1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 59, № 2, 2023

Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 2, стр. 191-199

Обесцвечивание красителей в биоэлектрохимической системе при иммобилизации клеток Shewanella oneidensis MR-1 на поверхности анода и электрической стимуляции внешней цепи

А. А. Самков 1, *, Ю. А. Чугунова 1, 2, М. Н. Круглова 1, Е. В. Моисеева 1, Н. Н. Волченко 1, А. А. Худокормов 1, С. М. Самкова 1, Э. В. Карасева 1

1 Кубанский государственный университет
350040 Краснодар, Россия

2 Кубанский государственный медицинский университет
350063 Краснодар, Россия

* E-mail: andreysamkov@mail.ru

Поступила в редакцию 20.08.2022
После доработки 27.09.2022
Принята к публикации 07.11.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Обнаружено влияние полярности электрической стимуляции внешней цепи биоэлектрохимической системы, а также иммобилизации на аноде клеток Shewanella oneidensis MR-1, содержащих ген пероксидаз класса DyP, на скорость обесцвечивания красителей разных типов. Для красителя трифенилметанового кристаллического фиолетового максимальная скорость обесцвечивания суспендированными клетками S. oneidensis MR-1 составила 2.05 ± 0.07 мкМ/ч и наблюдалась при подключении источника постоянного напряжения 1.2 В прямой полярности. Минимальные скорости наблюдались в случае обратной полярности подключения. При иммобилизации клеток на аноде удельная скорость обесцвечивания была выше, достигая 2.91 ± 0.09 мкМ/ч и не снижалась при повышении концентрации субстрата. Наименьшие показатели также были отмечены для обратного подключения источника напряжения. При обесцвечивании азокрасителя конго красного, максимальные значения скорости отмечены для источника с прямым подключением ионистора и при разомкнутой цепи (0.26 ± 0.01 и 0.29 ± ± 0.02 мкМ/ч соответственно), минимальное значение 0.11 ± 0.02 мкМ/ч наблюдали для обратного подключения. Для продуктов биоэлектрокаталитического обесцвечивания кристаллического фиолетового обнаружено значительное снижение интенсивности главного пика поглощения, соответствующего полосе 590 нм, практически без гипсохромного сдвига. О качественных изменениях состава продуктов обесцвечивания говорит появление нового максимума поглощения в районе 360 нм для варианта с прямой полярностью подключения ионистора. Результаты могут представлять интерес для разработки новых методов биоэлектрохимической очистки.

Ключевые слова: биоэлектрохимическая система, Shewanella oneidensis MR-1, кристаллический фиолетовый, конго красный, биоэлектрокатализ, обесцвечивание, анод, микробный топливный элемент

Воздействие различных биоэлектрохимических процессов на функционирование биологических систем привлекает в настоящее время все более пристальное внимание исследователей. Расширение поля задач в этой области связано со многими нерешенными вопросами, возникшими при анализе работы микробных топливных элементов, исходно созданных в качестве альтернативного источника энергии. Данные устройства обнаруживали возможность использования для нужд экологической биотехнологии и разработки биосенсоров [1–4]. Получены многочисленные экспериментальные подтверждения изменения интенсивности биологической деградации различных веществ, в анаэробных условиях анодной зоны микробных топливных элементов [5, 6].

Известно, что происходящая в естественных условиях природных сред и микробиоценозов поляризация поверхности электрода, даже будучи ограничена величиной порядка от сотен мВ (на практике) до теоретических 1.105 В [7], способна влиять на биохимические процессы на границе раздела фаз электрод-жидкость.

Существует значительный пул исследований влияния биоэлектрохимических условий на процессы, происходящие в условиях сложных микробиоценозов непостоянного систематического состава, меняющихся в зависимости от ряда факторов. При этом состав микробиоценоза может зависеть даже от освещенности анода. Так в работе Xиаоxуан Ванг с соавт. [8] было обнаружено, что освещение обуславливает замещение псевдомонадами доминировавших в условиях отсутствия освещения представителей рода Geobacter. При исследованиях, открывших возможность влияния внешней электрической стимуляции на метаногенез, также было отмечено изменение состава микробиоценоза под действием внешнего напряжения 1.2 вольта. В работе [9] обнаружили, что биоэлектрохимическое воздействие стимулировало бродильщиков и гидрогенотрофных метаногенов, увеличивая продукцию метана в 8.6 раза. Таким образом, переход к более простой экспериментальной модели, включающей одну чистую культуру, позволяет исключить фактор смены состава сообщества.

