Высокомолекулярные соединения (серия Б), 2021, T. 63, № 5, стр. 345-353

ВВЕДЕНИЕ

Разработка новых функциональных материалов с использованием экологически чистых методов их получения является устойчивым направлением развития материаловедения. Применение “зеленых” подходов для синтеза полимеров и их переработки важно при создании высокотехнологичных материалов биомедицинского назначения, например матриксов для тканевой инженерии. Имплантируемые биодеградируемые материалы служат временным “каркасом” для адгезии и роста клеток, и в дальнейшем должны замещаться здоровыми тканями. При их разработке важно обеспечить заданную структуру и свойства матрикса, а также максимально исключить потенциально токсичные компоненты [1].

Полимеры природного происхождения широко используют при создании таких матриксов, поскольку они способны к биодеградации, биосовместимы и обладают биоактивными свойствами [2]. Хитозан, продукт деацетилирования полисахарида хитина, является одним из наиболее перспективных природных полимеров для создания подобных материалов [3–6]. Одним из удобных методов получения биоактивных материалов на основе хитозана традиционно служит сублимационная сушка с получением макропористых гидрогелей, которые обеспечивают контролируемую скорость биодеградации, способны аккумулировать в порах различные добавки, организуя их целевую доставку и пролонгированное выделение; такие материалы находят широкое применение в биомедицине [7–10]. При их получении также можно использовать композиты, которые обычно приготавливают смешением компонентов в гетерогенных условиях, поскольку при комбинировании природных и синтетических макромолекул поиск совместных растворителей всегда сложен [11, 12].

При использовании пористых губок для культивирования клеточных культур необходимо переводить их в не растворимую в водных средах форму. Наиболее простым способом для хитозансодержащих материалов служит термическая обработка [13, 14]. В литературе описаны также различные способы получения устойчивых гидрогелей, которые основаны на ионных взаимодействиях или использовании сшивающих агентов. В первом случае гидрогели получаются нестабильными в средах с высокой ионной силой, а применение сшивающих агентов не всегда безопасно с точки зрения цитосовместимости и требует оптимизации условий сшивания [10, 15, 16]. Для получения хитозансодержащих гидрогелей с заданной архитектурой используют лазерные подходы, основанные на регулярном характере сшивания фоточувствительных композиций [17–19].

Один из важных факторов успешного применения хитозана в материалах биомедицинского назначения – контроль над структурой его макромолекул. Даже “базовые” характеристики хитозана (молекулярная масса и степень деацетилирования) влияют на многие его свойства: от скорости биодеградации и биологических функций до деформационно-прочностного поведения материалов на его основе [20, 21]. Направленное модифицирование химической структуры хитозана открывает ряд новых возможностей как с точки зрения технологий, доступных для формования хитозансодержащих материалов, так и для достижения требуемых свойств.

Основными реакционными центрами при модифицировании хитозана являются его аминные и гидроксильные группы, а в качестве функциональных заместителей используют сульфо-, карбоксиметил-, аллил-, сукцинил- и другие группы [22–25]. Синтез сополимеров хитозана позволяет кардинально менять свойства материалов, а диапазон привитых на хитозан фрагментов также очень широк: полианилин, полиакрилонитрил, полилактид, полиэтиленоксид, поликапролактон и т.д. [26–29]. Но наиболее часто при получении сополимеров хитозана в качестве второго компонента выбирают олиго- или полилактиды. Вызвано это тем, что сложные полиэфиры, в частности полилактид, находят широкое применение в медицине в качестве рассасывающихся шовных материалов, штифтов, имплантов и матриксов для тканевой инженерии [30–32]. Продукты гидролиза полилактида (молочная кислота) не токсичны, а при использовании с хитозаном в одном материале понижается риск воспалительных реакций при разложении в организме [33]. Но основная функция хитозана в таких материалах – повышение их биосовместимости, поскольку гидрофобность полилактида и относительно низкая совместимость с клетками/тканями лимитируют его применение в медицине [34]. Хитозан может быть наполнителем в смесевых композициях с полилактидом или выступать в качестве биоактивного покрытия при нанесении на поверхность материала [35, 36]. Но более эффективный подход для достижения оптимальных свойств материалов на основе полилактида и хитозана основан на синтезе их привитых сополимеров, содержащих фрагменты олиго/полилактида в боковых цепях хитозана. Было выявлено, что подобная модификация хитозана значительно влияет на морфологию и свойства полученных макропористых гидрогелей: распределение пор становится более широким по сравнению с образцами на основе немодифицированного хитозана; коэффициент набухания уменьшается при увеличении количества гидрофобных боковых цепей в привитых сополимерах; становится возможным контроль биодеградации материалов, содержащих привитые фрагменты лактидов [37]. Однако использование расплавных технологий для получения сополимеров хитозана с полилактидом малоэффективно [38], а проведение сополимеризации с использованием растворных технологий требует нескольких синтетических этапов и сложной очистки вследствие применения катализаторов и токсичных растворителей. Также при проведении синтеза в растворе сложно обеспечить достаточную степень полимеризации привитых цепей и высокую производительность процессов [37, 39]. Механохимический подход к синтезу сополимеров хитозана, содержащих привитые фрагменты олиго/полилактида различной длины, отличается простотой проведения процесса и возможностью исключения растворителей и катализаторов, что благоприятно для экологии и для безопасности последующего применения материалов в медицине. Этот способ позволяет достигать высокой степени прививки олиго-/полимеров лактида на хитозан и варьировать гидрофильно/липофильные свойства сополимеров за счет изменения степени полимеризации привитой цепи [40–42]. Значительным преимуществом механохимического подхода является возможность введения непосредственно в процессе сополимеризации дополнительных компонентов, например белков и, таким образом, получения многокомпонентных амфифильных систем с улучшенной биосовместимостью [42, 43].

