, обозначаемая далее как Ц, содержащая ЦБГ, ЭГ, БГ в отношении 7 : 2 : 1 соответственно.

Присутствие пектина является важным фактором, затрудняющим ферментативную переработку растительного сырья, так как даже относительно небольшое его содержание обуславливает высокую вязкость раствора. В качестве пектиназы был использован фермент ПЛ P. сanescens (активность по отношению к пектину 19 ед./мг), выделение которого проводили по методике [8].

Гидролиз ЯВ проводили как отдельными ферментами (Ц и ПЛ), так и их смесями с соотношением компонентов по концентрации белка 1 : 1 и 9 : 1 соответственно. Соотношения были выбраны исходя из предположительного состава субстратов и уровня специфических активностей ферментов. Результаты представлены в табл. 3. Наиболее эффективной была смесь Ц + ПЛ с большим содержанием целлюлазного комплекса (соотношение Ц : ПЛ 9 : 1): после 48 ч гидролиза концентрация ВС составила 82 г/л, КС – 1.3, среди продуктов преобладали фруктоза и глюкоза 53 и 29 г/л соответственно.

На основании полученных результатов были составлены комплексы ферментов А1-А4, содержащие арабиназы, целлюлазы и пектиназу (табл. 4), для проведения гидролиза ЯВ (табл. 3). Смеси А1 и А3 с увеличенным содержанием Ц (70% от общего белка) были более эффективны, чем смеси А2 и А4 с содержанием Ц 50%. Наибольшая концентрация ВС (105 г/л) после 48 ч гидролиза ЯВ была получена при использовании смеси А1 с АФ Af. Продуктами гидролиза были арабиноза (3.2 г/л), фруктоза (67 г/л) и глюкоза (31 г/л).

Для всех смесей (А1-А4) значения КС, характеризующего взаимодействие целлюлазного, пектиназного и арабиназного комплексов, были больше 1, в пределах 1.2–1.6, что свидетельствует о присутствии положительного синергетического эффекта.

Подбор ферментов для гидролиза СЖ. Содержание ВС в исходном СЖ было невысоким около 1 г/л при исходной концентрации субстрата 100 г/л. При гидролизе СЖ эффективность индивидуальных арабиназ была примерно одинакова с небольшим преимуществом АКГ: концентрация ВС после 48 ч гидролиза составила 6.4–6.7 г/л, основными сахарами были фруктоза (2.4–2.8 г/л), глюкоза (2.5–3.0 г/л), арабиноза (0.7–1.1 г/л) (табл. 3).

При гидролизе СЖ смесями эндоА + АФ Af или эндоА + АКГ во всех случаях наблюдалось синергетическое взаимодействие между ферментами эндо- и экзо-типа действия, значения КС составили 1.4 и 1.5 соответственно. Использование смесей ферментов при гидролизе СЖ по сравнению с действием отдельных ферментов привело к увеличению концентрации ВС на 2.5–3 г/л в основном за счет увеличения выхода арабинозы (табл. 3). Разница между выходом продуктов при использовании смеси эндоА + АФ Af или эндоА + АКГ была незначительной.

При гидролизе СЖ в присутствии смесей Ц + ПЛ более эффективной оказалась смесь с равным содержанием Ц и ПЛ: после 48 ч гидролиза концентрация ВС составила 17 г/л, КС – 2.0, а среди продуктов преобладала глюкоза (11 г/л).

Из комплексов ферментов А1–А4, составленных из арабиназ, целлюлаз и пектиназы, смеси А1 и А3 с увеличенным содержанием Ц (70% от общего белка) были более эффективны, чем смеси А2 и А4 с 50%-ным содержанием Ц, что отражалось, в основном, на увеличении выхода глюкозы. Разница между смесями А1 с АФ Af и А3 с АКГ была незначительной: концентрация ВС после 48 ч гидролиза СЖ составила 20–21 г/л, продуктами гидролиза были арабиноза (около 6 г/л), глюкоза (11–12 г/л) и фруктоза (2–3 г/л).

Значение КС для всех смесей (А1-А4) составило 2.0–2.2, что свидетельствовало о присутствии значительно более выраженного синергетического эффекта между целлюлазами, пектиназой и арабиназами при гидролизе СЖ, чем при гидролизе ЯВ.

Гидролиз ЯВ и СЖ ферментными препаратами. На основе полученных результатов были сформированы комплексы ФП с преимущественным содержанием одного рекомбинантного фермента: РСА-эндоА (содержание эндоА от общего белка 22%), РСА-АКГ (29% АКГ), Af-70а (12% АФ Af), РСА-ПЛ (47% ПЛ), В1-537 (ЦБГ 50%, ЭГ 17%), F10 (70% БГ).

Проводился гидролиз как индивидуальными ФП, так и их смесями, составленными в соответствии с наилучшими по составу смесями очищенных ферментов А1 и А3 (ФП А1 и ФП А3 соответственно) (табл. 5). ФП и их смеси дозировали, уравнивая по содержанию белка в реакционной среде – 5 мг/г субстрата. В табл. 6 представлены результаты гидролиза ЯВ и СЖ.

При гидролизе ЯВ наибольший выход продуктов наблюдался для индивидуальных ФП целлюлаз (В1-537 + F10) и пектиназы (РСА-ПЛ), а также их смеси (В1-537 + F10 + РСА-ПЛ): концентрация ВС после 48 ч гидролиза составляла 81–90 г/л с преимущественным содержанием фруктозы (55–64 г/л) и глюкозы (21–26 г/л). Индивидуальные ФП арабиназ давали около 75–77 г/л ВС с преимущественным содержанием фруктозы (52–54 г/л) и глюкозы (18–20 г/л), а также арабинозы – 2.0–2.9 г/л.