К настоящему моменту известны работы, доказавшие возможность стимуляции слабыми внешними напряжениями, порядка десятых вольта, биодеструкционной активности, а также соответствующего роста экспрессии генов ключевых ферментов, на примере биодеградации Pseudomonas sp. DGYH-12 фенантрена [10], но вопросы кинетики процессов и оценки влияния на нее параметров внешней цепи, в том числе искусственной стимуляции, остаются в значительной мере открытыми.

Таким образом, простая модель на основе чистой культуры S. oneidensis MR-1, часто используемой в биоэлектрохимических системах [11, 12], позволит проверить влияние различных вариантов внешней электрической стимуляции реакций в анаэробной зоне. Целью стимуляции являются изменения качественных или количественных характеристик окислительно-восстановительных реакций, осуществляемых ассоциированными с анодом бактериями, обесцвечивающими редокс-устойчивые красители. Известно, что за обесцвечивание красителей отвечают, в том числе, бактериальные ферменты класса пероксидаз [13]. Обнаружено, что многие представители рода Shewanella, в том числе S. oneidensis MR-1 [14] имеют выраженную способность обесцвечивать различные красители, благодаря развитой системе ферментов, в том числе азоредуктаз и, прежде всего, пероксидаз класса DyP или краситель-обесцвечивающих пероксидаз (dye decolorizing peroxidases), действие которых может быть оценено по убыли субстрата в реальном времени [15–17]. Рассматривая чистую культуру шеванеллы как биологический агент биоэлектрохимической системы, в которой происходит обесцвечивание красителя, необходимо отметить сохранение ключевой роли экзоэлектрогенных микроорганизмов, опосредующих взаимодействие электрода и внешней среды также и в открытых системах [18]. Таким образом, полученные данные могут быть экстраполированы на более сложные микробиоценозы, воздействие на которые через электроды биоэлектрохимических систем, конструктивно представляющих собой микробный топливный элемент (МТЭ) безмембранного типа, позволит влиять на биоремедационные процессы уже в открытой системе.

Цель работы ‒ экспериментально определить возможность влияния посредством внешней электрической стимуляции биоэлектрохимической системы слабыми напряжениями разной полярности на скорость обесцвечивания красителей культурой S. oneidensis MR-1 в анаэробных условиях анодной камеры МТЭ.

МЕТОДИКА

В работе использовали штамм бактерий S. oneidensis MR-1, полученный из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (№ в каталоге B‑9861). Штамм выделен в 1987 г. из ила озера Онейдо, филогения описана Ивановой с соавт. [19] в 2004, относится к γ-протеобактериям. Штамм широко используется в научно-исследовательской деятельности в качестве экзоэлектрогенного микроорганизма, активно осуществляющего электрогенез и другие биохимические процессы [20].

В качестве биоэлектрохимической системы использовали МТЭ мембранного воздушнокатодного типа с объемом анодной камеры 69 мл [21]. Материалом электродов послужил углеродный войлок НТМ-200М (АО “НИИЭИ”, Россия) толщиной 4 мм, анод имел размер 20 × 50 мм, катод представлял собой диск из аналогичного материала диаметром 18 мм, капиллярно смачиваемый дистиллированной водой и прилегающий к катионообменной мембране МФ-4СК (ОАО “Пластполимер”, Россия). Обратная сторона диска контактировала с воздухом. Анод и катод контактировали со внешней цепью через графитовые стержни, вставленные в войлок. Перед использованием мембраны МФ-4СК переводили в протонную форму по стандартной методике окислительно-термического кондиционирования перфторированных мембран [22].

В роли среды анодной камеры использовали модельную сточную воду следующего минерального состава (мг/л): NaHCO3 – 480; NH4Cl – 95.5; K2HPO4 · 3H2O – 146.7; KH2PO4 – 52.5; CaCl2 · · 2H2O – 63.1; MgSO4 · 7H2O – 19.2 [23]. В качестве источника углерода и энергии применяли пептон (1 г/л).

Клетки S. oneidensis MR-1 выращивали на питательном агаре. Трехсуточную культуру смывали минеральной основой среды, дважды отмывали той же средой и вносили в анодные камеры.

Детали МТЭ, контактирующие с содержимым камер, стерилизовали автоклавированием. В роли биологического агента в камеры, заполненные стерильной средой, вносили S. oneidensis MR-1 либо в виде суспензии с конечной концентрацией в анодной камере 2 × 107 кл./мл, либо предварительно адсорбционно иммобилизованными на поверхности анода из НТМ-200М в среде минеральной основы используемой модельной сточной воды. Количество адсорбированных на аноде клеток учитывали по убыли их титра в среде для иммобилизации. Обеспечивали равенство биомассы клеток, вносимых в анодные камеры в суспендированном и адсорбированном виде.

Инкубирование МТЭ велось на орбитальных качалках Biosan Multi Shaker Psu 20i (“Biosan”, Латвия) при 60 об./мин при 25°С.

Для приложения внешней разности потенциалов использовали ионисторы Maxwell BCAP0350 E270 T11 (“Maxwell”, Китай) емкостью 350 Ф, отличающиеся низким током саморазряда 0.3 мА и предварительно заряженные до напряжения 1.2 В.

Измерение оптической плотности выполняли на спектрофотометре Leki SS2107 (“LEKI Instruments”, Финляндия) в спектрофотометрических кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм при длинах волн 590 нм (кристаллический фиолетовый) или 480 нм (конго красный). Регистрацию оптических спектров поглощения проводили с использованием программного обеспечения Leki ScanPro.

Использовали красители кристаллический фиолетовый и конго красный (АО “Вектон”, Россия), ЧДА.

Для осаждения клеток применяли центрифугу РС-6МЦ (“Dastan”, Киргизия).

Измерение разности потенциалов выполняли при помощи прецизионного цифрового мультиметра Актаком АММ-1139 (ЗАО НПП “Эликс”, Россия).

Выделение тотальной ДНК из чистых культур бактерий осуществляли набором diaGene 3318 (“Диаэм”, Россия). Для проведения амплификации применяли набор БиоМастер HS-Taq ПЦР-Color (2х) (“Биолабмикс”, Россия). ПЦР осуществляли в амплификаторе Authorized Thermal Cycler (“Eppendorf”, Германия). Использовали вырожденные праймеры для широкого круга бактериальных обесцвечивающих красители пероксидаз, прямой 5'-GAYCTGTGCTTYGARCTSGC-3', обратный 5'-ASCCGATRAARTASGTGCC-3' [24] (“Синтол”, Россия). Продукты ПЦР визуализировали при проведении электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Применяли ДНК-маркер “Sky-High” (ООО “Биолабмикс”, Россия).

Статистическую обработку полученных данных осуществляли методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента, а также U-критерия Манна–Уитни. Достоверным считали различие при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для штамма S. oneidensis MR-1 в ходе предварительных экспериментов была обнаружена способность к обесцвечиванию водных растворов кристаллического фиолетового и ряда других красителей в анаэробных условиях анодной камеры МТЭ. При помощи вырожденных праймеров, позволяющих выявлять широкий круг бактериальных генов пероксидаз класса DyP (обесцвечивающие красители пероксидазы), у используемой культуры S. oneidensis MR-1 было обнаружено присутствие возможного гомолога данного гена с характерным размером ампликона порядка 400 н.п. [24]. В случае примененного в качестве отрицательного контроля штамма E. coli М17 продукты отсутствовали, обнаруживаясь при использовании штамма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д, который использовали как положительный контроль. Штамм R. erythropolis ВКМ Ас-2017Д известен значительной деструктивной активностью в отношении широкого круга углеводородных субстратов и применением в экологической биотехнологии [25, 26].

МТЭ перед внесением обесцвечиваемого субстрата выдерживали в течение трех сут для выравнивания в анодных камерах разных ячеек условий, о чем судили по сходным значениям разностей потенциалов между анодом и катодом, формируемых электрогенной культурой S. oneidensis MR-1. После этого к аноду и катоду подключали один из трех вариантов внешних электрических цепей: пассивное сопротивление (резистор 1КОм), заряженный до напряжения 1.2 В ионистор с прямой полярностью подключения (отрицательный полюс подключен к аноду МТЭ), либо аналогичный ионистор с обратной полярностью подключения (положительный полюс к аноду). Ионисторы выступали в качестве источника тока и напряжения. При отсутствии резистора или ионистора цепь считалась разомкнутой.

Для предупреждения осаждения клеток S. oneidensis MR-1 на дно анодных камер и для оптимизации массопереноса МТЭ размещали на движущейся платформе орбитального шейкера при температуре 25°С и 100 об./мин. Каждый эксперимент проводили в трех повторностях.

В анодные камеры вносили концентрированный раствор одного из красителей – кристаллического фиолетового или конго красного до конечной концентрации 2.5 мг/л, фиксируя динамику оптической плотности при длине волны, соответствующей максимуму поглощения водного раствора данного красителя. По истечении 1 сут инкубации краситель вносили повторно, ступенчато увеличивая концентрацию на 7.5 мг/л в сут (расчетные концентрации 2.5, 10.0 и 17.5 мг/л), периодически фиксируя оптическую плотность. Такая схема эксперимента была сформирована для возможности оценки зависимости удельной скорости обесцвечивания красителя, а также и от концентрации данного субстрата.

После 3 сут инкубации в холостом режиме, начиная с момента первого внесения красителей, дополнительно фиксировали разности потенциалов между катодом и анодом. Для варианта “ионистор “–”” (ионистор с обратной полярностью подключения, то есть положительный полюс подключен к аноду, а отрицательный к катоду) приведены модули значений, для расположения графиков напряжения в положительной координатной полуплоскости. Полученные результаты показаны на рис. 1.

Рис. 1.

Динамика разности потенциалов между электродами биоэлектрохимических систем в ходе обесцвечивания кристаллического фиолетового суспендированными (а) и иммобилизованными (б) клетками S. oneidensis MR-1 в зависимости от условий электрической стимуляции внешней цепи: 1 – ионистор прямой полярности подключения; 2 – ионистор обратной полярности подключения, 3 – резистор 1 КОм, 4 – разомкнутая цепь.

При естественной поляризации иммобилизованные клетки давали небольшой прирост разности потенциалов по сравнению со свободными. Разница была значительной при наличии во внешней цепи резистора, замыкавшего цепь и снижавшего данный показатель. Колебания напряжения, заметные в случае разомкнутой цепи, совпадали со временем внесения красителя и могли быть связаны как со стрессовым воздействием субстрата на культуру, так и с повышением окислительно-восстановительного потенциала камеры из-за попадания в нее кислорода. Значительный интерес представлял график разряда ионисторов: при подключении отрицательным полюсом к катоду (“ионистор “–””) разряд происходил значительно быстрее по сравнению с прямой полярностью (“ионистор “+””), что было более выражено при условии иммобилизации клеток. Таким образом, наличие биологического агента, локализованного на границе раздела фаз электрод/жидкость, заметно увеличивало эффективность переноса электрического заряда при обратной полярности подключения.

Для исследования кинетических параметров обесцвечивания кристаллического фиолетового, после отбора проб через герметичные отводы и осаждения клеток в центрифуге, проводили оценку оптической плотности при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения красителей. Динамика оптической плотности, в соответствии с тремя внесениями красителя, имела ступенчатый характер (рис. 2). По скорости снижения показателя в течение 3 ч после каждого очередного добавления субстрата оценивали удельную скорость реакции. При использовании суспендированных клеток S. oneidensis MR-1 в эксперименте с кристаллическим фиолетовым имело место значительное влияние как наличия биологического агента, так и устройства внешней цепи, в разной степени влияющих на динамику обесцвечивания субстрата. Некоторое снижение D590 в стерильном контроле, после первого внесения красителя до концентрации 2.5 мг/л, могло быть связано с адсорбцией красителя на развитой поверхности войлока НТМ-200М. После второго и последующего внесения дальнейшего уменьшения D590 в условиях стерильной среды практически не происходило. Необходимо отметить более выраженную интенсивность обесцвечивания при использовании суспендированных клеток и применении во внешней цепи ионистора, поднимающего разность потенциалов между анодом и катодом до 1.2 В, с соблюдением естественной полярности, формирующейся в МТЭ.

Рис. 2.

Динамика изменения D590 раствора кристаллического фиолетового при ступенчатом внесении в анодную камеру МТЭ в присутствии суспендированных (а) и иммобилизованных на аноде (б) клеток S. oneidensis MR-1, в зависимости от условий электрической стимуляции внешней цепи биоэлектрохимической системы: 1 – ионистор прямой полярности подключения, 2 – ионистор обратной полярности подключения, 3 – резистор 1 КОм, 4 – разомкнутая цепь, 5 – контроль.

На рис. 2б показана динамика снижения D590 раствора кристаллического фиолетового при ступенчатом внесении в анодную камеру МТЭ в зависимости от внешней цепи в том случае, когда на аноде были предварительно адсорбционно иммобилизованы клетки S. oneidensis MR-1.

Локализация клеток S. oneidensis MR-1 на границе раздела анод/среда значительно влияла на динамику обесцвечивания вносимого поэтапно красителя, что иллюстрировалось более интенсивным снижением показателя при использовании иммобилизованных клеток в течение первых 4 ч после каждого очередного добавления кристаллического фиолетового, относительно последующих 20 ч инкубации, до следующего цикла повышения концентрации.