В настоящей работе использованы полученные механохимическим способом композиции на основе привитых сополимеров хитозана с олиголактидами, в том числе содержащие коллаген, для создания макропористых губок методом сублимационной сушки. Было оценено влияние характеристик исходного хитозана и химической структуры сополимеров на морфологию и свойства получаемых материалов. Для снижения растворимости материалов при последующем использовании в качестве матриксов для тканевой инженерии применяли термическую обработку, которая не требует вовлечения в процесс дополнительных компонентов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали коммерческий хитозан (Х-350) (“Сонат”, Россия) с М = 35 × 10⁴ и степенью деацетилирования 0.86, а также хитозан, обозначенный как Х-80, с М = 8 × 10⁴ и степенью деацетилирования 0.89, полученный методом твердофазного деацетилирования, как описано в работе [44]. Сополимеры хитозана с олиголактидами и системы, дополнительно содержащие коллаген, были получены методом твердофазного реакционного смешения и охарактеризованы ранее [42, 45]. Основные условия получения сополимеров и их обозначения приведены в табл. 1. Реакционное смешение компонентов проводили в двухшнековом опытно-промышленном экструдере марки “Berstrorff” с диаметром шнеков 40 мм, оснащенном силовыми элементами, обеспечивающими высокую диспергирующую способность и возможность проведения механохимических реакций в условиях сдвиговых деформаций [44]. В ходе исследования варьировали состав исходных смесей; температура соэкструзии составляла 55°С. Продукты реакционного смешения фракционировали и исследовали методами ИК-, УФ-спектроскопии и динамического лазерного светорассеяния [42, 45]. Химическая структура привитых сополимеров хитозана с олиголактидами приведена ниже.

(СА – степень ацетилирования, СД – степень деацетилирования, СЗ – степень замещения, СП – степень прививки).

Пленки формовали методом полива расчетного количества 1%-ного раствора полимеров в 2%-ной уксусной кислоте на полистирольные чашки Петри диаметром 9 см для получения пленок толщиной 30 мкм, сушили при комнатной температуре испарением растворителя в беспылевом шкафу (∼2 суток). Макропористые гидрогели получали замораживанием 2%-ных растворов полимеров в 4%-ной CH₃COOH при –15°С с последующей сушкой под вакуумом из замороженного состояния (лиофильно). Для перевода пленок и макропористых губок в нерастворимую форму их прогревали в термошкафу при 150°С в течение 5 ч. Полученные материалы очищали от несшитых фрагментов дистиллированной водой в течение 2 ч с постоянной сменой воды. Далее пленки сушили в беспылевом шкафу, а губки замораживали при –15°С и сушили лиофильно.

Спектры поглощения пленок из образцов хитозана и его сополимеров с олиголактидами до и после термообработки регистрировали на спектрофотометре “Shimadzu UV 2501 PC” (“Shimadzu”, Япония).

Не растворимую в воде фракцию пленок и макропористых губок рассчитывали по формуле

в которой ${{W}_{h}}\,{\text{и}}\,{{W}_{p}}$ – вес губок после нагревания и после очистки соответственно.

Эксперимент повторяли 3–5 раз, данные рассчитывали как среднее значение со среднеквадратичным отклонением.

Степень набухания пленок и влагопоглощения макропористых гидрогелей α (%) находили по данным гравиметрии:

где m – навеска полимера после набухания/влагопоглощения, m_o – навеска полимера до набухания/влагопоглощения. Для этого образцы инкубировали в дистиллированной воде в течение 3 ч, после чего избыток воды удаляли фильтровальной бумагой, а образцы взвешивали.

Морфологию пленок исследовали методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на приборе “PhenomProX” (“PhenomWorld”, Нидерланды). Морфологию срезов макропористых гидрогелей оценивали по СЭМ-микрофотографиям путем их анализа с помощью программы ImageJ (версия 1.52).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно опубликованным ранее данным, при твердофазном реакционном смешении хитозана с олиго/полиэфирами реакция протекает преимущественно по пути аминолиза сложноэфирных групп аминогруппами хитозана [41]. Это определяет достаточно широкий набор сополимеров, различающихся количеством и длиной привитых цепей в рамках одного образца, что в свою очередь влияет на их свойства, в том числе на растворимость в кислых водных средах – традиционных для хитозана растворителях. Прививка на хитозан гидрофобных фрагментов олиголактида приводит к понижению его растворимости в водных средах, а содержание нерастворимой фракции определяется степенью прививки и характеристиками исходного хитозана: чем выше ММ основной цепи, тем выше растворимость сополимеров даже при более высокой степени прививки фрагментов олиголактида (табл. 1). Характеристики полученных сополимеров, в том числе стереохимический состав привитых цепей влияют на растворимость сополимеров и структурирование их макромолекул в растворах, что в свою очередь определяет структуру и свойства образующихся материалов [45, 46].

Исследование влияния химической структуры сополимеров на морфологию и свойства материалов на их основе на начальном этапе проводили на пленочных образцах. На рис. 1 приведены СЭМ-изображения поверхности пленок из немодифицированных образцов хитозана и их сополимеров с олиголактидами до их термообработки. Образцы на основе хитозана Х-80 и Х-350, а также образец на основе сополимера, содержащего фрагменты аморфного олиго(L,D-лактида) (ХЛД-80), имеют гомогенную структуру, в то время как пленки из сополимерных образцов ХЛЛ-80, ХЛЛ-350 и ХЛЛ-350-К обладают ярко выраженной гетерогенностью, что, вероятно, связано с межмолекулярными взаимодействиями привитых боковых цепей и образованием крупных доменов при испарении растворителя и увеличении концентрации. Введение дополнительного компонента (коллагена) увеличивает неоднородность пленочных материалов.

Термическая обработка пленочных образцов для их перевода в не растворимую в воде форму привела к изменению морфологии поверхности, которая стала более гомогенной. Особенно это выражено для образцов на основе хитозана с относительно низкой ММ (Х-80). Поскольку меньшая ММ хитозановых цепей должна обеспечивать их большую подвижность в термопластичной полимерной матрице при нагреве, вероятно, наблюдаемый эффект связан с плавлением доменов олигоэфира, приводящим к перераспределению сетки зацеплений (рис. 2).

Термическая обработка, согласно работе [14], может приводить к повышению водостойкости, потере растворимости и увеличению прочности пленок из хитозана. Обусловлено это несколькими возможными процессами, протекающими во время прогревания материалов из хитозана в солевой форме: разложение солей, ацилирование аминогрупп выделяющимися кислотами, изменение степени кристалличности образцов, а также образование сшитых структур в ходе термоокислительной деструкции полимерных цепей. Авторы работы [14] предполагают, что образование амидов хитозана является основной причиной потери растворимости, а факт протекания процессов ацилирования подтвержден результатами ИК-спектроскопии.

На рис. 3 представлены спектры электронного поглощения пленки из хитозана Х-350 и его сополимера ХЛЛ-350-К до и после термической обработки. Пленка образца ХЛЛ-350-К до прогревания демонстрирует более интенсивное рассеяние света по сравнению с пленкой из Х-350, что согласуется с данными о морфологии образцов, приведенными на микрофотографиях (рис. 1). В спектрах обеих пленок наблюдаются широкие слабые полосы поглощения в области 250–400 нм, которые обычно присутствуют в хитозане [45]. После прогревания обе пленки становятся оптически более однородными, в диапазоне длин волн 600–800 нм интегральный показатель рассеяния хорошо описывается зависимостью $1{\text{/}}{{\lambda }^{p}}$, где p = 4. В области длины волны менее 600 нм оптическая плотность возрастает в обеих пленках, что указывает на образование новых хромофорных групп. Характер таких хромофорных групп в образцах Х-350 и ХЛЛ-350-К одинаков. Вероятнее всего, хромофорные группы связаны с термоокислением и появлением системы сопряженных связей.

Данные оценки эффективности термической сшивки приведены на рис. 4. Наибольшее содержание не растворимой в воде фракции после прогревания (97–99%), отмечено для пленок с гомогенной структурой поверхности – Х-80, Х-350 и ХЛД-80. В пленочных образцах, содержащих домены аморфно-кристаллического олиго(L-лактида) ХЛЛ-80, ХЛЛ-350 и ХЛЛ-350-К (рис. 1), эффективность процессов сшивания несколько снижается (до ∼ 93 мас. % нерастворимой фракции).

Морфология макропористых гидрогелей из исследуемых образцов также зависит от характеристик исходных полимеров. На рис. 5 представлены СЭМ-микрофотографии срезов гидрогелей после прогревания и очистки от несшитых фрагментов. Эффективность термической сшивки гидрогелей совпадала с данными, полученными для пленочных образцов. Изучение их морфологии показало, что все губчатые образцы имеют развитую макропористую структуру, состоящую из системы взаимосвязанных пор с широким распределением по размерам. Средний размер пор составляет 108 ± 38, 111 ± 55, 147 ± 78, 119 ± 25, 102 ± 58 и 107 ± 42 мкм для образцов Х-80, ХЛД-80, ХЛЛ-80, Х-350, ХЛЛ-350 и ХЛЛ-350-К соответственно. Как видно, средний размер пор всех образцов практически одинаков, поскольку процесс формования макропористых гидрогелей проходил при одинаковых условиях (концентрация растворов, температура замораживания). Существенное отличие в структуре имеет только образец ХЛЛ-80 на основе низкомолекулярного хитозана, для которого характерен наибольший средний размер пор 147 ± 78 мкм и более широкое распределение пор по размерам. Вероятно, это связано с минимальной эффективностью сшивки, что приводит к высокому влагопоглощению при очистке образца от несшитых фрагментов, деформации и разрыву стенок пор при повторной сублимационной сушке. Образцы на основе высокомолекулярного хитозана Х-350 и его сополимеров имеют больше вторичных пор в составе первичных по сравнению с образцами на основе низкомолекулярного хитозана, что может быть следствием различной агрегации макромолекул в растворе и, значит, особенностей кристаллизации воды при замораживании растворов.

Исследование степени набухания пленок и влагопоглощения гидрогелей в воде показало (рис. 6), что образцы на основе исходного хитозана Х-80, Х-350, а также ХЛД-80, содержащего фрагменты аморфного олигомера лактида, имеют наименьшую степень влагопоглощения (4088 ± 37–4332 ± 16) мас. %). Образцы, содержащие фрагменты аморфно-кристаллического олиго(L-лактида) ХЛЛ-80, ХЛЛ-350, ХЛЛ-350-К, поглощают больше влаги (4949 ± 56 – 6049 ± 43 мас. %) по сравнению с образцом ХЛД-80, что хорошо согласуется с результатами оценки эффективности сшивки. В целом из рис. 6 следует, что в соответствии со структурой и морфологией материала макропористые гидрогели обладают на порядок большими величинами влагопоглощения по сравнению с пленочными материалами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование поверхности пленок методом сканирующей электронной микроскопии выявило заметное отличие в морфологии пленок из образцов немодифицированного хитозана и сополимеров, содержащих фрагменты аморфного или аморфно-кристаллического олигомера лактида. Гетерогенная морфология материалов на основе последнего из перечисленных подтверждена данными СЭМ и спектрофотометрии и приводит к снижению эффективности сшивания материалов при термической обработке и к более высокой степени влагопоглощения макропористых гидрогелей. В целом все исследованные образцы пригодны для получения стабильных в воде гидрогелей с системой взаимосвязанных пор и перспективных для применения в различных областях, в первую очередь в качестве материалов биомедицинского назначения.

Синтез, наработка материала и регистрация спектров поглощения выполнены при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема № 0086-2019-0007) с использованием научного оборудования Центра коллективного пользования “Центр исследования полимеров” Института синтетических полимерных материалов Российской академии наук.