Смеси ФП А1 и ФП А3, включающие полный комплекс ФП целлюлаз, пектиназы и арабиназ, но содержащие разные ФП экзоарабиназ, были одинаково эффективны: после 48 ч концентрация ВС составляла 106 г/л, среди моносахаров основной была фруктоза (73–74 г/л), накапливались также глюкоза (27–28 г/л) и небольшое количество арабинозы (3.4–3.6 г/л). При этом наблюдался почти полный гидролиз ЯВ.

Таким образом, использование комплекса ФП целлюлаз, пектиназы и арабиназ при гидролизе ЯВ позволило увеличить выход всех основных моносахаридов (фруктозы, глюкозы, арабинозы) по сравнению с проведением гидролиза только целлюлазами или арабиназами.

При гидролизе СЖ индивидуальные ФП арабиназ были более активными, чем ФП целлюлаз и/или пектиназы. Наибольшая концентрация ВС после 48 ч гидролиза наблюдалась в случае ФП РСА-АКГ и составляла 34 г/л, основными продуктами были арабиноза и глюкоза – 14 и 12 г/л соответственно. При действии только ФП Af-70а или РСА-эндоА выход продуктов гидролиза был немного ниже: концентрация ВС составляла 25–29 г/л, арабинозы – 10–12 г/л, глюкозы – 8–11 г/л.

Смеси ФП А1 и ФП А3 были одинаково эффективны при гидролизе СЖ: концентрация ВС после 48 ч составляла 38–39 г/л, арабинозы – 14–15 г/л, глюкозы 18 г/л, фруктозы – около 6 г/л. Таким образом, использование комплекса ФП целлюлаз, пектиназы и арабиназ при гидролизе СЖ также позволило увеличить выход всех основных моносахаридов относительно действия только ФП целлюлаз или арабиназ.

* * *

Для осуществления полного гидролиза сложных по составу полисахаридных субстратов используется оптимально подобранный с учетом особенностей структуры субстрата ферментативный комплекс. Ценным для получения сахаров сырьем являются растительные отходы пищевой промышленности и сельского хозяйства, такие как ЯВ и СЖ. Ферментативные гидролизаты этих субстратов содержат пентозы (арабинозу, ксилозу) и гексозы (глюкозу, фруктозу), которые могут использоваться для получения этанола [17, 18], молочной кислоты [19] и других продуктов с помощью микроорганизмов. В работе [20] была показана успешная двухстадийная конверсия гидролизата СЖ в этанол дрожжами Saccharomyces cerevisiae (была утилизирована глюкоза) с последующим получением молочной кислоты из пентоз в присутствии Lactobacillus plantarum.

Для получения гидролизатов ЯВ и СЖ с высоким содержанием моносахаридов использовали ФП целлюлаз, пектиназ, ксиланаз [18–21]. ЯВ исходно содержат большое количество растворимых сахаров (глюкоза, фруктоза), поэтому после ферментативного гидролиза ЯВ выход конечных продуктов (ВС, моносахаридов) высок и составляет, как правило, 60–90% от сухой массы [18, 21]. В то же время яблочный жом, получаемый после отмывки ЯВ от растворимых сахаров, является менее реакционно способным и степень его конверсии значительно ниже: в работе [19] из 39 кг жома путем обработки комплексом пектиназ и целлюлаз было получено 4.66 кг растворимых сахаров.

В настоящей работе подбор ферментного комплекса на основе очищенных ферментов позволил осуществить полный гидролиз ЯВ до растворимых сахаров: из 100 г/л (по сухому весу) ЯВ было получено 106 г/л ВС, из которых 50 г/л ВС $\left( { \simeq {\kern 1pt} 50\% } \right)$ соответствовали присутствующим в субстрате растворимым сахарам ЯВ, а 56 г/л ВС получали за счет ферментативного гидролиза нерастворимых полисахаридов ЯВ.

Ранее [22] нами был описан полный гидролиз СЖ в присутствии 12 очищенных ферментов различной специфичности. В настоящей работе более подробно изучено взаимодействие эндо- и экзоарабиназ при их гидролизе арабинана из СЖ, был определен оптимальный качественный (эндоА + АФ Af или эндоА + АКГ) и количественный состав (соотношение ферментов эндо- и экзо-типа действия) арабиназного комплекса, что позволило упростить состав комплекса используемых ферментов. Концентрация арабинозы и глюкозы достигала 15–18 г/л каждой. С учетом того, что содержание гемицеллюлозы и целлюлозы в СЖ составляло 24–32 и 22–24% соответственно [3], конверсия полисахаридов в моносахариды составляла не менее 50 и 75%.

Высокие значения КС при использовании смесей очищенных ферментов разной субстратной специфичности свидетельствуют о необходимости присутствия всех ферментов в реакционной среде. Так для смеси целлюлаз и пектиназы КС составил 1.3 при гидролизе ЯВ и 2.0 при гидролизе СЖ, а при добавлении также арабиназ – 1.5 и 2.2 соответственно.

Работа была выполнена при поддержке Минобрнауки РФ (Регистрационный номер Государственного Задания 122041100066-7).

Авторы благодарят сотрудников ЦКП “Промышленные биотехнологии” ФИЦ Биотехнологии РАН.