Для оценки зависимости кинетических параметров обесцвечивания кристаллического фиолетового от режима внешней электрической цепи были построены графики зависимости удельной скорости реакции от концентрации красителя для всех вариантов цепей (резистор, подключенные прямой и обратной полярностью ионисторы, разомкнутая цепь) и локализации клеток (суспендированные либо иммобилизованные на аноде). Поскольку наибольшая интенсивность обесцвечивания имела место в первые 4 ч после внесения субстрата, этот диапазон представлял наибольший интерес как с теоретической, так и с практической (проточные системы очистки) точки зрения. Результаты приведены на рис. 3.

Рис. 3.

Удельная скорость обесцвечивания кристаллического фиолетового суспендированными (а) и иммобилизованными на аноде (б) клетками S. oneidensis MR-1 в зависимости от условий электрической стимуляции внешней цепи биоэлектрохимической системы и концентрации красителя: 1 – ионистор прямой полярности подключения, 2 – ионистор обратной полярности подключения, 3 – резистор 1 КОм, 4 – разомкнутая цепь.

Локализация клеток в наиболее электрохимически активной зоне на поверхности анода, значительно влияла на зависимость кинетики обесцвечивания трифенилметанового красителя от концентрации субстрата. В случае суспензии клеток при достижении концентрации субстрата около 20 мкМ, наблюдалось устойчивое снижение удельной скорости реакции для всех вариантов внешних цепей. При этом приложение внешнего источника тока и разности потенциалов в соответствии с полярностью микробных топливных элементов, где отрицательно заряженный электрод – анод в МТЭ выполнял функцию приема электронов, обеспечило почти двукратное повышение максимальной скорости по сравнению с остальными вариантами. Максимальная скорость в этом случае достигала 2.05 ± 0.07 мкМ/ч, при разомкнутой цепи – 1.30 ± 0.08, использовании ионистора с обратной полярностью – 0.83 ± 0.04, резистора – 1.10 ± 0.07 мкМ/ч. В случае адсорбированных клеток в этом же диапазоне концентраций субстрата снижение удельной скорости обесцвечивания не происходило, показатели достигали для трех вариантов (разомкнутая цепь, ионистор с прямой полярностью подключения, резистор) близких значений – 2.78 ± 0.05 – 2.91 ± 0.09 мкМ/ч. В случае ионистора с обратной полярностью обнаружено низкое значение скорости – 2.09 ± 0.05 мкМ/ч.

Для проверки гипотезы влияния принудительной поляризации на биоэлектрохимические процессы обесцвечивания красителей был поставлен аналогичный эксперимент с азокрасителем конго красным, существенно отличающимся по строению молекулы. Для суспензионных клеток S. oneidensis MR-1 была построена зависимость удельной скорости обесцвечивания данного красителя от концентрации субстрата при условиях внешней цепи, аналогично предыдущему эксперименту с кристаллическим фиолетовым (рис. 4).

Рис. 4.

Зависимость удельной скорости обесцвечивания (мкМ/ч) конго красного клетками S. oneidensis MR-1 от условий электрической стимуляции внешней цепи биоэлектрохимической системы и концентрации красителя: 1 – ионистор прямой полярности подключения, 2 – ионистор обратной полярности подключения, 3 – резистор 1 КОм, 4 – разомкнутая цепь.

При сходных показателях резистора, положительно подключенного ионистора и разомкнутой цепи, вариант опыта с подключенным отрицательной полярностью ионистором отличался минимальными показателями удельной скорости, что соответствовало результатам предыдущего эксперимента с кристаллическим фиолетовым. Сходство показателей удельной скорости обесцвечивания с применением резистора, положительно подключенного ионистора и разомкнутой цепи, целесообразно связать с общей низкой скоростью обесцвечивания данного красителя используемой культурой. Максимальный показатель не превышал 0.3 мкМ/ч, что практически на порядок меньше скоростей обесцвечивания кристаллического фиолетового.

Известно, что N-деметилирование и расщепление сопряженной хромофорной структуры являются наиболее распространенными путями биологической деградации трифенилметановых красителей [27–29]. Для общей оценки возможного изменения состава продуктов распада кристаллического фиолетового, после проведения эксперимента с обесцвечиванием, дополнительно были проанализированы оптические спектры поглощения, в области максимума поглощения исследуемого вещества в диапазоне длин волн от 330 до 830 нм. В качестве образца сравнения использовали дистиллированную воду, среда без добавления красителя в данной области не имела выраженных полос поглощения. Спектральные кривые для всех экспериментальных вариантов с суспензионными клетками S. oneidensis MR-1, а также для контроля, приведены на рис. 5.

Рис. 5.

Спектры поглощения продуктов разложения кристаллического фиолетового культурой S. oneidensis MR-1 в зависимости от условий электрической стимуляции внешней цепи биоэлектрохимической системы: 1 – ионистор прямой полярности подключения, 2 – ионистор обратной полярности подключения, 3 – резистор 1 КОм, 4 – разомкнутая цепь, 5 – контроль.

Для всех экспериментальных вариантов характерно значительное снижение интенсивности главного пика поглощения красителя, соответствующего полосе 590 нм. При этом обращает на себя внимание отсутствие или относительно малые (в пределах 5–10 нм) гипсохромные сдвиги основной полосы с максимумом поглощения 590 нм и коротковолнового плеча, даже при высоких степенях разложения. Для резистора 1 КОм основная полоса находилась на 585 нм, “ионистор “+”” – 580 нм, “ионистор “–”” – 590 нм, разомкнутая цепь – 585 нм. В то же время в работе [30], в которой были изучены спектры кристаллического фиолетового после воздействия пероксидазы класса DyP (обесцвечивающей краситель пероксидазы) из Bacillus amyloliquefaciens, был показан сдвиг основного пика и коротковолнового плеча в коротковолновую область, составляющий десятки нанометров, до значения 547.5 нм. Это было интерпретировано как признак разрушения сопряженной хромофорной структуры и удаления электронодонорной группы, на что также указано в работах других авторов [31, 32]. Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о более полном процессе деградации красителя до не поглощающих в данном спектральном диапазоне соединений.

Отмечено сохранение полос поглощения в коротковолновой области, что может быть связано с накоплением продуктов распада кристаллического фиолетового, основная полоса поглощения которого находится при 590 нм, а также иных микробных метаболитов. При этом, для большинства экспериментальных вариантов основной максимум поглощения приходился на 340–345 нм (в контроле – 340 нм), в то время как вариант “ионистор “+”” показал появление нового максимума поглощения в коротковолновой области, в районе 360 нм при сохранении заметного плеча на 340 нм. Известно, что продуктами распада кристаллического фиолетового могут быть N,N-диметил-N',N'-диметил-N"-метилпарарозанилин, N,N-диметил-N',N'-диметилпарарозанилин, N,N-диметилпарарозанилин, N-метилпарарозанилин, 4,4'-бис(диметиламино)бензофенон (кетон Михлера), 4-(N-метиламино)-4'-(N'-метиламино)бензофенон, 4-(N-метиламино)-4'-аминобензофенон, N, N-диметиланилин, бензохинон) [30], причем для Shewanella наиболее характерными являются N,N-диметиламинобензальдегид и кетон Михлера [33].

Таким образом, различия в расположении полос поглощения продуктов обесцвечивания кристаллического фиолетового чистой культурой S. oneidensis MR-1 указывают не только на количественные, но и качественные изменения процесса в разных биоэлектрохимических условиях, наиболее выраженных при стимулировании внешним источником слабого электрического поля и напряжения, подключенного в соответствии с естественной полярностью микробного топливного элемента, выступающего в качестве реактора. Эффект стимулирования или ингибирования обесцвечивания проявлялся в условиях низкого окислительно-восстановительного потенциала анодной камеры биоэлектрохимической системы. За счет естественной поляризации поверхности электродов (разомкнутая цепь и резистор 1 КОм) или, что более выражено, при положительной стимуляции ионистором прямого подключения, могло происходить ускорение процесса N-деметилирования, расщепление одного из ароматических колец и иных ключевых реакций обесцвечивания. Данные реакции могут быть связаны с потоком восстановительных эквивалентов, передаваемых шеванеллой вовне цитохромами наружной мембраны, а также через переносчик рибофлавин в условиях наличия искусственного акцептора электронов – отрицательно заряженного анода. Напротив, при подключении ионистора с обратной полярностью данный эффект мог нивелироваться, так как анод имел противоположный знак заряда. Сопряжение реакций биодеградации красителей, электрогенеза (S. oneidensis MR-1) и возможных электрохимических процессов на аноде зависит, таким образом, от знака заряда внешнего источника тока и напряжения, подключенного к электродам биоэлектрохимической системы. Химизм реакции восстановления азосвязи, приводящей к обесцвечиванию азокрасителей в анаэробных условиях, упоминаемый в работе российских авторов [34], позволяет предположить связь экзоэлектрогенной активности S. оneidensis MR-1 с передачей энергии, поступающей в биоэлектрохимическую систему через внешнюю цепь от источника тока, что катализировало или ингибировало реакции восстановления азосвязей и обесцвечивание конго красного, в зависимости от полярности подключения. В исследовании Чао Ли с соавт. [35] восстановление и разрыв двойной связи между атомами азота, приводящие к обесцвечиванию конго красного, также связывали с электроактивными бактериальными биопленками на аноде микробного топливного элемента. Авторы констатировали ускорение обесцвечивания при замкнутой цепи по сравнению с разомкнутой. Это согласуется с положительным влиянием на обесцвечивание красителей интенсификации переноса заряда и иных электрохимических процессов на поверхности анода, в результате стимуляции внешним источником тока и напряжения, усиливающим естественную разность потенциалов между электродами.

