Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 2, стр. 167-173

МЕТОДИКА

Конструирование экспрессионного вектора. В работе использовали нуклеотидную последовательность ИФН-γ человека (NP_000610.2). Кодонный состав последовательности гена оптимизировали для экспрессии в системе E. coli при помощи сервиса “Codon Optimisation Tool” (“Integrated DNA Technologies”, США). Синтез гена проводился ООО “ДНК-синтез” (Россия). Синтезированная нуклеотидная последовательность была встроена в экспрессионный вектор pET21a (“Novagen”, Германия) по уникальным сайтам рестрикции BamHI и HindIII, в результате чего был получен плазмидный вектор pET-IFN-γ.

Получение биомассы клеток, содержащих целевой белок. Рекомбинантный штамм E. coli BL 21/pЕТ-IFN-γ получали трансформацией компетентных клеток E. coli BL 21 (“Novagen”) рекомбинантной плазмидной ДНК pЕТ-IFN-γ при помощи метода электропорации. Дальнейшее выращивание рекомбинантных клонов проводили на LB-агаре с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°C в течение 18–20 ч. Колонии, содержащие рекомбинантную плазмиду, смывали с агара LB-бульоном, добавляли глицерин до конечной концентрации 15%. Полученную суспензию разливали в криопробирки по 100 мкл и хранили при температуре –70°С.

Посевной материал рекомбинантного штамма получали засевом суспензии штамма-продуцента в колбы Эрленмейера, содержащие среду LB с ампициллином в концентрации 100 мкг/мл, и дальнейшим инкубированием на термостатируемой качалке при температуре 37°С в течение 18–20 ч.

Посевной материал использовали также и для засева ферментера в количестве 1–2% от объема питательной среды. Культивирование осуществляли на среде LВ с ампициллином (100 мкг/мл) в биореакторе LiFlus SL-15L (“Biotron”, Южная Корея) объемом 15 л, с коэффициентом заполнения средой 0.7 при температуре 37.0 ± 1.0°С, скорости вращения мешалки 100 об./мин и скорости подачи стерильного воздуха 1 л/л · мин^‒1.

Для масштабирования процесса использовали полупромышленный ферментер LiFlus SP-100L (“Biotron”) объемом 100 л. В качестве индуктора синтеза целевого белка в клетках E. coli BL21/pЕТ-IFN-γ использовали изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (IPTG) (“Anatrace Products”, США). Культивирование заканчивали в конце логарифмической – начале стационарной фазы роста при достижении оптической плотности OD₅₅₀ 3.7–4.3. Биомассу отделяли центрифугированием на проточной центрифуге Z41 (“СЕРА”, Германия) при 15 000 g и скорости потока 60 л/ч. Влажную биомассу взвешивали и определяли в ней содержание целевого белка в %.

Содержание рекомбинантного белка. Содержание белка в биомассе определяли методом электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях с окрашиванием Кумасси G-250 (“Sigma”, США) и последующим денситометрическим сканированием окрашенных гелей. Относительное содержание белка определяли с использованием системы визуализации GelDoc Go с ПО Image Lab (“Bio-Rad Laboratories”, США).

Выделение и очистка ИНФ-γ. Образец биомассы (10 г влажных клеток) суспендировали в 100 мл буферного раствора, содержащего 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (ингибитор протеиназ), 20 мМ трис-HCl, рН 8.0, и разрушали ультразвуком с последующим центрифугированием. Для первичной очистки и осветления супернатанта, содержащего ИФН-γ в растворимой форме, применяли жидкий сорбент Аммофлок-25 (“Физлабприбор”, Россия).

Очистку целевого белка вели каскадной хроматографией на ион-обменных сорбентах Q-сефароза и SP-сефароза, уравновешенных 20 мМ трис-HCl буфером, рН 8.0. Колонку с Q-сефарозой, на которую целевой белок не сорбировался, отсоединяли после промывки раствором 20 мМ трис-HCl, рН 8.0. Элюцию ИФН-γ с колонки с SP-сефарозой проводили линейным градиентом 0–1.0 М NaCl в 20 мМ трис-HCl, рН 8.0.

Анализ содержания целевого белка. Белковый состав образцов анализировали методом электрофореза в 15%-ном ПААГ в денатурирующих условиях с окрашиванием красителем Кумасси G-250 (“Sigma”, США), анализ гелей проводили методом, описанным выше.

Определение специфической активности. Специфическую (противовирусную) активность определяли микрометодом в 96-луночных планшетах с плоским дном, по подавлению цитопатического действия (ЦПД) тест-вируса энцефаломиокардита (ЕМС), штамм “Колумбия” в дозе 100 ЦПД₅₀ (трехкратное разведение) в культуре клеток человека линии Л-68 (диплоидные клетки (фибропласты) из здоровой ткани легкого) как описано в работе [8]. В качестве контрольного препарата использовали препарат Ингарон (интерферон гамма человеческий рекомбинантный, лиофилизат), 100 000 МЕ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Человеческий ИФН-γ является примером рекомбинантного белка, легко синтезируемого в клетках E. coli, но склонного к агрегации. Использование векторов, обеспечивающих конститутивную экспрессию, обычно позволяет добиться накопления целевого белка до 30% от суммарного белка бактериальных клеток, однако больше двух третей этого белка содержится в тельцах включения, частично или полностью денатурированы и поэтому лишены биологической активности [7]. В работе для конструирования штамма E. coli BL21/pЕТ-IFN-γ был выбран вариант индуцибельной экспрессии. Последовательность целевого гена клонировали в составе вектора pET21 (рис. 1), обеспечивающего в сочетании со штаммом E. coli BL 21 строгий контроль синтеза РНК. Дерепрессия промотора осуществлялась добавлением в состав питательной среды IPTG.

Рис. 1.

Генетическая карта плазмидного вектора pET-INF-γ : T7 promoter – промотор гена белка 10 фага Т7; T7 tag – лидерная последовательность гена 10 бактериофага Т7; INF-γ – последовательность, кодирующая зрелый интерферон-гамма; T7 terminator – терминатор бактериофага Т7.

Выбор условий культивирования штамма-продуцента. Общие закономерности культивирования рекомбинантных микроорганизмов, в которых целевой ген находится под контролем индуцибельного промотора, подробно описаны [9], что не исключает необходимость подбора оптимальных параметров роста и синтеза целевого продукта для каждого рекомбинантного штамма. При выборе условий культивирования штамма E. coli BL 21/pЕТ-IFN-γ в качестве контролируемых параметров использовали: время подачи индуктора, концентрацию индуктора, температуру и продолжительность инкубации с индуктором.

В экспериментах по выбору времени подачи индуктора было отмечено, что внесение IPTG в концентрации 0.1 мМ в логарифмической фазе роста культуры в диапазоне оптической плотности OD₅₅₀ культуральной жидкости (КЖ) от 1.0 до 1.6 с последующей инкубацией при 37°С в течение 5-6 ч приводило к стабильно высокому уровню синтеза целевого белка, экспрессируемого в тельцах включения. По данным денситометрического анализа электрофореграмм клеток, содержание целевого белка с молекулярной массой 18.0 ± ± 0.5 кДа, соответствующего массе ИФН-γ, составляло от 46 до 48% от содержания общего клеточного белка. Удельный выход биомассы был равен 3.6–3.7 г/л. Дальнейшее увеличение времени культивирования не приводило к повышению содержания целевого белка в биомассе.

Для определения минимального количества IPTG, достаточного для полноценной индукции синтеза целевого белка, индуктор вносили в инкубационную среду в концентрациях 0.1, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02 и 0.01 мМ.

Температуру культивирования поддерживали на уровне 37°С. Результаты белкового электрофореза показали, что IPTG в концентрации 0.01 мМ индуцирует синтез ИФН-γ в количестве 30–32% от суммарного клеточного белка. Максимальное содержание целевого белка в клетках (46–49%) достигалось через 5–6 ч инкубации при концентрации IPTG 0.04–0.05 мМ, что сопоставимо с результатами, полученными при внесении индуктора в концентрации 0.1 мМ.

Известно, что повышение выхода растворимого белка может быть достигнуто в результате индукции белкового синтеза при пониженной температуре [9]. Для подтверждения этого было проведено культивирование в ферментере LiFlus SP-100L (“Biotron”) рекомбинантного штамма E. coli BL 21/pЕТ-IFN-γ после внесения индуктора при температурах 37, 25 и 20°С.

Локализацию белка ИФН-γ в клетках бактерий определяли электрофоретически после дезинтеграции клеток биомассы, центрифугирования и анализа содержания целевого белка в осадке и супернатанте. На рис. 2 приведены электрофореграммы белковых фракций осадков и супернатантов образцов биомасс, полученных при инкубации при разных температурных режимах.

Рис. 2.

Электрофореграмма фракций клеточных белков бактерий E. coli BL 21/pЕТ-IFN-γ после дезинтеграции и центрифугирования: 1, 3, 5 – белки супернатанта после инкубации с IPTG при температуре 37, 25, 20°С соответственно; 2, 4, 6 – осадки клеточных белков после инкубации с IPTG при температуре 37, 25 и 20°С; М – маркер молекулярной массы белков (17–250 кДа). Пробы для электрофореза получали путем осаждения одинакового количества клеток, стандартизованных по оптической плотности.

Из результатов, представленных на рис. 2, следует, что при культивировании штамма-продуцента при 37°С и внесения индуктора в течение 5–6 ч более 90% синтезируемого ИФН-γ содержалось в осадке телец включения (дорожка 2). При снижении температуры культивирования до 25°С после подачи индуктора содержание целевого белка в клетках через 8–9 ч от начала культивирования достигало 32–37%. При этом белок накапливался в равной степени как в растворимой форме (в цитоплазме и периплазме) (дорожка 3), так и в тельцах включения (дорожка 4). Дальнейшее понижение температуры культивирования до 20°С с индукцией приводило к замедлению роста и снижению содержания целевого белка до 20–25%, при этом белок преимущественно (до 70%) накапливался в тельцах включения (дорожка 6). Поскольку результат оказался неудовлетворительным, указанную температуру в дальнейшем не использовали.

Выход биомассы и целевого белка, его содержание и локализации в клетках, полученные для ферментера LiFlus SL-15L объемом 15 л, полностью воспроизводились в условиях масштабирования в ферментере LiFlus SP-100L объемом 100 л.

Таким образом, подобраны условия культивирования нового штамма-продуцента ИФН-γ E. coli BL 21/pЕТ-IFN-γ для двух типов биореакторов со следующими характеристиками и условиями выращивания: коэффициент заполнения средой 0.7–0.8; подача воздуха 1.0 л л^‒1 ∙ мин^‒1; скорость вращения мешалки 100 об./мин, температура (37.0 ± 1.0)°С; внесение индуктора (IPTG) в конечной концентрации 0.04–0.05 ммоль/л при оптической плотности КЖ ОD₅₅₀ 1.0–1.6; продолжительность культивирования после индукции в течение 5–6 ч. Удельный выход биомассы составлял 3.5–3.6 г/л КЖ. Содержание целевого белка – 46–48% от суммарных клеточных белков, при этом белок синтезировался, в основном, в тельцах включения (более 90%).

Снижение температуры культивирования штамма после внесения IPTG до 25°С и дальнейшая инкубация в течение 8–9 ч приводили к тому, что экспрессия целевого белка достигала уровня 32–33% в ферментере объемом 15 л и 33–37% – в 100 л ферментере. Накопление белка происходило в равной степени в тельцах включения и периплазме. Выход биомассы составлял 4.6–4.7 г/л КЖ при культивировании в 15-литровом ферментере и 4.6–5.0 г/л – 100-литровом.

Выделение и очистка ИФН-γ. Для того, чтобы оценить эффективность выделения рекомбинантного ИФН-γ, синтезируемого в растворимой форме (~50%), была использована биомасса, содержащая целевой белок в периплазме, полученная в ферментере LiFlus SP-100L при снижении температуры до 25°С после подачи индуктора. Суспензию клеток в буфере для разрушения помещали в ледяную баню и разрушали ультразвуком (22 кГц) до снижения OD₅₅₀ на 45–50% от исходного значения. Затем суспензию центрифугировали при 12000g в течение 45 мин и при 4°С.

Для грубой очистки и осветления раствора после центрифугирования в супернатант, содержащий целевой белок, добавляли жидкий сорбент Аммофлок-25 в количестве 10% от объема раствора белка. Полученный раствор инкубировали 12 ч при 2–8°С и центрифугировали при 12 000 g 30 мин и 4°С.

Очистку целевого белка проводили методом каскадной хроматографии на ионообменных сорбентах Q-сефароза и SP-сефароза. Колонки с ион-обменными сорбентами Q-сефароза (20 мл) и SP-сефароза (20 мл) уравновешивали 20 мМ трис-HCl буфером, рН 8.0, наносили раствор белка, после чего колонки промывали тем же буфером. Колонку с Q-сефарозой, на которой целевой белок не сорбировался, отсоединяли. Белок элюировали с колонки с SP-сефарозой линейным градиентом 0–1 М NaCl в 20 мМ трис-HCl буфере, рН 8.0. Фракции целевого белка с оптической плотностью от 0.25 о.е. анализировали методом электрофореза в 15%-ном ПААГ в денатурирующих условиях (рис. 3). Из представленных данных видно, что чистота полученного белка превышала 95%. Фракции, содержащие ИФН-γ, объединяли и диализовали против буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl, рН 8.0, и 50 мМ NaCl. Выход целевого белка составил 50 ± 5 мг из 10 г биомассы (5 мг из 1 г влажных клеток). Данные приведены в табл. 1. Как известно из литературных данных, выход целевого белка из биомассы E. coli, содержащей ИФН-γ в тельцах включения, колебался в диапазоне от 2.5 до 5.0 мг из 1 г биомассы [1, 10]. Следовательно, количество высокоочищенного белка, полученного только из растворимой фракции в нашем исследовании, соответствовало максимальному выходу белка из штамма, продуцирующего ИФН-γ в тельцах включения. Можно предположить, что дальнейшее совершенствование условий культивирования позволит увеличить продукцию ИФН-γ в растворимой форме и как следствие, повысить выход целевого белка, как минимум в 2 раза.

Рис. 3.

Электрофореграмма белковых фракций, полученных в процессе очистки ИФН-γ: М – маркер молекулярной массы белков (17–250 кДа), 1 – лизат биомассы; 2 – осадок при осветлении; 3 – раствор белка после осветления аммофлоком-25; 4 – конечный препарат (белок ИФН-γ).

Определение специфической противовирусной активности. Анализ специфической активности белка в культуре клеток Л-68 показал, что активность полученного препарата ИФН-γ в 1.7 раза превышала показатель контрольного препарата Ингарон (1.77 × 10⁵ против 1 × 10⁵ МЕ).

Сконструирован рекомбинантный индуцибельный штамм E. coli BL 21/pЕТ-IFN-γ – продуцент интерферона гамма человека, обеспечивающий высокий уровень экспрессии целевого белка. В результате оптимизации параметров культивирования штамма максимальное накопление целевого белка в количестве 32–37% от общего количества клеточных белков достигалось при индукции 0.04–0.05 мМ IPTG в середине логарифмической фазы и последующем культивировании при 25°С в течение 8–9 ч. При этом накопление белка происходило в равной степени в тельцах включения и в растворимой форме.

Разработан способ выделения и очистки интерферона гамма, содержащегося в клетках в растворимой форме. Способ очистки включал дезинтеграцию клеток ультразвуком, предочистку жидким сорбентом, очистку каскадной ионообменной хроматографией с последующим диализом. Показано, что разработанный способ позволял получить из 1 г влажной биомассы до 5 мг препарата с чистотой более 95% и высокой специфической (противовирусной) активностью.

Таким образом, удалось разработать систему, позволяющую получать белок в растворимой форме, что облегчает его выделение и очистку, поскольку процедура не содержит таких стадий, как денатурация и ренатурация, на которых происходят основные количественные потери белка и потери его биологической активности.

Работа выполнена в рамках государственного задания, Тема ГЗ-39/21 “Отработка технологии препаративной наработки и очистки рекомбинантных белков”.

Коллектив авторов выражает благодарность сотрудникам ОБТК ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор” Роспотребнадзора: С.В. Усовой, Е.Ф. Перышкиной, Е.С. Башкиной ‒ за проведение экспериментов по определению специфической (противовирусной) активности препарата ИФН-γ.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследования.