Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 2, стр. 200-207

МЕТОДИКА

Объектами исследования служили 3-суточные проростки гороха (Pisum sativum) сорта Рондо и суперклубенькового (Nod3) и бесклубенькового (К14) мутантов этого сорта, а также планктонные культуры Rhizobium leguminosarum bv. vicieae, эффективный по азотфиксации штамм RCAM 1022, полученный из Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Всероссийского научно-исследовательского института сельского хозяйства (ВНИИСХМ); Pseudomonas syringae pv. pisi (штамм 1845), полученный из Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии.

Культивирование бактерий. Бактериальные культуры выращивали в колбах на жидкой среде, содержащей просветленный гороховый отвар, 15 г/л глюкозы, рН 7.0. Титр планктонной культуры бактерий определяли на планшетном спектрофотометре “АИФР-01 Униплан” (“ЗАО Пикон”, Россия) при длине волны 655 нм.

Проращивание семян гороха. Семена гороха последовательно стерилизовали и промывали 5 мин в 94%-ном этаноле, 5 мин в 5%-ном растворе перманганата калия и 5 мин в 3%-ном пероксиде водорода. На конечном этапе отмывали стерильной водой и замачивали при 60°С на 4 ч. Семена проращивали в стерильных чашках Петри на увлажненной фильтровальной бумаге в течение 3 сут в темноте при 23–25°С. Проростки промывали стерильным 0.01%-ным раствором нонидета (неионный детергент) для удаления экзогенной микрофлоры. Отмывали трижды стерильной дистиллированной водой и инокулировали одним из видов бактерий, находящихся на стационарной фазе роста.

Титр планктонной культуры бактерий составлял 0.1 × 10⁸. Инокуляцию проводили в течение 5 или 360 мин, после чего корни проростков отделяли от горошины, промывали в стерильном 0.01%-ном растворе нонидета для удаления слабосвязанных бактерий, а затем промывали трижды в стерильной воде.

Особенностью бобовых является то, что не весь корень проростков обладает восприимчивостью к ризобиям, а только его отдельные участки, отличающиеся по степени сформированности корневых волосков, то есть присутствию на них зачатков, молодых или зрелых корневых волосков. В настоящей работе на основании литературных данных [7] и собственных исследований с помощью световой микроскопии первичный корень длиной 35–40 мм делили на пять участков, отличающихся по степени сформированности волосков: I – апикальная меристема (2 мм от кончика); II – зона без корневых волосков (2–7 мм); III – зона, содержащая зачатки корневых волосков (7–12 мм); IV – зона молодых корневых волосков (12–17 мм); V – зона сформированных корневых волосков (17–22 мм от кончика корня), и отдельно эпикотиль – VI зона [8].

Определение интенсивности адгезии бактерий. После инкубации с бактериями корни проростков нарезали на отрезки в соответствии с указанными зонами и каждый образец растирали в стерильной воде, после чего делали рассеянный посев на чашки Петри с агаризованной питательной средой, аналогичной по составу жидкой среде для культивирования каждого вида бактерий. Через 3 сут подсчитывали колониеобразующие единицы (КОЕ), отражающие количество бактерий, адгезирующихся в каждой зоне корня. В экспериментах использовали по 10 проростков.

Определение концентраций Н₂О₂ и цАМФ. Уровень эндогенного Н₂О₂ определял FOX-методом, основанным на изменении окраски ксиленолового оранжевого [9]. Концентрацию цАМФ в отрезках корня гороха определяли методом ИФА [8]. Концентрации эндогенных Н₂О₂ и цАМФ выражали в мкмоль/мг белка или нмоль/мг соответственно. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда, для построения калибровочного графика использовали БСА. Все эксперименты проводили в 3-кратных биологических повторностях, определение уровня цАМФ и Н₂О₂ – в 8-кратных аналитических повторностях. На графиках результаты представлены в процентах к контролю, которым служили неинфицированные растения.

Результаты экспериментов обработаны статистически с помощью программы SigmaPlot 12.3. На графиках представлены средние значения и ошибки среднего (SE). Достоверность различий между группами значений вычисляли по критерию Дункана при Р ≤ 0.05. Достоверность различий определялась между значениями для сорта Рондо и каждого из мутантов. Достоверно различающиеся значения на графиках отмечены звездочками.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Взаимодействие растений с любыми типами микроорганизмов начинается с адгезии [10]. Эксперименты показали, что как через 5 мин, так и через 360 мин наиболее интенсивная адгезия бактерий происходила в зонах зрелых и старых корневых волосков, и была более высокой у ризобий RCAM 1022 (рис. 1). При этом самый высокий уровень адгезии бактерий этого вида сохранялся на корнях проростков мутантов Nod3 и К14, но не на корнях проростков исходного сорта Рондо. Интенсивность адгезии штамма 1845 также существенно различалась у проростков сорта и мутантов. Через 5 мин коинкубации адгезия этого вида бактерий на корнях проростков гороха сорта Рондо была незначительной, тогда как у проростков Nod3 превышала ее в 6–8 раз, а на корнях К14 была – в 2–3 раза. Через 360 мин адгезия на всех участках корня проростков Рондо уже отсутствовала полностью, тогда как на корнях Nod3 еще усилилась, а у К14 осталась примерно на уровне, зафиксированном через 5 мин коинкубации (рис. 1).

Рис. 1.

Интенсивность адгезии Rhizobium leguminosarum bv. Viceae (1) и Pseudomonas syringae pv. pisi (2) на корнях проростков гороха (зоны I–V) сорта Рондо (а, б) и его мутантов – Nod3(в, г) и К14 (д, е) через 5 (а, в, д) и 360 (б, г, е)мин после инокуляции. *Различия статистически значимы при сравнении сорта Рондо (контроль) с мутантами Nod3 или К14 по критерию Дункана, n = 3, m ± S.E.; Р ≤ 0.05.

Тесный контакт с бактериями вызывает в растениях активацию сигнальных систем [11].

Следует отметить, что исходные концентрации эндогенных пероксида водорода и цАМФ в корнях и эпикотиле проростков гороха значительно различались у сорта Рондо и его мутантов, Nod3 и К14 (табл. 1, 2). Причем, если концентрация эндогенного пероксида водорода в органах проростков Nod3 превышала уровень в проростках Рондо в 3–5 раз, то в проростках К14 всего в 2.0–2.5 раза (табл. 1). В тоже время уровень эндогенного цАМФ как в проростках Nod3, так и К14 превышал аналогичный параметр в проростках Рондо в 20–25 раз (табл. 2).

Коинкубация проростков с обоими видами бактерий приводила к изменению концентраций эндогенных пероксида водорода и цАМФ. У проростков Рондо через 5 мин взаимодействия с ризобиями в наибольшей степени уровень пероксида водорода возрастал в зонах II и III, снижаясь при этом немного ниже контроля в эпикотиле (рис. 2). Под воздействием штамма 1845 концентрация этой сигнальной молекулы увеличивалась по сравнению с контролем почти в одинаковой степени во всех зонах корня, но в меньшей степени, чем при воздействии штамма RCAM 1022.

Рис. 2.

Влияние инфицирования Rhizobium leguminosarum bv. vicea (1) или Pseudomonas syringae pv. pisi (2) на концентрацию эндогенного пероксида водорода в участках корня (I–V, Э-эпикотиль) проростков гороха сорта Рондо (а, б) и его мутантов Nod3(в, г) и К14 (д, е) через 5 (а, в, д) и 360 (б, г, е) мин после инокуляции. * Различия статистически значимы при сравнении Рондо (контроль) с мутантами Nod3 или К14 по критерию Дункана, n = 3, m ± S.E.; Р ≤ 0.05. ** Контроль – значения Н₂О₂ из проростков, инкубированных на воде.

Через 360 мин коинкубации с RCAM 1022 уровень пероксида водорода опускался ниже контроля в зонах зачатков и молодых корневых волосков (зоны II и III), оставаясь почти на уровне 100% в остальных участках корня и эпикотиле. Под воздействием штамма 1845 концентрация Н₂О₂ сохранялась на уровне 120% во всех участках корня и эпикотиле. У проростков гороха Nod3 через 5 и 360 мин коинкубации с обоими видами бактерий происходило достоверное снижение уровня Н₂О₂ от 50 до 70% от контроля во всех зонах, тогда как в эпикотиле этот показатель был близок к 100% (рис. 2). В корнях проростков К14 через 5 мин инфицирования теми же видами бактерий уровень Н₂О₂ достоверно снижался, но в меньшей степени, оставаясь на уровне 100% в некоторых зонах (IV и V) и эпикотиле (рис. 2). Через 360 мин под влиянием штамма RCAM 1022 уровень Н₂О₂ оставался близким к контролю во всех участках корня и эпикотиле, тогда как штамм 1845 индуцировал достоверное повышение этого показателя во всех зонах корня и эпикотиле (рис. 2).

Инфицирование оказывало также влияние на изменение эндогенной концентрации цАМФ в корнях проростков гороха. Инокуляция ризобиями корня проростков гороха Рондо в течение 5 мин вызывала последовательное незначительное повышение уровня цАМФ в I–V зонах, при этом в эпикотиле этот показатель оставался на уровне контроля. Под воздействием штамма 1845 концентрация цАМФ менялась аналогичным образом (рис. 3). Через 360 мин инфицирование штаммом RCAM 1022 вызывало наиболее значительное повышение уровня цАМФ в зонах зачатков и молодых корневых волосков (II-III зоны), при том, что в IV и V зонах и эпикотиле его концентрация оставалась на уровне контроля.

Рис. 3.

Влияние инфицирования Rhizobium leguminosarum bv. vicea (1) или Pseudomonas syringae pv. pisi (2) на концентрацию эндогенного цАМФ в участках корня (I–V, Э-эпикотиль) проростков гороха сорта Рондо (а, б) и его мутантов Nod3(в, г) и К14 (д, е) через 5 (а, в, д) и 360 (б, г, е) мин после инокуляции. * Различия статистически значимы при сравнении варианта “Рондо” в качестве контроля с вариантом “Nod3” или вариантом “К14” по критерию Дункана, n = 3, m ± S.E.; Р ≤ 0.05. ** При расчете эндогенных концентраций цАМФ контролем служила концентрация эндогенного цАМФ из проростков, инкубированных на воде.

Штамм 1845 также индуцировал повышение уровня этой сигнальной молекулы, но менее интенсивное, чем штамм RCAM 1022 и почти одинаковое во всех участках корня и эпикотиле (рис. 3). Инфицирование штаммом RCAM 1022 корня проростков Nod3 в течение 5 мин почти не повлияло на исходный уровень концентрации цАМФ. Через 360 мин этот показатель оставался практически на уровне контроля во всех участках корня. Однако штамм 1845 через 5 мин приводил к достоверному снижению уровня цАМФ во всех участках корня, в тоже время через 360 мин уровень цАМФ приближался к контролю. Инфицирование обоими видами бактерий корней проростков мутанта К14 в течение 5 мин практически не влияло на изменение уровня цАМФ в участках корня. Однако через 360 мин под воздействием штамма RCAM 1022 его значение возрастало практически в 2 раза почти во всех участках корня (рис. 3). Напротив, коинкубация со штаммом 1845 приводила к достоверному снижению уровня цАМФ в тех же участках корня.

В природе микроорганизмы способны к адгезии и созданию биопленок на любых поверхностях. По современным представлениям адгезия ризобий на корнях бобовых носит неспецифический характер и не зависит от их симбиотических свойств [12]. С этим трудно согласиться, поскольку ранее нами было показано, что штаммы ризобий, не эффективные по азотфиксации, но высококонкурентные, демонстрировали существенно более низкую адгезию на корнях проростков сорта Рондо [13]. Вероятно адгезия на ранней стадии инфицирования носит неспецифический характер, но переходит в специфическую стадию на этапе узнавания партнеров. В процессе адгезии со стороны бактерий могут принимать участие экзополисахариды, фимбрии IV и V типов, различные адгезины и флагеллины [14]. Такие детерминанты, необходимые на начальном этапе адгезии, представляют собой факторы вирулентности, и присутствуют практически у всех видов грамотрицательных бактерий, независимо от специализации [15, 16]. По-видимому, усиление адгезии ризобий через 360 мин коинкубации свидетельствует о переходе к специфической, необратимой стадии этого процесса, в которой принимают участие как некоторые структуры и метаболиты растений, так и экзометаболиты бактерий. Считается, что одними из основополагающих компонентов, определяющих специфичность азотфиксирующего симбиоза, являются Nod-факторы, представляющие собой липохитоолигосахариды, не только видо-, но и штаммоспецифичные [17]. В тоже время в этом процессе активное участие принимают лектины растений. Показано, что ген лектина гороха, внедренного в белый клевер, обеспечивал хорошую адгезию Rhyzobium leguminosarum на его корнях, хотя этот вид микросимбионтов в природе никогда не инфицирует клевер [18]. Кроме того, сверхэкспрессия лектиновой части лектиноподобной рецепторной протеинкиназы бобовых может приводить к суперклубеньковому фенотипу [19]. Несмотря на то, что в работе не проводились соответствующие исследования, опираясь на литературные данные [18, 19], можно предположить, что разница в интенсивности адгезии ризобий на корнях проростков гороха сорта Рондо и мутантов Nod3 и К14 в определенной степени связана с качественным составом выделяемых ими лектинов. Подтверждением этому может служить и то, что интенсивность адгезии штамма 1845 была близкой у обоих мутантов, а у проростков Рондо отсутствовала полностью через 360 мин, что свидетельствует о неспецифичности этого процесса для данного вида бактерий.

Тесный контакт корней проростков гороха с бактериями сопровождался существенными перестройками в сигналинге клеток растения. Несмотря на то, что генерация АФК в растениях индуцируется как симбиотическими азотфиксаторами, так и патогенами [20, 21], назначение, а также продолжительность подъема и амплитуда концентраций этих сигнальных молекул различны при воздействии различных видов микроорганизмов [22]. По литературным данным, на начальных этапах взаимодействий гороха с мутуалистическими бактериями наблюдался единичный пик генерации АФК, в том числе Н₂О₂, более сильный и продолжительный, чем при инфицировании патогенами [23]. Такой эффект наблюдался в экспериментах на проростках сорта Рондо при инокуляции штаммами RCAM 1022 или 1845 в течение 5 мин. По литературным данным на ранних этапах взаимодействия ризобии проявляют свойства патогенов, подавляя растительный иммунитет с помощью своих факторов вирулентности [23]. При бактериальных патогенезах пероксид водорода в растениях выполняет защитные функции и нарастание его концентрации происходит в две фазы, разделенные во времени [24]. Интересно, что у обоих мутантов изменение уровня пероксида водорода по зонам корня после кратковременного воздействия как ризобий, так и патогена было практически одинаковым и принципиально отличалось от такового в проростках сорта Рондо. Таким образом, уже на самых ранних этапах взаимодействия как с мутуалистами, так и с патогенами очевидны перестройки в сигнальных системах мутантов гороха. Эти отличия более ярко проявлялись через 360 мин взаимодействия, когда этот процесс переходил в специфическую стадию, сопровождающуюся взаимным узнаванием партнеров. По литературным данным понижение уровня пероксида водорода в зонах адгезии и проникновения ризобий (зоны зачатков и молодых корневых волосков, II–III зоны) должно способствовать повышенной колонизации и вторжению ризобий в эти участки корня [25], что и происходит в проростках гороха сорта Рондо. В этом случае пероксид водорода, наряду с сигнальной ролью, выполняет функции антибактериального агента, распределяя инфекционную нагрузку по зонам корня. Штамм 1845, несмотря на отсутствие адгезии к 360 мин на корнях проростков сорта Рондо, был способен индуцировать незначительную окислительную вспышку за счет секретируемых токсинов, в частности, сирингомицина. Этот экзометаболит способен влиять на работу кальциевых ионных каналов в мембране растительных клеток [26], что может привести к модуляции работы про- и антиоксидантных ферментов, тем самым влияя на уровень эндогенного пероксида водорода в тканях проростков гороха.

Однако у мутантов Nod3 и К14 динамика концентрации эндогенного Н₂О₂ в зонах корня принципиально отличается не только от Рондо, но и между собой. Можно предположить, что существенное снижение уровня Н₂О₂ во всех зонах корня проростков мутанта Nod3 через 360 мин коинкубации со штаммом RCAM 1022 является одной из причин суперклубенькового фенотипа. Однако такое же понижение уровня Н₂О₂ под воздействием штамма 1845, вероятно, указывает на снижение локального неспецифического иммунитета в тканях корня. Это подтверждается уровнем данной сигнальной молекулы в эпикотиле, где он был близок к контролю. Это свидетельствует об отсутствии системной активации неспецифических защитных реакций в проростках мутанта Nod3. Напротив, у мутанта К14 под воздействием ризобий концентрация Н₂О₂ на всем протяжении эксперимента сохранялась практически на уровне контроля, что также не типично для бобово-ризобиального симбиоза [20]. В тоже время под воздействием штамма 1845 наблюдалось существенное возрастание концентрации Н₂О₂, которое затрагивало все зоны корня и эпикотиль. Учитывая, что интенсивность адгезии этого патогена по зонам корня не одинакова, можно предположить, что при этом развивается системная реакция, причиной которой могут быть PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Pattern), включающие флагеллярные и другие структурные белки патогена, а также его токсины (сиринготоксин, коронатин, сиринголин и др.), секретируемые в среду инкубации [27] и достигающие необходимой концентрации только к 360 мин.

Динамика концентрации цАМФ при инфицировании корней проростков гороха сорта Рондо и обоих мутантов принципиально отличалась от динамики эндогенного пероксида водорода (рис. 2, 3). Опираясь на литературные данные [28] и, сравнивая динамику данного вторичного мессенджера в проростках Рондо и мутантов, можно предположить, что эндогенный цАМФ участвует в регуляции эффективности симбиоза на начальных этапах взаимодействия. На этапе кратковременного взаимодействия (5 мин), вероятно это обусловлено PAMPs, характерными для обоих видов бактерий [15, 16]. Для распознавания PAMPs растения используют различные рецепторные молекулы, в том числе лектины, выполняющие функции рецепторов, а также комплексы рецепторных киназ на клеточной поверхности. Это усиливает защитную реакцию хозяина, хотя эффект, по-видимому, ослабляется при мутуалистическом симбиозе, поскольку Nod-факторы способны подавлять защитные ответы посредством прямого или косвенного взаимодействия с киназой рецептора лектина (LecRK) [12].

Обращает на себя внимание очень высокий уровень цАМФ в зонах зачатков и молодых корневых волосков проростков сорта Рондо через 360 мин после инокуляции штаммом RCAM 1022, и, напротив, отсутствие реакции аденилатциклазной сигнальной системы в зонах роста корня мутанта Nod3. По литературным данным у суперклубенькового мутанта бобов уровень цАМФ в корнях при инфицировании Bradyrhizobium japonicum оставался на уровне контроля в течение нескольких дней, в то время как искусственное повышение его концентрации негативно сказывалось на образовании клубеньков [28]. Учитывая, что у бесклубенькового мутанта этот показатель лишь на 40–60% превышал контроль, можно сделать предположение, что при интерпретации результатов следует учитывать интенсивность изменения уровня цАМФ и стадию инфекционного процесса. На этапе 360 мин происходит переход адгезии в специфическую стадию и начинается проникновение ризобий, сопровождающееся индукцией sym-генов растений [18]. Известно, что активация тех или иных генов зависит от концентрации вторичных мессенджеров, передающих сигналы на специфические факторы транскрипции [29]. Кроме того, ранее было показано, что при значительном повышении эндогенного уровня цАМФ существенно снижается концентрация эндогенного пероксида водорода в корнях проростков гороха сорта Рондо [5]. Такая обратная зависимость, хорошо прослеживаемая на корнях проростков сортового гороха, имеет не очень четко выраженный характер в корнях проростков его мутантов, что, возможно, является одной из причин супер- или безклубеньковости. Это представляется вполне возможным, поскольку признак супернодуляции находится под контролем корня [30], и наиболее выраженные изменения в концентрациях цАМФ также наблюдаются в этом органе.

Если при ризобиальной инфекции изменение уровня эндогенного цАМФ в корне проростков гороха направлено на формирование мутуалистических отношений, то под воздействием патогена может быть показателем устойчивости к Pseudomonas syringae pv. pisi. Литературные данные свидетельствуют о том, что изменение уровня цАМФ в растениях при инфицировании специфическими патогенами указывает на степень их устойчивости [31]. Можно предположить, что горох сорта Рондо наиболее устойчив к Pseudomonas syringae pv. pisi, поскольку уровень цАМФ во всех участках корня и эпикотиле существенно превышал показания в контроле, в отличие от мутантов.

Таким образом, мутации, направленные на регуляцию количества клубеньков у Nod3 и К14, оказывали влияние как на внутриклеточный сигналинг, существенно увеличивая концентрации эндогенных Н₂О₂ и цАМФ, так и на иммунный ответ растений при взаимодействии с патогенами. У проростков этих мутантов гороха менялась интенсивность адгезии ризобий и фитопатогенных бактерий, а модуляция уровней эндогенных пероксида водорода и цАМФ скорее всего свидетельствовала об изменении устойчивости этих растений к специфическому патогену Pseudomonas syringae pv. pisi. Возможно, что данный феномен в дальнейшем можно использовать для диагностики устойчивости вновь создаваемых мутантов и сортов гороха к возбудителю бактериального ожога, Pseudomonas syringae pv. pisi.