Таким образом, при обесцвечивании трифенилметанового красителя кристаллического фиолетового и азокрасителя конго красного культурой S. oneidensis MR-1 в анаэробных условиях анодной камеры биоэлектрохимической системы было обнаружено влияние полярности подключения к электродам внешнего источника тока и напряжения. Увеличение удельной скорости реакции при ступенчатом повышении концентрации субстрата было отмечено для вариантов опыта, где происходила поляризация электродов, как естественная, до 0.59 В, за счет электрогенеза S. oneidensis MR-1, так и более выраженная искусственная – в условиях положительной стимуляции источником постоянного тока и напряжения 1.2 В прямого подключения (отрицательный полюс к аноду, положительный – к воздушному катоду). При обратном подключении источника напряжения положительным полюсом к аноду во всех случаях наблюдалось снижение удельной скорости обесцвечивания как для кристаллического фиолетового так и для конго красного, что сопровождалось повышенным расходом электрического заряда используемого в качестве источника тока и напряжения ионистора. Иммобилизация клеток на поверхности анода значительно усиливала скорость обесцвечивания кристаллического фиолетового по сравнению с суспендированными клетками, при этом, негативный эффект обратного подключения ионистора сохранялся. Таким образом, искусственная внешняя поляризация электродов биоэлектрохимической системы позволяла как положительно, так и отрицательно влиять на осуществляемые электрогенной культурой реакции, приводящие к обесцвечиванию красителей разных типов в анаэробной среде анодной камеры. Экзоэлектрогенная активность клеток S. oneidensis MR-1, способных к передаче заряда вовне, при помощи систем цитохромов и специальных клеточных структур, может обеспечивать сопряжение внешней электрической цепи и энергоемких биохимических процессов, происходящих в прилегающем объеме, в том числе восстановления и разрыва двойной связи между атомами азота в молекуле конго красного, N-деметилирования и расщепления сопряженной хромофорной структуры кристаллического фиолетового.

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда № 22-24-00401, https://rscf.ru/project/22-24-00401/.

Список литературы

  1. Дебабов В.Г. // Микробиология. 2008. Т. 77. № 2. С. 149–157.

  2. Решетилов А.Н. // Прикл. биохимия и микробиология. 2015. Т. 51. № 2. С. 268–274.

  3. Li W.-W., Yu H.-Q. // Biotechnol. Adv. 2015. V. 33. P. 1–12.

  4. Алферов С.В., Арляпов В.А., Алферов В.А., Решетилов А.Н. // Прикл. биохимия и микробиология. 2018. Т. 54. № 6. С. 637–643.

  5. Самков А.А., Волченко Н.Н., Худокормов А.А., Калашников А.А., Веселовская М.В. // Политематический сетевой электронный научный журн. Кубанского государственного аграрного университета. 2014. № 101. С. 496–510.

  6. Idris M.O., Kim H.-C., Yaqoob A.A., Ibrahim M.N.M. // Sust. Energy Technol. Assess. 2022. V. 52. B. 102183.

  7. Obileke Ke C., Onyeaka H., Meyer E.L., Nwoko N. // Electrochem. Commun. 2021. V. 125. P. 1–14.

  8. Wang X., Hu J., Chen Q., Zhang P., Wu L., Li J. et al. // Water Res. 2019. V. 156. P. 125–135.

  9. Zhi Z., Pan Y.,Lu X., Wang J., Zhen G. // Sci. Total Environ. 2022. V. 814.https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2021.152736

  10. Wang X., Wan G., Shi L., Gao X., Zhang X., Li X., Zhao J., Sha B., Huang Z. // Environ. Sci. Pollut. Res. 2019. V. 26. P. 31449–31462. https://doi.org/10.1007/s11356-019-05670-5

  11. Воейкова Т.А., Емельянова Л.К., Новикова Л.М., Мордкович Н.Н., Шакулов Р.С., Дебабов В.Г. // Микробиология. 2012. Т. 81. № 3. С. 339–344.

  12. Воейкова Т.А., Емельянова Л.К., Новикова Л.М., Шакулов Р.С., Сидорук К.В., Смирнов И.А. и др. // Микробиология. 2013. Т. 82. № 4. С. 402–407.

  13. Хмелевцова Л.Е., Сазыкин И.С., Ажогина Т.Н., Сазыкина М.А. // Прикл. биохимия и микробиология. 2020. Т. 56. № 4. С. 327–335.

  14. Yang C., Zhang J., Zhang B., Liu D., Jia J., Li F., Song H. // Synth. Syst. Biotechnol. 2022. V. 7. P. 918–927.

  15. Hong Y., Guo J., Xu Z., Mo C., Xu M., Sun G. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 75. P. 647–654.

  16. Xiao X., Xu C.-C., Wu Y.-M., Cai P.-J., Li W.-W., Du D.-L., Yu H.-Q. // Bioresour. Technol. 2012. V. 110. P. 86–90.

  17. Lizárraga W.C., Mormontoy C.G., Calla H., Castaneda M., Taira M., Garcia R., Marín C., Abanto M., Ramirez P. // Biotechnol. Rep. 2022. V. 33. P. 1–7.

  18. Shi J., Zhao S., Yu X., Zhou T., Khan A., Yu Z., Feng P., Wang J., Liu P., LiX. // Int. J. Hydrog. Energy. 2019. V. 44. P. 10091–10101.

  19. Ivanova E.P. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 1773–1788.

  20. Bose S., Hochell M.F. Jr., Gorby Y.A., Kennedy D.W., McCready D.E., Madden A.S., Lower B.H. // Geochim. Cosmochim. Acta. 2009. V. 73. P. 962–976.

  21. Фалина И.В., Самков А.А., Волченко Н.Н. // Наука Кубани. 2017. № 2. С. 4–11.

  22. Berezina N.P., Timofeev S.V., Kononenko // J. Membr. Sci. 2002. V. 209. P. 509–518.

  23. Jadhav G.S., Ghangrekar M.M. // Bioresour. Technol. 2009. V. 100. P. 717–723.

  24. Tian J.-H., Pourcher A.-M., Klingelschmitt F., Le Roux S., Peu P. // J. Microbiol. Methods. 2016. V. 130. P. 148–153.

  25. Самков А.А., Джимак С.С., Барышев М.Г., Волченко Н.Н., Худокормов А.А., Самкова С.М., Карасева Э.В. // Биофизика. 2015. Т. 60. № 1. С. 136–142.

  26. Самков А.А., Волченко Н.Н., Худокормов А.А., Самкова С.М., Карасева Э.В. // Теоретическая и прикладная экология. 2021. № 1. С. 194–202.

  27. Chhabra M., Mishra S., Sreekrishnan T.R. // J. Biotechnol. 2009. V. 143. P. 69–78.

  28. Singh R., Eltis L.D. // Arch. Biochem. Biophys. 2015. V. 574. P. 56–65.

  29. Lončar N., Colpa D.I., Fraaije M.W. // Tetrahedron. 2016. V. 72. P. 7276–7281.

  30. Zhang Y., Ren J., Wang Q., Wang S., Li S., Li H. // Biochem. Eng. J. 2021. V. 168. P. 1–8.

  31. Kalyani D.C., Patil P.S., Jadhav J.P., Govindwar S.P. // Bioresour. Technol. 2008. V. 99. P. 4635–4641.

  32. Sathishkumar P., Balan K. Palvannan T., Kamala–Kannan S., Oh B.-T., Rodríguez–Couto S. // Clean (Weinh). 2013. V. 41. P. 665–672.

  33. Chen C.-H., Chang C.-F., Ho C.-H., Tsai T.-L., Liu S.-M. // Chemosphere. 2008. V. 72. P. 1712–1720.

  34. Емашова Н.А., Котова И.Б., Нетрусов А.И., Калюжный С.В. // Прикл. биохимия и микробиология. 2009. Т. 45. С. 195–201.

  35. Li C., Luo M., Zhou S., He H., Cao J., Luo J., Fang F. // Int. J. Hydrog. Energy. 2020. V. 45. P. 29417–29429.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал